Luận văn Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú

ệnh nhân ung thư vú và 51 đối chứng là người bình thường khỏe mạnh có độ tuổi tương ứng. ADN được tách chiết từ máu ngoại vi, được định lượng mtADN và nDNA bằng phương pháp PCR định lượng đa mồi (multiplex real-time PCR) để khuếch đại trình tự của gen ATP8 và gen glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Lượng mtADN được xem xét tương ứng với giai đoạn của khối u, tình trạng kinh nguyệt, tuổi, tình trạng hạch bạch huyết, các biểu hiện của thụ thể estrogen (ER), thụ thể progesterone (PR) và protein / neu-2 của bệnh nhân ung thu vú. Họ đã thu được kết quả lượng mtADN ở bệnh nhân ung thư vú giai đoạn I thấp 16 hơn đáng kể so với các giai đoạn khác. Số lượng bản sao mtADN giảm được tìm thấy trong nhóm bệnh nhân ung thư trong giai đoạn mãn kinh. Không có sự khác biệt về số lượng bản sao mtADN liên quan đến tuổi, số hạch, ER, PR, Her-2 / neu. Trong nghiên cứu này, số lượng bản sao mtADN giảm trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vú được gắn liền với giai đoạn I. Việc sử dụng mtADN có thể có giá trị chẩn đoán và nghiên cứu sâu hơn, có tiềm năng trở thành một chỉ thị để phát hiện sớm ung thư vú [35]. Năm 2013, Thyagarajan và cs đã nghiên cứu mối liên quan giữa số lượng bản sao mtADN trong máu ngoại vi và nguy cơ ung thư vú ở 184 bệnh nhân ung thư vú và 529 mẫu đối chứng. Số lượng bản sao mtADN được xác định bằng phương pháp PCR định lượng. Các phân tích đã cho thấy rằng có mối liên hệ giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư vú. Nguy cơ cao đối với những bệnh nhân ung thư vú nguyên phát mắc dưới 3 năm có số lượng bản sao mtADN trong máu ngoại vi cao. Không có mối liên quan giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ đã cung cấp mẫu máu trên 3 năm trước khi chẩn đoán ung thư vú. Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư vú phụ thuộc vào thời gian lấy máu và chẩn đoán ung thư vú [30]. Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể, nhưng ở Việt Nam đây là một hướng nghiên cứu rất mới. Cho đến nay, chúng tôi vẫn chưa tìm thấy một công bố chính thức về nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN đối với bệnh ung thư nói chung và ung thư vú nói riêng ở Việt Nam. 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TI THỂ Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN đang là một hướng nghiên cứu chỉ thị ung thư khả quan và có nhiều hứa hẹn. Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng nhiều để nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN hiện nay gồm: Phương pháp PCR định lượng Đây là phương pháp được phát triển dựa trên phương pháp PCR, được sử dụng để khuếch đại và định lượng một đoạn ADN đích. Trong đó kết quả khuếch đại được hiển thị ngay sau mỗi chu kì phản ứng. Đo đó cho phép xác định số lượng 17 bản ADN đích được khuếch đại với độ nhạy và độ chính xác cao. kỹ thuật này được sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN hiện nay. PCR định lượng sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng lượng ADN được nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh quang. PCR định lượng cho phép xác định số bản sao mtADN ban đầu có trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Có hai kỹ thuật hay được sử dụng:  Kỹ thuật sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi ADN, làm cho sợi đôi ADN phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.  