Luận văn Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của người trong vi khuẩn Echerichia Coli

iêng biệt chúng theo khả năng di động trong trường điện từ về hai cực âm (-) và dương (+). Kết quả nhận được phổ các vạch protein khác nhau. Phương pháp điện di là một phương pháp nghiên cứu sinh hóa thông dụng và rất tiện lợi. Phương pháp điện di protein thường được tiến hành trên chất mang ở dạng gel là lưới polymer. Lưới polymer làm chậm tốc độ di chuyển các phân tử protein theo khối lượng, kích thước, độ mang điện của chúng. Phương pháp điện di protein trên gen polyacrylamit có chứa SDS được tiến hành theo phương pháp của Laemmli [29]. Thành phần gel được trình bày ở Bảng 11 phần Phụ lục. Quy trình điện di như sau: - Pha mẫu với Protein Sample Buffer 4X và biến tính mẫu ở 95oC trong 5 phút. Dùng 10 l mẫu tra vào từng giếng và tiến hành điện di trên gel polyacrylamide 10% gồm gel cô 4% và gen tách 10%. - Đổ dung dịch chạy (Running buffer) SDS- Page 1x và chạy điện di: Chạy ở hiệu điện thế 110V trong 2- 3 giờ. Theo dõi đến khi thấy màu dung dịch đệm mẫu bắt đầu thoát ra ngoài dung dịch đệm chạy thì kết thúc. - Bản gel được nhuộm trong dung dịch nhuộm (Comasive Brilliant Blue R250) trong khoảng từ 30 phút đến 1 giờ. - Tẩy gel bằng cách ngâm bản gel đã nhuộm vào dung dịch tẩy (acid acetic 7%, metanol 20%) đến khi bản gel màu trắng thì kết thúc quá trình tẩy. Thời gian tẩy khoảng 30 phút. Sau đó gel được bảo quản và chụp ảnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction- PCR) Phương pháp PCR nhằm mục đích khuyếch đại in vitro một đoạn DNA khi biết trình tự hai đầu. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là nhờ sự xúc tác của enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để khuyếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu [48]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi là Cặp 1: h-tPA-NdeI F2, h-tPA-XhoI R3; Cặp 2: h-tPA-BamHI F2, h-tPA-XhoI R4. Các thành phần của PCR: đoạn DNA khuôn (cDNA mã hóa h-tPA được tạo dòng trong vector pUC18), hai cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15- 30 nucleotide, bốn loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), DNA polymerase. PCR bao gồm các giai đoạn: – Giai đoạn biến tính: DNA được biến tính ở nhiệt độ khoảng 94oC- 95oC trong thời gian một vài phút, khi đó các liên kết hydro bị đứt và sợi DNA dạng sợi kép thành hai sợi đơn; – Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ từ 40oC- 65oC trong khoảng 30 giây đến 1 phút, hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ bắt cặp với sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở hai đầu đoạn DNA cần nhân. Nhiệt độ của bước gắn mồi tùy thuộc vào từng loại mồi cụ thể, được tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi; – Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ phản ứng được nâng lên 70oC- 80oC (trung bình khoảng 720C) trong khoảng thời gian thích hợp (tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần tổng hợp), enzyme Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp DNA diễn ra; Quy trình phản ứng được thực hiện trên máy PCR GeneAmp PCR System 9700 với thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 5 phần Phụ lục, chu trình nhiệt phản ứng như sau: Chu trình nhiệt trên máy GenAmp PCR System 9700 như sau: 94 o C 94 o C 60 o C 72 o C 72 o C 4 o C 3’ 30’’ 30’’ 1’30’’ x30ck 10’  Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó được tinh sạch DNA theo kit Wizard SV Gel and Clean-Up System. 