Luận văn Nghiên cứu bacteriocin của vi khuẩn lactobacillus plantarum phân lập từ mẫu chao tại huế

vòng có chứa 3.308.274 cặp base, % GC của nhiễm sắc thể là 44,5% và các plasmid có % GC thấp hơn. L. plantarumWCFS1 có ba plasmid là pWCFS101, pWCFS102, và pWCFS103 với kích thước tương ứng là 1.917 bp, 2.365 bp và 36.069 bp. Trình tự gen trên nhiễm sắc thể có tính có tính đa dạng di truyền giúp vi khuẩn L. plantarum thích ứng với nhiều điều kiện môi trường khác nhau[39]. 1.1.2. Quá trình lên men lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường trong điều kiện kị khí với sản phẩm là axit lactic tích lũy trong môi trường. Quá trình này có thể tóm tắt theo phương trình sau: 6 Các loài vi khuẩn lactic khác nhau về cơ chế chuyển hóa glucozơ. Một vài loài vi khuẩn lactic trải qua quá trình đường phân trong điều kiện kị khí tạo axit lactic và nhóm này được gọi là lên men đồng hình. Một số nhóm khác ngoài axit lactic còn tạo ra rượu, CO2 và nhóm này được gọi là lên men dị hình [19,21]. 1.1.2.1. Lên men lactic đồng hình Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP (Embden - Meyerhof – Parnas Pathway) và tạo ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic (hơn 85%). Phương trình tóm tắt của quá trình lên men đồng hình như sau: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP GlucozơAxit lactic Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình thường gặp là Lactococus lactis, L.casei, L. delbrueckii,[19,21]. 1.1.2.2. Lên men lactic dị hình Ngoài axit lactic (chiếm đến 50%), quá trình lên men lactic dị hình còn có các sản phẩm phụ khác như etanol, axetat, CO2,. Phương trình tóm tắt của quá trình lên men dị hình như sau: C6H12O6CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + xKcal GlucozơAxit lactic Etanol Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình thường gặp là L. amylovorus, L. reuteri, L. manihotivorans,... [19,21]. 1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic. 1.1.3.1. Cacbonhydrat Cacbonhydrat là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng thiết yếu cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic. Ngoài ra, cacbon cũng có thể được lấy từ protein, axit aminvà glyxerol. Vi khuẩn lactic sử dụng được hầu hết các loại đường, song 7 glucozơ là nguồn cacbon thích hợp nhất và tùy từng loại LAB khác nhau mà nguồn cacbon phù hợp được lựa chọn. Chẳng hạn như L. acidophilus sinh trưởng mạnh hơn khi thay thế glucozơ bằng mantozơ, salicin, raffinozơ hoặc melibiozơ; L. fermentum sinh trưởng tốt nhất với nguồn cacbon là maltozơ; S. thermophilus phát triển mạnh trong môi trường có lactozơ, [21]. 1.1.3.2. Axit amin và peptit Nitơ ở dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho quá trình phát triển sinh khối của vi khuẩn lactic. Axit amin và peptit có thể thu nhận qua các hoạt động của enzym proteaza hoặc sự phân giải protein. Theo đó, các peptit sẽ được chuyển hóa thành các axit amin tự do và một số hợp chất khác. Quá trình sinh trưởng của LAB phụ thuộc vào nguồn cung cấp nitơ hữu cơ do vi khuẩn này ít có khả năng sinh tổng hợp axit amin từ nguồn nitơ vô cơ. Nhu cầu axit amin của LAB khác nhau tùy theo chủng, loài. Ví dụ, chỉ có 3 axit amin cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn L. plantarum trong khi L. acidophilus cần tới 14 axit amin [21]. 1.1.3.3. Vitamin Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic có thể phân chia thành 3 nhóm: vitamin thiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không thiết yếu. Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic có thể giảm từ 34 – 67% nếu không có các nhóm vitamin này trong môi trường dinh dưỡng. Trong đó, axit pantothenic (vitamin B5), axit riboflavin (vitamin B2) và axit nicotinic (vitamin B3 hay vitamin PP) là những loại vitamin rất cần thiết cho hầu hết các chủng LAB.Khi thiếu riboflavin, sự sinh trưởng L. plantarum bị ức chế hoàn toàn. Một số vitamin (chẳng hạn như vitamin H, vitamin C,) có thể là yếu tố kích thích cho sự tăng trưởng của một số chủng LAB nhưng lại không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của một số chủng LAB khác [21]. 