Kỹ thuật sử dụng đầu dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang. Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của đầu dò lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích.  Phương pháp PCR định lượng cho phép định lượng đột biến mtADN với mức độ không đồng nhất thấp dưới 1% [37]. Phương pháp HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) và DHPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính) HPLC là một kỹ thuật trong hóa học phân tích được sử dụng để tách các thành phần trong hỗn hợp, xác định từng thành phần và định lượng các thành phần. Đây là một kĩ thuật cơ bản, kinh điển trong phân tích sinh học, đặc biệt trong phân tích các hợp chất hóa sinh học. Phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng ứng dụng rộng rãi, cho phép phân tích với lượng mẫu nhỏ. Tuy độ nhạy và chính xác không được bằng phương pháp PCR định lượng nhưng cũng cho các kết quả định lượng đáng tin cậy. Bên cạnh đó ứng dụng của HPLC rất đa dạng, có thể sử dụng phân tích protein, ADN hay các hợp chất hóa học. Phương pháp RPLC-HPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN có kích thước khác nhau. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ti thể, hoặc một vùng nhất định của mtADN để xác định đột biến. Phương pháp DHPLC được phát triển từ phương pháp HPLC, sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép 18 (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex). Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ti thể, hoặc một vùng nhất định của mtADN để xác định đột biến. Phương pháp DHPLC cho phép định lượng đột biến mtADN thấp tới 1% [11]. Phương pháp định lượng bằng phần mềm phân tích hình ảnh bản gel điện di Sự phát triển mạnh mẽ của các hệ thống phần mềm, các ứng dụng tin học đã có nhiều đóng góp to lớn trong các ngành khoa học nói chung và ngành sinh học nói riêng. Đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém, tiện dụng, cho kết quả nhanh và có thể áp dụng rộng rãi. Sau khi tham khảo các ưu, nhược điểm của các kỹ thuật trên và dựa trên điều kiện của phòng thí nghiệm cho phép chúng tôi ứng dụng kỹ thuật HPLC và phần mềm ImageJ để nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư vú. Việc kết hợp phương pháp kinh điển với độ chính xác cao trong sinh học thực nghiệm là HPLC với phương pháp ứng dụng phần mềm phân tích hình ảnh sẽ cho kết quả khách quan và toàn diện hơn để khảo sát sự biến đổi số lượng bản sao mtADN đối với bệnh nhân ung thư nói chung và bệnh nhân ung thư vú nói riêng, qua đó đánh giá được vai trò và mức độ liên quan của biến đổi đó đối với bệnh. 19 Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là mô vú tại vị trí khối u và mô vú lân cận ở rìa vị trí u của bệnh nhân ung thư vú. Mẫu mô vú sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K cung cấp (danh sách bệnh nhân được trình bày ở phần phụ lục 1). Mẫu đối chứng là mẫu máu và mô của người u xơ vú (danh sách bệnh nhân được trình bày ở phần phụ lục 2). Mẫu mô được cho vào ống eppendorf vận chuyển về trong nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu -80OC. Mẫu máu được đựng trong ống đựng máu chuyên dụng có chứa chất chống đông. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê trong bảng 1 Bảng 1. Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu Tên hóa chất Nhà sản xuất Hóa chất tách ADN tổng số mô từ mô (QIA amp DNA mini kit) QIAGEN (Đức) Hóa chất tách ADN tổng số từ máu (GeneJET Whole Blood Genomic DNA Mini KIT) Thermo Scientific (Mỹ) Hóa chất thôi gel QIAGEN (Đức) Cặp mồi gen ti thể mt và cặp mồi gen β-actin (ACTB) IDT (Mỹ) Maxima Hot Start PCR MasterMix (2x) Thermo Scientific (Mỹ) Agarose Invitrogen (Mỹ) APS, Acrylamide, Bis-Acrylamide Pharmacia, Thụy Điển GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific (Mỹ) 20 NoLimits DNA Fragment 100bp, 200bp, 400bp Thermo Scientific (Mỹ) Acetonitrile, HPLC gradient grade Merk (Đức) Acid acetic Sigma (Mỹ) Triethylamin Sigma (Mỹ) Các hóa chất khác như isopropanol, ethanol, agarose, bạc nitrate, đều đạt độ sạch phân tích dùng trong sinh học phân tử. 2.1.3. Dụng cụ - Bể ổn nhiêt (Julabo, Đức) - Tủ an toàn sinh học (Nuaire, Mỹ) - Buồng điện di Mini-Protean 3 cell (Bio-rad, Mỹ) - Buồng điện di agarose (Bio-rad, Mỹ) - Speed Vac (Thermo Electron, Mỹ) - Máy nhân gen PCR 9700 system (Applied Biosystems, Mỹ) - Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức) - Máy đo NanoDrop 2000c (Thermo Scientific) - Máy lắc ổn nhiệt (IKA, Đức ) - Tủ ấm (Memer, Đức ) - Tủ lạnh -20C và -80C (Nuaire, Mỹ) - Hệ thống lọc nước loại vi khuẩn (Pyrex, Mỹ ) - Hệ thống máy microHPLC (Shimadzu, Nhật) - Cột Hotsep PLRP-S (GTSepTech, Nauy ) - Máy scan, chụp ảnh gel cùng với phần mềm phân tích hình ảnh. - Máy tính trang bị các phần mềm tin sinh học kết nối đến các cơ sở dữ liệu trực tuyến, phần mềm thiết kế mồi Primer-BLAST. - Các dụng cụ, trang thiết bị cơ bản khác của phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein. 21 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau (Hình 2) Hình 2- Sơ đồ quy trình thí nghiệm 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số 2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô - Mẫu mô u và mẫu mô mô lân cận được lấy ra từ tủ -80C, sau đó mẫu được rã đông và chia nhỏ và tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô QIA amp DNA minikit (Qiagen) theo quy trình của nhà sản xuất. 2.2.1.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu - Mẫu máu (bệnh nhân, người bình thường) được lấy ra từ tủ -80C, rã đông, lấy 200 μl cho vào ống eppendorf và tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ máu- GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini KIT theo quy trình của nhà sản xuất (Thermo Scientific, Mỹ). 2.2.1.3. Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di agarose - Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo nồng độ ADN bằng máy NanoDrop. 22 - Mẫu ADN sau khi được tách chiết được bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.2. Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích định lượng 2.2.2.1. Phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100 bp, 200 bp và 400 bp - Phân tích HPLC với ADN chuẩn 100 bp, 200bp và 400 bp để lựa chọn kích thước sản phẩm cần thiết kế cho phản ứng PCR đa mồi. - Nước sử dụng trong phân tích HPLC là nước khử ion. - Thành phần các hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC (bảng 2) Bảng 2: Thành phần hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC Hóa chất Thành phần TEAA 1M Triethylamin 1M +acid acetic 1M Đệm A TEAA 0,1M + EDTA 0,1mM, pH 7,0 Đệm B TEAA 0,1M + acetonitrile 50% + EDTA 0,1mM, pH 7,8 Dung dịch bảo quản Acetonitrile 50% - Chương trình Phân tích HPLC được thực hiện theo các bước sau (Hình 3) Hình 3- Chương trình phân tích HPLC - Loại cột: HotSep PLRP-S: S-167-1010, 5µ- 1000Å, - Kích thước cột: đường kính 1.0 mm, dài 10 cm. - Tốc độ dòng 20 µl/ phút. - Nhiệt độ buồng cột: 50oC - Đo ở bước sóng 260nm. 23 2.2.2.2. Thiết kế các cặp primer Để định lượng số bản sao mtADN chúng tôi thiết kế hai cặp primer cho phản ứng PCR đa mồi để tạo sản phẩm cho các phương pháp định lượng sau đó. Với mục đích định lượng số bản sao của mtADN, chúng tôi chọn gen giữ nhà trong nhân là gen β-actin (ACTB) và đoạn gen đặc trưng cho tính bảo thủ của mtADN được lựa chọn là ở vùng gen ND1– mã hóa cho 1 tiểu phần của Ubiquinon trong phức hệ 1 của chuỗi hô hấp của ti thể. Ngoài ra, để quá trình phân tích và định lượng bằng HPLC được tiến hành thuận lợi, các đoạn ADN (sản phẩm PCR định lượng) phải được lựa chọn sao cho có sự khác biệt nhất định về kích thước. Các cặp primer được thiết kế dựa trên các trình tự gen được tham khảo trên cơ sở dữ liệu NCBI (gen β-actin: NG_007992.1; mtDNA: NC_012920.1) và phần mềm thiết kế Primer-BLAST (NCBI). Khuếch đại đoạn gen mt và gen ACTB bằng phương pháp PCR - Đoạn gen mt và ACTB được khuếch đại bằng phương pháp PCR với thể tích 12,5 µl nhằm kiểm tra cặp mồi có nhân sản phẩm đúng kích thước không. - Phản ứng PCR với từng cặp primer mt và ACTB gồm các thành phần trong bảng 3. Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích Nồng độ cuối cùng Phản ứng 12,5 µl Phản ứng 100 µl Master mix Maxima 2X 6,25µl 50 µl 1X Primer F (10-5M) 0,25µl 2 µl 0,2 µM Primer R (10-5M) 0,25 µl 2 µl 0,2 µM ADN khuôn Tùy nồng độ ADN tổng số của mẫu 1 ng H2O siêu sạch Bổ sung đủ 12,5 µl Bổ sung đủ 100 µl 24 Chu trình nhiệt được thiết lập như sau (Hình 2.2.2.3) Hình 4- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB Khuếch đại đoạn gen ti thể mt và đoạn gen nhân ACTB bằng phương pháp PCR đa mồi - Khuếch đại bằng phản ứng PCR đoạn gen mt và ACTB với thể tích 15 µl gồm các thành phần như trong bảng 4. Bảng 4. Thành phần phản ứng PCR (thể tích 15 µl) Thành phần Thể tích Nồng độ cuối cùng Master mix Maxima 2X 7,5µl 1X Primer mt-F (10-5M) 0,3 µl 0,2 µM Primer mt-R (10-5M) 0,3 µl 0,2 µM Primer ACTB-F (10-5M) 0.3 µl 0,2 µM Primer ACTB-R (10-5M) 0.3 µl 0,2 µM ADN khuôn Tùy nồng độ ADN tổng số của mẫu 2 ng H2O siêu sạch Bổ sung đủ 15 µl Chu trình nhiệt được thiết lập như ở hình 4 ở trên. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di Trong đệm TBE (pH 7,5 - 8.3), các phân tử acid nucleic tích điện âm nên dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử này sẽ chuyển động từ cực âm sang cực dương. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích 25 thước phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thường sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào kích thước đoạn ADN muốn phân tách người ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau. Kích thước sản phẩm PCR đoạn gen mt là 433 bp và đoạn gen ACTB là 107 bp, nên có thể phân tích bằng điện di trên gel agarose 1.7%. 2.2.2.3. Nhân dòng đoạn gen mt và ACTB và giải trình tự ADN Các đoạn ADN tinh sạch được nhân dòng để giải trình tự nhằm xác định trình tự của các đoạn gen. - Tiến hành tạo đầu bằng và biến nạp đoạn mt và ACTB bằng kit CloneJET PCR Cloning Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (vectơ được sử dụng là pJET 1.2 có kích thước 2974bp. Vị trí đa điểm của vector được thiết kế nằm trong gen mã hóa cho một protein gây độc cho vi khuẩn). - Vectơ được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. - Các tế bào sau biến nạp thành công sẽ mọc trên môi trường LB đặc có chứa ampicillin. - Các khuẩn lạc sau khi được kiểm tra đúng