2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế Nguyên tắc: Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết các đoạn DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi của phân tử DNA. Enzyme hạn chế cắt DNA hình thành hai dạng đầu: tạo đầu bằng và tạo đầu dính. Đối với sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành cắt bằng hai cặp enzyme BamHI/XhoI và NdeI/XhoI. Vector pET21a(+) được xử lý bằng NdeI/XhoI và pGEX6p1 được cắt bằng BamHI/XhoI. Thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 6 phần Phụ lục. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (thường ở 370C, 2 giờ). Sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%; Sau khi cắt bằng enzyme hạn chế, các vector được xử lý với phosphatase để loại nhóm phosphate ra khỏi đầu 5’ nhằm giảm quá trình nối lại của vector. Thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 7 phần Phụ lục. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 1h sau đó tiếp tục ủ ở 75oC trong 15 phút để loại CIP [48]. 2.2.5. Ghép nối DNA Nguyên tắc: Đoạn cDNA và vector được xử lý bằng cùng một loại enzyme hạn chế tạo đầu bổ sung, các đầu này có trình tự bắt cặp với nhau. Dưới tác dụng của enzyme T4 DNA ligase, đoạn DNA quan tâm sẽ được gắn vào vector. Thành phần phản ứng ghép nối được trình bày ở Bảng 8 Phần Phụ lục. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và ủ 14- 24 giờ, ở 16oC. Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào E. coli và chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung Ampicillin (Amp), nồng độ 50µg/ml [48]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt Tùy từng mục đích khác nhau mà chúng tôi chuẩn bị các chủng vi khuẩn khác nhau. Chủng tế bào dùng tạo dòng là vi khuẩn E. coli chủng DH5α. Để biểu hiện, chúng tôi sử dụng vi khuẩn E. coli chủng BL21. Quy trình chuẩn bị và biến nạp đối với hai chủng là tương tự nhau [48]. 2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli - Chủng vi khuẩn lấy từ ống giữ chủng được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 37oC; Ngày hôm sau lấy 1 khuẩn lạc rời từ đĩa cấy ria, nuôi lắc 200vòng/phút (v/p) ở 37oC trong môi trường LB lỏng từ 1- 2h; Ngày tiếp theo cấy trải dịch nuôi ra đĩa chứa môi trường LB đặc. Nuôi qua đêm ở 37oC; - Chọn 1 khuẩn lạc từ đĩa, cấy chuyển vào 1,5 ml môi trường LB lỏng, nuôi qua đêm ở 37oC; - Cấy chuyển 200l dịch nuôi sang 30 ml LB lỏng. Nuôi lắc trong 3h ở 37oC; - Chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm. Giữ lạnh trên đá trong 10 phút; - Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút, ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi; sau đó bổ sung 15 ml dung dịch CaCl2 0,1M. Làm tan hết tủa tế bào trong dung dịch CaCl2. Ủ trên đá trong 40 phút; - Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi; bổ sung 1,5 ml dung dịch CaCl2 0,1 M. Ly tâm nhẹ để hòa tan tủa tế bào vào dung dịch CaCl2; - Chia ra các ống eppendorf và bổ sung 20 l glycerol 100%. Búng nhẹ để trộn đều các thành phần với nhau (thao tác trong box). Giữ tế bào khả biến ở -80oC [48]. 2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli - Tế bào khả biến E. coli được giữ trên đá khoảng 30 phút, sau đó bổ sung 5l của sản phẩm ghép nối vào ống tế bào khả biến (khoảng 100l). Giữ trong đá khoảng 15 phút; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 - Sốc nhiệt ở 42oC trong 70 giây, sau đó chuyển ngay sang bình đá và giữ trong đá 5 phút; - Bổ sung 300l môi trường LB lỏng; - Nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1giờ; - Cấy trải hết dịch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ml), nuôi ở 37oC qua đêm [48]. 