1.1.3.4. Khoáng chất Các khoáng chất cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic là hỗn hợp chứa các ion như kali, natri, magiê, mangan, sắt, clo và photphat. Trong đó, Mn2+ có tác động tích cực đến sự phát triển và quá trình sản sinh ra axit lactic. Ngoài ra, Mg 2+ còn tham gia vào trung tâm hoạt động của một số enzym hoặc đóng vai trò hoạt hóa các enzym xúc tác trong quá trình lên men lactic, nhờ đó hỗ trợ vi khuẩn 8 sử dụng tốt hơn các loại đường. Mg2+ là khoáng chất thiết yếu cho sự phát triển của các vi khuẩn L. casei, L. lactis, L. delbrueckii, L. helveticus và L. acidophilus . Ngoài ra, nó đảm nhiệm chức năng là cofactor đối với nhiều enzym liên quan đến quá trình vận chuyển và trao đổi chất như fructokinaza, photphoketolaza và axetat kinaza [21]. 1.1.3.5. Nhiệt độ Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng, trải dài từ 15oC – 40 o C. Trong đó, 24 – 30oC là khoảng nhiệt độ tối ưu nhất cho sự phát triển của LAB cũng như quá trình lên men để tạo ra axit lactic. Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 40oC – 45oC được gọi là vi khuẩn ưa nhiệt; các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 20oC - 40oC được gọi là vi khuẩn ưa ấm. Những loài vi khuẩn lactic sống trong đường ruột của người và động vật hầu hết thuộc loại ưa ấm[50]. 1.1.3.6. pH Vi khuẩn lactic hoạt động trong dải pH rộng. Khả năng điều chỉnh pH trong tế bào chất là một trong những đặc điểm sinh lý quan trọng nhất giúp cho vi khuẩn này có khả năng chịu axit thấp hơn so với nhiều loài vi khuẩn khác. Đa số các vi khuẩn lactic có dải pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacilus); 6 – 6,5 (L. plantarum); 5,5 - 6,5 (Pediococcus) và 6,3 - 6,5 (Leuconostoc)[50]. 1.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic 1.2.1. Ứng dụng của vi khuẩn lactic nói chung Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, chế biến bảo quản thực phẩm, y học, để sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ đời sống. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, vi khuẩn này được sử dụng để lên men các sản phẩm từ sữa, từ thịt và tạo ra các phụ gia thực phẩm. Đáng kể nhất hiện nay là việc ứng dụng vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sinh học để phục vụ nông nghiệp, chống ô nhiễm và bảo vệ môi trường [36]. Trong quá trình lên men, ngoài axit lactic, vi khuẩn lactic còn sản sinh nhiều hoạt chất có giá trị như chất thơm, vitamin, bacteriocin, Do đó, chúng được sử dụng trong ủ chua thức ăn gia súc nhằm tăng hàm lượng dinh dưỡng và năng suất 9 trong chăn nuôi. Một số chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều nhất là L. plantarum, Leuconostoc mesenteroides [36]. 1.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn L. plantarum Rất nhiều ứng dụng gắn liền với L. plantarum trong quá trình sản xuất các chế phẩm probiotic đã được công bốtrên các tạp chí khoa học uy tín. Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng, vi khuẩn lactic nói chung và L. plantarum nói riêng có vai trò bảo vệ, tăng cường chức năng đường ruột và cải thiện các triệu chứng ruột kích thích. Ngoài ra, L. plantarum còn tác động tích cực đến hệ vi sinh vật trong đường ruột, quá trình chuyển hóa lipit và làm giảm hội chứng viêm[36]. Vi khuẩn L. plantarum có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin hiện diện tự nhiên trong nhiều nguồn thực phẩm khác nhau, do vậy nó góp phần cải thiện đặc tính cảm quan và đóng một vai trò thiết yếu trong việc kéo dài thời hạn sử dụng thực phẩm. Nhờ đó, những phương pháp xử lý vật lý sử dụng trong quá trình bảo quản thực phẩm có khả năng được giảm thiểu. Do vậy, L. plantarum đáp ứng các yêu cầu của người tiêu dùng trong việc sử dụng thực phẩm tươi sống và thực phẩm đóng gói chứa ít hàm lượng chất bảo quản. Trong lĩnh vực y học, các ứng dụng của L. plantarum được các nhà khoa học quan tâm nhờ khả năng bảo vệ bề mặt da và điều trị nhiễm trùng vết thương gây ra do bỏng [36]. Một ứng dụng khác của L. plantarum liên quan đến việc xử lý mùi phân của heo, đặc biệt là ở các trang trại lớn. Bình thường, chế độ ăn uống có thể giảm bớt mùi hôi này nhưng lại tốn kém và hạn chế khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng. Trong khi đó, việc bổ sung vi khuẩn L. plantarum vào chế độ ăn của heo, có hoặc không bổ sung insulinlàm giảm đáng kể mùi phân của heo mà không ảnh hưởng đến quá trình tiêu hóa thức ăn [36]. Nhờ khả năng ngăn chặn sự bám dính của E.coli vào màng nhầy, L. plantarum làm giảm hoạt động của nội độc tố do E.coli tiết ra, đồng thời đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra, L. plantarum cũng hỗ trợ tiêu hóa các chất xơ có trong lúa mì, lúa mạch đen, men bia, Do đó, những vấn đề tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng được cải thiện đáng kể. L. plantarum còn được chứng minh là có khả năng làm giảm cholesterol khi chúng hoạt động riêng lẻ hoặc kết hợp với Lactobacillus paracasei trong khẩu 10 phần ăn của chuột. Bên cạnh vai trò là giống khởi động trong quá trình lên men thực phẩm, vi khuẩn L. plantarum và bacteriocin của nó cũng được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm probiotic [18,36]. 1.3.Bacteriocin Công trình đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình của Gratia và cộng sự vào năm 1925. Họ đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của colicin V được sinh tổng hợp bởi E. coli. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin. Đó là một chất có khả năng gây chết nhiều vi sinh vật, có phổ hoạt động hẹp và phổ hoạt động này bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Các loài vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu về khả năng sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.; Listeria sp. và Staphylococcus sp. Số lượng công bố nghiên cứu về bacteriocin trong những năm 1980 đã có sự gia tăng đáng kể. Từ thời điểm này những nghiên cứu về bacteriocin với định hướng như một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm đã bắt đầu phát triển [15]. 1.3.1. Định nghĩa Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất peptit hoặc protein được tổng hợp theo con đường riboxom ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại các vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng. Bacteriocin không gây dị ứng và không gây hại cho sức khỏe con người (do nó bị phân hủy bởi proteinaza, lipaza ở đường ruột) [10]. 1.3.2. Phân loại Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin đã được xác định. Các bacteriocin rất đa dạng về cấu trúc và chức năng. Tuy nhiên, việc phân loại bacteriocin hiện vẫn chưa được rõ ràng và đang còn tranh cãi. Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau. Trong đó, phương pháp phân loại được chấp nhận và sử dụng phổ biến là dựa trên trọng lượng phân tử, cấu trúc và một số đặc tính của bacteriocin. Theo đó, bacteriocin được chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II lớp III và lớp IV. Bacteriocin lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều hơn hơn hai lớp còn lại [31]. 11 1.3.2.1. Lớp I Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptit nhỏ (< 5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một bacteriocin tiêu biểu và được nghiên cứu sâu của nhóm này là nisin. Các lantibiotic được chia thành 2 phân lớp là Ia, Ib dựa trên cấu trúc hóa học và phương thức hoạt động [31,47]. 1.3.2.2. Lớp II Lớp II còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng phân tử <10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine. Các bacteriocin lớp II có thể chia thành 3 phân lớp là IIa, IIb và IIc [31,47]. 1.3.2.3.Lớp III Lớp III bao gồm những peptit lớn, có trọng lượng phân tử > 30 kDa và không bền nhiệt. Hầu hết các bacteriocin lớp này được phân lập từ các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus. Đại diện cho lớp III là helveticin J được sản xuất bởi vi khuẩn L. helveticus 481, lactacin B được sản xuất bởi L. acidophilus [31,47]. 1.3.2.4. Lớp IV Hiện nay có rất ít nghiên cứu về lớp này. Một cách tổng quát, các bacteriocin lớp IV được định nghĩa là các bacteriocin phức tạp có chứa các nhóm chức lipit hoặc cacbonhydrat. Ví dụ về bacteriocin của lớp này là các glycoprotein (lactocin 27), lipoprotein (lacstrepcins),[31,47]. 1.3.