bằng PCR sẽ được nuôi với thể tích lớn 5ml trong môi trường LB có chứa ampicillin ở 37oC trong 14-16h lắc 200 vòng /phút. - Sau đó các tế bào được thu và tách plasmid bằng QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). - Kiểm tra plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ Nanodrop. - Plasmid thu được sẽ được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi mt, ACTB và pJET, nếu đúng sẽ cho đoạn gen có kích thước tương ứng với các cặp mồi và với mồi PJet sẽ cho đoạn gen lớn hơn 120bp so với kích thước của các đoạn gen tương ứng. - Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,7%. - Mẫu plasmid sau khi tinh sạch sẽ được giải trình tự ADN. 26 2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR Plasmid sau khi dược khuếch đại với thể tích lớn 100 µl sẽ được tinh sạch bằng kit thôi gel QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN, Đức) - Kiểm tra ADN tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 1.5 % và đo nồng độ ADN bằng máy NanoDrop. Mẫu ADN sau khi tinh sạch được bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.3. Định lượng ADN bằng HPLC và phần mềm ImageJ 2.2.3.1. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR đa mồi mt_ACTB để phục vụ mục đích định lượng: Theo lý thuyết PCR, số bản sao đoạn gen sẽ tăng theo chu kỳ, tuy nhiên với số chu kỳ lớn hơn 40 thì sản phẩm đạt đến tình trạng bão hòa. Điều này được giải thích với các nguyên nhân chủ yếu như: nồng độ bản sao DNA tăng khiến cho lượng dNTP không đủ cung cấp; hoạt tính enzyme polymerase giảm sau nhiều chu trình thay đổi nhiệt độ. Vì vậy, việc xác định các chu kỳ mà tại đó sản phẩm PCR vẫn đang thay đổi tuyến tính mang tính quyết định tới độ chính xác của kết quả định lượng sau này. Đặc biệt là đối với phản ứng PCR đa mồi còn có cả sự cạnh tranh dNTP, enzyme polymerase và không loại trừ khả năng bắt cặp giữa các cặp mồi. Chính vì vậy, dựa vào các kết quả PCR đơn và đa mồi phía trên, chúng tôi tiến hành tìm các chu kỳ cho PCR đa mồi mà ở đó lượng sản phẩm vẫn đang biến đổi tuyến tính. Tiến hành PCR ở các chu kì khác nhau 20, 25, 30, 35 chu kì để chọn được chu kì PCR phù hợp (nằm trong khoảng tuyến tính). 2.2.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB bằng điện di Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 10% (bảng 2.2.4.2). Điện di bằng đệm TBE 1X (pH 7,5 - 8,3) ở 175 V trong 40 phút. Sau đó được nhuộm bạc và quan sát dưới ánh sáng trắng. 27 Bảng 5. Công thức đổ gel polyacrylamide 10% bản 7cm 2.2.3.3 Kỹ thuật nhuộm bạc Bản gel sau điện di trên gel polyacrylamid được nhuộm bạc dựa trên phương pháp của Bassam (1991) [3] gồm các bước sau: - Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% lắc bằng máy lắc trong 20 phút. - Rửa bằng nước cất ba lần, mỗi lần 5 phút. - Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat trong 20 - 30 phút, lắc đều, tránh ánh sáng. - Rửa nước khoảng 30 giây - 1 phút. - Hiện băng bằng dung dịch develop (30g/L Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400 µg/L natri thiosulfate) trong 3- 5 phút. - Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 1 – 2 phút. - Bảo quản gel bằng nước cất, quan sát kết quả bằng ánh sáng trắng. 