2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid Nguyên tắc: Tách chiết plasmid dựa trên hai nguyên ngắc cơ bản là DNA nhiễm sắc thể của E. coli có kích thước lớn hơn rất nhiều so với DNA plasmid; do trọng lượng, kích thước khác nhau giữa các dạng DNA E. coli mà hầu hết DNA plasmid tách ra dưới dạng vòng đóng [48]. Hóa chất tách chiết DNA plasmid gồm: Sol I, Sol II, Sol III, dung dịch loại protein (hỗn hợp chloroform: isoamylalcohol = 24:1), dung dịch TE 0,01M, pH 8,0. Quy trình tách chiết DNA plasmid của E. coli - Nuôi cấy lắc qua đêm tế bào E. coli trong 1,7ml môi trường LB (có kháng sinh Amp nồng độ 50g/ml) ở 370C, 200 v/p; Ngày hôm sau, ly tâm dịch nuôi cấy trên ở 6.000 v/p, 7 phút; loại bỏ dịch; - Hoà cặn tế bào vi khuẩn trong 150l dung dịch I để lạnh, voltex làm tan cặn tế bào, sau đó giữ trong đá 5 phút; - Bổ sung 150l dung dịch II, đảo đầu ống Eppendorf nhẹ nhàng và giữ trên đá 10 phút; - Thêm 150l dung dịch III để lạnh, đảo nhẹ và ủ trong đá từ 3 – 5 phút; - Thêm 500 l dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ thể tích 24:1). Đảo đều hỗn hợp; - Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Chiết và chuyển pha lỏng ở phía trên sang một ống eppendorf mới; Thêm 50 l CH3COONa 3 M (pH 5,2) và 1 ml cồn 100 %. Đảo đều và giữ lạnh ở -200C trong 3 giờ; - Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC để thu tủa DNA; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 - Rửa cặn bằng 0,2ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút, làm khô và hoà cặn trong 40l TE 0,01M, giữ ở -20oC; Sau đó đổ bỏ cồn. Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút; - Hòa tan tủa DNA trong 50 l nước chứa RNase (0,01 mg/ml). Bảo quản DNA ở -20oC; Kiểm tra DNA bằng gel agarose 0,8 %. Các dòng mang vector tái tổ hợp sau khi được xác định sẽ được kiểm tra bằng enzyme hạn chế và PCR kiểm tra. Thành phần cắt kiểm tra được nêu ở Bảng 9 phần Phụ lục. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 2h. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR kiểm tra giống với quá trình nhân gen. Sản phẩm cắt và PCR kiểm tra được điện di trên gel agarose 0,8%. 2.2.8. Xác định trình tự gen Trình tự gen được xác định trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer kết hợp với sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Thành phần hỗn hợp sử dụng trong xác định trình tự DNA bao gồm cả dNTPs và ddNTPs, là các nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau. Mồi đọc trình tự đối với vector pET21a(+) là cặp mồi T7, đối với vector pGEX6p1 là cặp mồi PEXF/PEXR. Phản ứng gắn các nucleotide đánh dấu vào sợi DNA tổng hợp trên sợi khuôn được tiến hành trên máy PCR. Quá trình tổng hợp kéo dài chuỗi sẽ không tiếp tục diễn ra khi ddNTP được lắp vào, kết quả là tạo ra một bộ các đoạn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide. Sau đó sản phẩm PCR được điện di trên gel có độ phân giải cao, cho phép phân biệt được các sợi đơn hơn kém nhau một nucleotide [48]. Thành phần PCR xác định trình tự được trình bày ở Bảng 10 phần Phụ lục. Chu trình nhiệt trên máy GenAmp PCR System 9700 như sau: 96 o C 96 o C 50 o C 60°C 4oC 1’ 10’’ 5’’ x25ck 4’ ∞ - Tiếp đó, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp tủa cồn/EDTA: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 - Bổ sung 4l EDTA 125mM có pH 8,0 và 60l cồn 100%. Đảo nhẹ hỗn hợp và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Loại bỏ cồn. - Rửa tủa bằng 60l cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút và làm khô. - Bổ sung 10l Hi–DiTM Formamide và biến tính ở 95oC trong 5 phút. Các mẫu được cho vào các giếng của khay đựng mẫu. Điện di trong ống vi mao quản 80 cm x 50 m chứa POP- 4TM. Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection v2.0, Seqscape v2.5 và BioEdit v7.0.5. 