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin Bacteriocin đóng vai trò như một hệ thống miễn dịch tự nhiên của vi khuẩn. Theo đó, các vi khuẩn Gram dương và Gram âm có thể sinh tổng hợp nhiều loại bacteriocin nhằm kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn khác. 12 Hình 1.1: Cơ chế hoạt động của bacteriocin [51] Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein hay peptit được tổng hợp theo con đường riboxom. Khi được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn sản xuất, bacteriocin có thể kết hợp với các thụ thể tương ứng trên bề mặt tế bào của các vi khuẩn nhạy cảm để tiêu diệt vi khuẩn. Các bacteriocin có thể tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào; nó cũng có thể đóng vai trò như một loại nucleazavới chức năng phân giải ADN, ARN hoặc tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào (Hình 1.1) [51]. 1.3.4. Đặc điểm của bacteriocin ở các nhóm vi khuẩn Bacteriocin được sinh tổng hợp ở cả vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm sau:  Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: Gồm nhiều loại khác nhau về kích thước, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch. Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có phổ kháng khuẩn hẹp hoặc có hoạt độ yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương [43].  Bacteirocin của vi khuẩn Gram dƣơng: Các bacteriocin này rất đa dạng. Tuy nhiên, quá trình sinh tổng hợp bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương không gây chết vi sinh vật chủ và quá trình này cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm [43]. 13 1.3.5. Các đặc tính của bacteriocin 1.3.5.1. Tính chất hóa học Bacteriocin có bản chất là protein, nhưng cũng có thể là hỗn hợp của protein với các chất khác. Các enzym đặc trưng như proteinaza, lipaza,được sử dụng để kiểm tra bản chất protein. Phân tích hóa học cho thấy, bacteriocin là loại protein đơn giản, có trọng lượng phân tử thấp. Tuy nhiên, bacteriocin đã được tinh sạch từmột số vi khuẩn như Staphylococcus, Clostridium và Lactobacillus cho thấy chúng là những phân tửphức tạp (ngoài cấu trúc protein chúng còn có thêm nhóm chức lipit hoặccacbonhydrat)[12,41]. 1.3.5.2. Tính chất vật lý Các đặc tính lý học về độ bền nhiệt, pH hoạt động và khả năng bị thủy phân bởi enzym của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic được thể hiện trong Bảng 1.1. Bảng 1.1: Độ bền nhiệt, pH và enzym thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic [22] Bacteriocin Độ bền nhiệt pH hoạt động Enzym thủy phân bacteriocin Megacin A-216 60 0C, 30 phút 2 – 7 Chymotrypsin, Pepsin, Trypsin Clostosin A 100 0C, 30 phút 4 – 9 Trypsin,Chymotrypsin, Dnaza, Pronaza P, Rnaza Clostosin B 80 0C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza, Pronaza P, Rnaza Clostosin C 80 0C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza, Pronaza P, Rnaza Clostosin D 100 0C, 30 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza, Pronaza P, Rnaza Boticin E-S5 100 0C, 10 phút 1,1 – 9,5 Trypsin, Chymotrypsin, Dnaza, Pepsin Bioticin P 60 0C, 30 phút 6,5 – 7,5 Trypsin, Rnaza, Alkalinphotphataza, Photpholipaza C, D Butyricin 7423 100 0C, 10 phút 2 – 12 Trypsin Perfringocin 11105 100 0 C, 30 phút 2 – 12 Trypsin 14 1.3.6. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic 1.3.6.1. Bacteriocin từ vi khuẩn lactic nói chung Ngày nay, các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu nhiều hơn do tính ưu việt của chúng trong bảo quản thực phẩm cũng như tính an toàn với người sử dụng như không độc với tế bào nhân chuẩn và ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong đường ruột. Thêm vào đó, bacteriocin hoạt động trong khoảng pH rộng, có khả năng chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, có cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính kháng chéo với các kháng sinh và thường được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền là các ưu điểm của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin[23,43]. Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh axit hữu cơ và bacteriocin kháng khuẩn, kháng nấm. Rất nhiều bacteriocin đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong bảo quản thực phẩm để chống lại các vi khuẩn tạp nhiễm như Listeria, Clostridia, Bacilli,[11]. Các bacteriocin phổ biến nhất do các chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp được tóm tắt trong Bảng 1.2[52]. Bảng 1.2: Các bacteriocin phổ biến đƣợc tổng hợp bởi vi khuẩn lactic [52] Bacteriocin Vi khuẩn lactic sản sinh bacteriocin Lactacin F L. johnsonii spp. Lactocin 705 L. casei spp. Lactoccin G L. lactis spp. Lactococcin MN Lactococcus lactis var cremoris Nisin Lactococcus lactis spp. Leucocin Leuconostoc spp. Plantaricin EF, Plantaricin W Plantaricin JK, Plantaricin S L. plantarum spp. 15 1.3.6.2. Bacteriocin từ vi khuẩn L. plantarum Rất nhiều bacteriocin sinh tổng hợp từ L. plantarum đã được phát hiện và nghiên cứu. Bảng 1.3 thể hiện các đặc điểm của một số bacteriocin được sản sinh bởi vi khuẩn L. plantarum phân lập từ các sản phẩm lên men khác nhau [36]. Bảng 1.3: Một số bacteriocin sản xuất bởi L. plantarum đƣợc phân lập từ các mẫu thực phẩm khác nhau [36] Mẫu phân lập Chủng vi khuẩn Bacteriocin Đặc điểm cấu trúc Vi sinh vật bị ức chế Thịt L.plantarum UG1 Plantaricin UG1 Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử từ 3 – 10 kDa L. monocytogenes, B. cereus, C. perfringens, C. sporogenes L.plantarum LT154 Plantacin 154 Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử nhỏ hơn hoặc bằng 3 kDa S. aureus, L.monocytogenes, A. hydrophila L.plantarum SA6 Plantaricin SA6 Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử khoảng 3,4 kDa L. plantarum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc spp., Listeria grayi L.plantarum ST202Ch ST216Ch BacSt202Ch, bacST216 Chuỗi peptit đơn với khối lượng phân tử tương ứng là 3,5 kDa và 10 kDa Enterococcus faecium, E. coli, L.monocytogenes Pseudomonas spp., S. aureus Cá L.plantarum PMU 33 ST28MS, ST16MS Chuỗi peptit đôi ( và  peptit), khối lượng phân tử tương ứng là 3,2 kDa và 3 kDa L. monocytogenes, B. cereus, S. aureus, E. faecium, E. faecali L.plantarum BF001 Plantaricin F Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử tương ứng là 0,4 kDa và 4,6 kDa S. aureus, S. typhimurium, L. monocytogenes, P. aeruginosa 16 Rau quả L.plantarum ST28MS ST16MS ST28MS ST16MS Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử tương ứng là 5,5 kDa và 2,8 kDa L. sakei, S. aureus E. faecalis, P. aeruginosa, E. coli, A. baumanii L.plantarum C11 Plantaricin EF Plantaricin JK Plantaricin A Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử chưa được xác định Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Leuconostoc sp., Streptococcus sp. L.plantarum LPC010 Plantaricin S Plantaricin T Chuỗi peptit đôi với khối lượng phân tử 2,5 kDa (đối với plantaricin S) và chưa xác định khối lượng (đối với plantaricin T) Propionibacterium sp., Clostridium tyrobutyricum, E. faecalis L.plantarum ST16Pa ST16Pa Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử 6,5 kDa E. faecalis, E. faecium, L. monocytogenes, Listeria innocua, S. aureus, Streptococcus spp.,Pseudomonas spp. L.plantarum 163 Plantaricin 163 Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử 3,5 kDa S. aureus, L. monocytogenes, B. pumilus, B. cereus, M. luteus, L. thermophilus, L. rhamnosus, E. coli, P. aeruginosa , P. fluorescens Các sản phẩm từ sữa L.plantarum AMA-K AMA-K Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử 2,9 kDa Enterococcus spp., E. coli, Klebsiella pneumonia, Listeria spp. L.plantarum WHE92 AcH Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử 4,6 kDa L. monocytogenes L.plantarum LB-B1 LB-B1 Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử từ 2,5 – 6,5 kDa Listeria, Lactobacillus spp., Streptococcus spp. Enterococcus spp., Pediococcus spp. , E. coli L.plantarum ST8KF BacST8KF Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử khoảng 3,5 kDa L. casei, Lactobacillus salivarus, Lactobacillus curvatus, L. innocua 17 Ngũ cốc L.plantarum ST13BR ST13BR Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử khoảng 10 kDa P. aeruginosa, E. faecalis, K. pneumonia, E. coli L.plantarum ST194BZ ST194BZ (α) ST194BZ (β) Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử tương ứng là 3,3kDa và 14 kDa E. faecalis, E. coli, Enterobacter cloacae, P. aeruginosa L.plantarum 423 Plantaricin 423 Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử là 3,5 kDa B. cereus, C. sporogenes, E. faecalis, Listeria spp., Staphylococcus spp. Như vậy, bacteriocin từ vi khuẩn L. plantarum có cấu trúc là chuỗi peptit đơn hoặc đôi với khối lượng phân tử nằm trong khoảng 0,4 – 14 kDa và có khả năng ức chế nhiều vi sinh vật gây hại như S. aureus, E. faecalis, P. aeruginosa, L.monocytogenes, 1.3.7. Phương pháp tinh sạch bacteriocin Quá trình tinh sạch là bước cần thiết để nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc phân tử, trình tự amino axit, cơ chế hoạt động, các đặc tính của bacteriocin cũng như xác định những thông tin về trọng lượng phân tử. Một số phương pháp tinh sạch bacteriocin được sinh tổng hợp từ vi khuẩn lacticlà chiết dung môi, siêu lọc, hấp phụ - giải hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, kết tủa bằng muối, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC,Trong đó, HPLC là kỹ thuật được áp dụng phổ biến nhất bởi mức độ tinh sạch cao và chính xác. Kết quả tinh sạch một số bacteriocin sinh tổng hợp bởi vi khuẩnLactobacillus plantarum được trình bày trong Bảng 1.4. 18 Bảng 1.4: Tinh sạch một số bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum[36]. Bacteriocin Các bƣớc tinh sạch Hoạt độ riêng (AU/mg) Độ sạch Plantaricin ZJ008 Dịch nuôi cấy thô 14,9 1 Cột hạt nhựa Macroporous 37,5 2,5 Trao đổi cation 369,9 24,8 Lọc gel 8556,7 573,1 Plantaricin từ L. plantarum LP31 Dịch nuôi cấy thô 85,5 1 Sắc ký lọc gel 5900 689,5 RP – HPLC 506.000 5914,6 Plantaricin C19 Dịch nuôi cấy thô 455 1 RP – HPLC 409.600 900,2 Plantaricin MG Dịch nuôi cấy thô 0,37 1 Kết tủa bằng muối amonium sunphat 5,35 14,9 Lọc gel 44,64 20,0 RP – HPLC 9333,33 25,2 BacTN635 Dịch nuôi cấy thô 2083 1 Kết tủa bằng muối amonium sunphat 9904 4,7 Lọc gel 146.104 70,1 HPLC 197.368 94,7 Plantaricin ASM1 Dịch nuôi cấy thô 253 1 Kết tủa bằng muối amonium sunphat 1850 7,3 Trao đổi cation 11.900 47,0 HPLC 10.700 42,3 19 1.4. Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn lactic Bacteriocin mang lại nhiều lợi ích và ứng dụng trong cuộc sống của con người nhờ các tính chất đặc trưng của chúng. Tuy vậy, vẫn còn khá nhiều vấn đề liên quan đến bacteriocin vẫn cần được làm sáng tỏ. Điều này đã thôi thúc các nhà khoa học bắt tay vào nghiên cứu và đã có rất nhiều công trình đã được ứng dụng thành công vào thực tế, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống. 1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới Bacteriocin từ vi khuẩn lactic nói chung Budu-Amoako E. cùng cộng sự thuộc trung tâm Công nghệ thực phẩm PEI, Canada đã nghiên cứu hiệu quả tiêu diệt Listeria monocytogenes trong các thùng chứa bảo quản tôm hùm khi kết hợp nisin và nhiệt độ.Năm 2006, Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu tại BASF cho biết, công ty hoá chất BASF của Đức đã phát triển kẹo cao su có chứa chủng vi khuẩn Lactobacillus có lợi. Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng. Chủng Lactobacillus mới (có tên là Lanti-caries) có khả năng sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thành khối không thể dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng.Nhóm tác giả Todorov và Dicks K. M. thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch, Nam Phi đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ boza (một loại đồ uống ngọt lên men từ lúa mì ở Thổ Nhỹ Kỳ). Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14 kDa) ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiellapneumoniae và Lactobacillus curvatus[48]. Một nghiên cứu khác của Satish Kumar R, Arul V thuộc khoa Công nghệ sinh học trường đại học Pondicherry, Ấn Độ đã tách chiết một loại bacteriocin, phocaecin PI80, sinh tổng hợp từ chủng Streptococus phocae PI80 phân lập từ tôm thẻ chân trắng Ấn Độ. Chất kháng khuẩn này nhạy cảm với trypsin, proteinaza, pepsin, chymotrypsin và ức chế một số tác nhân gây bệnh quan trọng như: Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, V.fischeri [26]. Năm 2011, Ozdemir cùng cộng sự thuộc khoa Công nghệ sinh học, trường đại học Adnan Menderes, Thổ Nhĩ Kỳ đã xây dựng một bộ sưu tập gồm 57 chủngEnterococcalphân lậptừ các nguồnkhác nhau(bao gồmnướcsông, nước thải, đất, động vật,