2.2.3.4. Định lượng số bản sao ADN ti thể bằng HPLC - Các mẫu sau khi PCR được li tâm với tốc độ 13000v/phút ở 5oC trong 15 phút để chuẩn bị phân tích bằng HPLC. - Nước sử dụng trong quá trình chạy HPLC là nước khử ion. - Thành phần các hóa chất chạy HPLC ở bảng 2 - Mẫu chạy HPLC gồm 9 µl sản phẩm PCR đã li tâm, bổ sung 1 µl TEAA 1M ph7. - Mỗi lần phân tích HPLC, cài chương trình cho bộ phận bơm mẫu tự động hút 3 µl mẫu. - Các mẫu được phân tích theo chương trình như Hình 3 Thành phần Gel 10% bản 7cm Monoacrylamide 20% 1,65ml TBE 1X 3.3ml APS 37,5µl TEMED 3µl 28 - Dựng đường chuẩn với các đoạn ACTB và mt tinh sạch. - Tiến hành phân tích HPLC các mẫu PCR. - Sau khi thực hiện xong ta sẽ có hình các đỉnh sắc ký, đựa vào phần phân tích của phần mềm LC solution kết nối với hệ thống HPLC ta sẽ tính được diện tích của các đỉnh sắc ký. - Số lượng bản sao ADN ti thể (giá trị tương đối) có thể tính toán dựa theo công thức: n= k. a/b Trong đó: k: tỉ số nồng độ các cặp mồi ACTB/mt a: diện tích đỉnh của sản phẩm mt b: diện tích đỉnh của sản phẩm ACTB 2.2.3.5. Định lượng số bản sao ADN ti thể bằng phần mềm phân tích hình ảnh gel điện di: - ImageJ là phần mềm miễn phí, mã nguồn mở được sử dụng cho phân tích hình ảnh gel điện di. Phần mềm cho phép phân tích lượng ADN của các băng điện di thông qua việc xác định mật độ điểm ảnh (densitometry) của các vùng được lựa chọn phân tích của các mẫu. - 2 µl các mẫu PCR được chạy điện di trên gel polyacrylamide 10%, 175V trong 40 phút và nhuộm bạc. - Bản gel sẽ được scan để lấy hình ảnh sử dụng phân tích. 2.2.4. Tính toán thống kê Số liệu xử lí và phân tích thống kê bằng Microsoft Excel và phần mềm SPSS. So sánh tỷ số mt/ACTB giữa các mẫu mô khác nhau và phân tích mối liên quan với các đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú bằng kiểm định test Mann-Whitney và test Kruskal-Wallis. 29 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết thành công ADN tổng số từ 46 mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú và 20 mẫu máu và mô của bệnh nhân u xơ vú. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 5). Hình 5- Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ các mẫu nghiên cứu (điện di trên gel agarose 0,8% và nhuộm ethidium bromide) Các giếng 1-6: ADN tách ở bệnh nhân u xơ; các giếng 7-12: ADN tách ở bệnh nhân ung thư vú. 2 giếng liên tiếp 1-2, 3-4, 5-6; theo thứ tự là mẫu máu và mô của bệnh nhân u xơ: 7-8, 9-10,11-12 theo thứ tự là mẫu mô lân cận u và mô u của cùng bệnh nhân. Kết quả điện di cho thấy ADN tổng số tách chiết thu được khá sạch, chất lượng tương đối tốt, các băng thu được khá sắc nét và ít bị đứt gẫy. Do đó, ADN tách chiết đảm bảo chất lượng để làm khuôn cho phản ứng tiếp theo. Độ sáng của các băng là khác nhau khá nhiều, có băng rất đậm như giếng 2, có băng mờ như giếng 3, chứng tỏ hàm lượng ADN có trong sản phẩm tách chiết của các mẫu khác nhau là khác nhau. Đối với mẫu máu và mẫu mô u xơ lấy từ cùng một bệnh nhân có thể thấy rằng lượng ADN tách từ mẫu mô u xơ nhiều hơn ADN tách từ mẫu máu. 30 Đối với mẫu mô lân cận u và mẫu mô u lấy từ cùng một bệnh nhân, có thể thấy rằng lượng ADN tách từ mẫu mô u nhiều hơn ADN tách từ mẫu mô lân cận u, dù lượng mẫu ban đầu dùng để tách là tương đương. Điều này có thể do ở mẫu bệnh, phần khối u có sự tăng sinh của tế bào nhiều hơn nên có lượng vật chất di truyền lớn hơn, do đó, cùng một khối lượng mô đem tách ADN lại thu được lượng ADN ở mẫu bệnh nhiều hơn. 3.2. THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI 3.2.1. Kết quả phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100 bp, 200 bp và 400 bp Chúng tôi tiến hành phân tích HPLC với các cặp ADN chuẩn 100_400bp và 200_400 bp để đánh giá sự phân