2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli Sau khi plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa h-tPA được biến nạp thành công vào tế bào biểu hiện E.coli chủng BL21, protein tái tổ hợp được tiến hành biểu hiện và kiểm tra theo các bước sau: - Chọn một khuẩn lạc (E. coli BL21) nuôi lắc ở 200 v/p trong 5ml LB lỏng có bổ sung Amp (100g/ml) ở 37oC qua đêm; - Ngày tiếp theo, hút 2ml dịch vi khuẩn trên vào 100 ml LB lỏng có bổ sung Amp (100g/ml). Tiếp tục nuôi lắc ở 200 v/p ở 37oC đến OD600= 0,6- 0,8; - Cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG nồng độ 1mM. (Tỷ lệ 100 l IPTG cho 100ml dịch nuôi). Để tế bào tiếp tục sinh trưởng trong 3h; Kiểm tra biểu hiện: hút 1ml dung dịch nuôi cấy sang ống eppendoft mới. Ly tâm thu tế bào và bổ sung 100 µl loading dye. Voltex phá tế bào, biến tính protein trong 5 phút ở 95oC; - Dùng 10l mẫu để điện di SDS-PAGE cùng với thang chuẩn protein và mẫu đối chứng âm là dịch phá màng của E.coli BL21 và dịch phá màng E.coli BL21chứa vector rỗng được cảm ứng IPTG; - Phần dịch nuôi cấy còn lại được ly tâm thu tế bào. Giữ tế bào ở -20oC chờ bước tinh chế protein. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA 3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hoá h-tPA bằng kỹ thuật PCR Gen mã hóa h-tPA sử dụng trong nghiên cứu đã được tạo dòng trong vector pUC18. Để kiểm tra cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành xác định trình tự cDNA mã hóa h-tPA trong vector pUC18 sử dụng cặp mồi M13, sau đó trình tự này được phân tích và so sánh với trình tự NM000930 trên Ngân hàng Gen Quốc Tế. Kết quả phân tích và so sánh cho thấy, trình tự cDNA trong vector pUC18 có độ tương đồng tới 99% với trình tự so sánh, các điểm đột biến giữa h-tPA với trình tự NM000930 không làm thay đổi trình tự acid amin. Trình tự bao gồm đầy đủ các thành phần cần thiết cho biểu hiện gen như mã mở đầu, mã kết thúc, đúng khung đọc... Sau khi xác định trình tự cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành PCR với hai cặp mồi đặc hiệu và khuôn là vector pUC18 tái tổ hợp để tạo dòng cDNA này trong vector biểu. Hai cặp mồi đã được chúng tôi thiết kế mang các trình tự nhận biết của enzyme hạn chế để sử dụng cho các quá trình ghép nối gen và kiểm tra sản phẩm. Việc thiết kế thêm trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế vào mồi tuân theo một số nguyên tắc như trình tự nhận biết chỉ có một vị trí trong vùng gắn đa vị của vector và không có mặt trong gen cần tạo dòng; số nucleotide phía ngoài trình tự nhận biết từ 3- 6 nucleotide nhằm bảo vệ các trình tự này và giúp các enzyme cắt tốt hơn. Trong nghiên cứu này, đối với vector pGEX6p1 chúng tôi sử dụng hai enzyme là BamHI và XhoI, vì chúng có mặt trong vùng cắt gắn đa vị của vector biểu hiện pGEX6p1; đối với vector pET21a(+), chúng tôi đã sử dụng hai enzyme NdeI và XhoI. Các enzyme này đều không có điểm cắt trên cDNA mã hoá h-tPA. Trình tự hai cặp mồi như sau: Cặp 1: htPA-NdeI F2: 5’-GTG AAG CAC ATA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G-3’ htPA-XhoI R3: 5’-GTG GTG CTC GAG CGG TCG CAT GTT GTC-3’ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Cặp 2: htPA-BamHI F2: 5’-ATT CCG TGG ATC CAC CAT GGA TGC AAT GAG G-3’ htPA-XhoI R4: 5’-GTG GTG CTC GAG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’ Kỹ thuật PCR là phương pháp được sử dụng nhằm nhân một đoạn DNA nằm giữa hai vùng đã biết trình tự. Hai đoạn oligonucleotide được sử dụng như mồi cho một loạt phản ứng tổng hợp được xúc tác bởi enzyme DNA polymerase. Các đoạn oligonucleotide có trình tự khác nhau và bổ sung cho trình tự nằm ở hai đầu của trình tự DNA mẫu được nhân lên. DNA mẫu bị biến tính bởi nhiệt độ trong sự có mặt của hai đoạn oligonucleotide và bốn loại dNTPs. Hỗn hợp phản ứng sau đó được hạ xuống tới nhiệt độ cho phép mồi oligonucleotide bám vào trình tự đích, tiếp theo mồi được kéo dài bởi DNA polymerase. Số chu kỳ được nhắc lại nhiều lần từ 25 đến 35 chu kỳ. Bởi vì sản phẩm của một vòng của quá trình nhân là mẫu cho quá trình tiếp theo, mỗi chu