tách của cột và thu được kết quả ở Hình 6 Hình 6 - Kết quả phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp và 200_400bp A- ADN chuẩn 100_400bp; B- ADN chuẩn 200_400bp Qua kết quả trên cho thấy ADN chuẩn 100_400bp phân tách đỉnh rõ ràng, ADN chuẩn 200_400bp có tách đỉnh nhưng bị chung nhau phần chân. Để dễ dàng cho việc phân tích định lượng thì phân tích ADN chuẩn 100bp_400bp sẽ cho kết quả chính xác hơn. Do đó chúng tôi thiết kế các cặp primer cho sản phẩm là các đoạn ADN có kích thước khoảng 100bp và 400bp. 31 3.2.2. Kết quả thiết kế các cặp primer Sử dụng phần mềm Primer-BLAST và các trình tự tham khảo NCBI, kết hợp với kết quả phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100bp, 200bp và 400bp ở trên, chúng tôi đã thiết kế hai cặp primer cho sản phẩm đoạn gen mt là 433 bp và đoạn gen ACTB là 107 bp có các trình tự như sau: - Primer mt (kích thước sản phẩm 433 bp)  Mồi xuôi mt-F: 5’- GAC GCC ATA AAA CTC TTC AC - 3’  Mồi ngược mt-R: 5’- GGT TGG TCT CTG CTA GTG TG- 3’ - Primer ACTB (kích thước sản phẩm 107 bp)  Mồi xuôi ACTB-F: 5’- ACG GCA GAA GAG AGA ACC A - 3’  Mồi ngược ACTB-R: 5’- GAG AAG ATG ACC CAG GTG AGT - 3’ Bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen ti thể mt-ND1 kích thước tương đương 433bp (mt) và đoạn gen nhân β-actin 107bp (ACTB). Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,7% (Hình 7) Tiếp tục tiến hành PCR đa mồi hai đoạn mt và ACTB chúng tôi đã thu được sản phẩm PCR có hai băng tương ứng. Sản phẩm được kiểm tra trên gel 1.7% (giếng 4 Hình 7) Hình 7- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn mt và ACTB trên gel agarose 1,7% Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp; giếng 2: sản phẩm PCR đoạn gen ACTB kích thước khoảng 107 bp Giếng 3: sản phẩm PCR đoạn gen mt kích thước khoảng 433bp; Giếng 4: sản phẩm PCR đa mồi gen ACTB và mt. 32 Từ kết quả PCR đa mồi, hai băng mt và ACTB thu được sáng và rõ ràng, chúng tôi quyết định sử dụng cặp băng trên để tiến hành quá trình định lượng mtADN. 3.2.3. Kết quả nhân dòng và giải trình tự Tế bào khả biến được biến nạp và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung ampicillin để qua đêm ở tủ ấm 37oC. Những tế bào biến nạp thành công (có chứa plasmid) sẽ phát triển và mọc thành khuẩn lạc, những tế bào không chứa plasmid sẽ chết và không phát triển. (Hình 10) Hình 10- Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α. Đĩa 1 khuẩn lạc biến nạp đoạn gen mt, đĩa 2 khuẩn lạc biến nạp đoạn gen ACTB Các đĩa đều mọc khuẩn lạc, chứng tỏ biến nạp đã thành công, các khuẩn lạc tròn rõ ràng, không có dấu hiệu nhiễm. 3.2.3.1. Kết quả tách plasmid Sau khi kiểm tra khuẩn lạc có chứa đoạn gen mong muốn bằng phương pháp PCR với cặp mồi ACTB và mt, các tế bào khuẩn lạc đó được muôi cấy với thể tích 5ml để tách plasmid bằng kit QIA prep Miniprep kit. Plamid được điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 11) Qua hình ảnh điện di ta thấy các băng plasmid tương đối sáng, khá gọn chứng tỏ hàm lượng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 33 Hình 11- Hình ảnh điện di sau khi tách plasmid. Giếng 1 ADN chuẩn 1kb, Giếng 2 plasmid mt, giếng 3 plasmid ACTB 3.2.3.2. Kết quả PCR kiểm tra plasmid tinh sạch Sau khi tinh sạch, các plasmid được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi ACTB, mt và PJet. Các cặp mồi ACTB và mt sẽ nhân được các đoạn gen tương ứng khoảng 107bp và 433bp, còn cặp mồi PJet ngoài nhân đoạn gen ACTB và mt mà pla