kỳ cho hai sản phẩm DNA nên số lượng sản phẩm là phản ứng mũ một đoạn đôi DNA được xác định bởi đầu cuối 5’ của đoạn mồi oligonucleotide và chiều dài được xác định bởi khoảng cách giữa hai mồi. Hai cặp mồi này có thể được thiết kế theo yêu cầu của nghiên cứu. Việc nhân gen bằng PCR từ vector dễ hơn so với nhân gen từ hệ gen nên thường thu được lượng sản phẩm lớn, đặc hiệu do số điểm bám của mồi trên vector tái tổ hợp ít, tỷ lệ bám mồi cao... Sử dụng cặp mồi đặc hiệu, chúng tôi đã tiến hành phản ứng nhân cDNA mã hóa h-tPA. Thành phần và chu trình nhiệt được trình bày ở phần 2.2.3. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Hình 3.1. Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA M: Marker 1kb 1: Sản phẩm PCR h-tPA với cặp mồi 1 2: Sản phẩm PCR h-tPA với cặp mồi 2 Kết quả điện di đồ cho thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước phân tử khoảng 1,7kb, kích thước này phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết. Băng chính đều sáng, đậm, rõ nét và sẽ được tinh sạch trước khi sử dụng để tiến hành ghép nối gen. 3.1.2. Ghép nối cDNA mã hoá h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) 3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hoá h-tPA bằng enzyme hạn chế Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi đã tiến hành chiết và làm sạch sản phẩm qua cột theo kit Wizard® SV Gel and Clean- Up System. Hệ thống này dựa trên khả năng kết hợp của DNA với màng silica trong sự có mặt của hỗn hợp muối, hệ thống màng có thể kết hợp với 40µg DNA và cho phép thu hồi sản phẩm PCR trong 15 phút. Quá trình tinh sạch này giúp loại bỏ khỏi sản phẩm PCR các thành phần không mong muốn như các đoạn DNA vệ tinh, các NTPs... Sau khi tinh sạch, hai mẫu sản phẩm PCR được xử lý bằng hai cặp enzyme hạn chế tương ứng là Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling or grammar Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 NdeI/XhoI và BamHI/XhoI. Thành phần và quá trình xử lý được trình bày ở mục 2.2.4. Phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. 3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế Sau khi nghiên cứu tài liệu và điều kiện vật chất phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành biểu hiện protein h-tPA trên vi khuẩn E. coli chủng BL21 với hai vector biểu hiện là pET21a(+) và pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA. Vector pET21a(+) là vector mạnh để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli. Gen đích được tạo dòng trong plasmid pET21a(+) được điều khiển bởi tín hiệu dịch mã tốt của phage T7, biểu hiện dưới sự tổng hợp của T7 RNA polymerase trong tế bào chủ. Vector pET21a(+) là vector mang trình tự T7 ở đầu N và trình tự đuôi His ở đầu C. Vector này mang chỉ thị chọn lọc là gen kháng kháng sinh (kháng Amp và Kanamycin). Vùng tạo dòng/ biểu hiện được điều khiển bởi T7 polymerase. Trình tự này được xác định, giải trình tự khi sử dụng mồi đầu T7. Hệ thống biểu hiện này được cảm ứng bởi IPTG hoặc lactose trong quá trình nuôi cấy. Vector pGEX6p1 điều khiển tổng hợp protein ngoại lại bởi promoter tac, promoter này được cảm ứng bởi isopropyl b-D thiogalactoside (IPTG). Vector pGEX6p1 được thiết kết gồm có một gen lacIq, sản phẩm gen lacIq là protein ức chế kết hợp với vùng operator trên promoter tac, làm ngăn cản quá trình biểu hiện cho tới khi cảm ứng bởi IPTG, qua đó điều khiển quá trình biểu hiện của gen được thêm vào. Đầu 3’ vùng đa nối có chứa đoạn gen mã hoá Glutathione S- Transferase - GST, đây là một protein giúp quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp dễ hơn. Ngoài ra, vector pGEX6p1 có một số ưu điểm như: mức độ biểu hiện cao, điều kiện tinh sạch protein đơn giản, ảnh hưởng của kháng nguyên và chức năng của protein là nhỏ nhất. Quá trình cắt mở vòng hai vector cũng sử dụng hai cặp enzyme là NdeI/XhoI và BamHI/XhoI tương tự như đối với sản phẩm PCR. Thành phần và quá trình xử lý đối với vector pET21a(+) và pGEX6p1 được trình bày ở phần 2.2.4. Sau khi cắt với enzyme, vector được xử lý với phosphatase để loại nhóm phosphate ra khỏi đầu 5’, làm giảm quá trình tự nối của vector. Phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Hình 3.2. Kết quả xử lý cDNA mã hóa h-tPA và các vector biểu hiện bằng enzyme hạn chế Kết quả điện di trên hình 3.2 cho thấy sản phẩm cắt tương đối sạch và đủ điều kiện tiến hành phản ứng ghép nối. 3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hoá h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) Chúng tôi đã tiến hành ghép nối cDNA mã hóa h-tPA với các vector pET21a(+) và pGEX6p1 tạo các vector tái tổ hợp mang gen mã hoá h-tPA. Do cả sản phẩm PCR và vector đều đã được xử lý bằng hai enzyme tương ứng nên dưới tác dụng của enzyme T4 ligase, sản phẩm PCR và vector có thể nối lại với nhau tạo vector tái tổ hợp. Thành phần và phản ứng ghép nối giữa vector và sản phẩm PCR đã trình bày ở phần 2.2.5. Phản ứng ghép nối được tiến hành ở 16oC, qua đêm. 3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA 3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt Sản phẩm lai giữa vector và sản phẩm PCR được biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt trong 70 giây ở 42oC. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ ml) ở 37°C qua M: Marker 1kb 1: Vector pGEX6p1/BamHI+XhoI 2: Vector pET21a(+)/NdeI+XhoI 3: cDNA h-tPA/NdeI+XhoI 4: cDNA h-tPA/BamHI+XhoI Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling or grammar Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 đêm. Kết quả, chúng tôi đã thu được rất nhiều khuẩn lạc, là các dòng tế bào vi khuẩn khác nhau. Do trong môi trường có chất kháng sinh nên chỉ có những khuẩn lạc nào mang vector mới mọc được, các dòng tế bào vi khuẩn này gồm 2 loại tế bào khác nhau: tế bào mang vector nhưng không mang đoạn chèn và tế bào mang vector và đoạn chèn. Vì vậy để xác định dòng tế bào nào mang vector tái tổ hợp, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc thông qua tách chiết plasmid, xử lý bằng enzyme hạn chế, PCR và xác định trình tự. 3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA  Tách chiết DNA plasmid Plasmid được tách chiết nhằm xác định vector nào mang đoạn chèn và vector nào không mang đoạn chèn. Phương pháp tách plasmid được trình bày ở mục 2.2.7. Để tách chiết DNA plasmid, một số khuẩn lạc được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp ở 37oC từ 12- 14h. Phương pháp tách chiết plasmid gồm 3 bước chính: thu nhận và phân giải tế bào, làm sạch plasmid và kết tủa DNA. Dung dịch I (sol I) có tác dụng rửa sạch tế bào, dung dịch II (sol II) có chứa SDS và NaOH có tác dụng phá màng tế bào và ức chế hoạt động của nuclease, không cho chúng phân giải DNA do Mg2+ (một nhân tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease) bị liên kết với EDTA, khi cho tiếp dung dịch III (sol III) có chứa axetate và axetic acid thì pH môi trường chuyển thành acid yếu gần với điểm đẳng điện của DNA, vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và dễ dàng tách được nhờ ly tâm. Do trong tế bào vi khuẩn có chứa hai dạng DNA là DNA nhiễm sắc thể và DNA plasmid nên việc tách và tinh sạch DNA plasmid là rất quan trọng, DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dụng dịch I, II, III. Do DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn và liên kết chặt chẽ với protein nên khoảng thời gian ngắn giữa các lần thêm dung dịch không kịp thoát ra ngoài. DNA plasmid thu được sau khi tách chiết từ tế bào vi khuẩn thường tồn tại ở 3 dạng: dạng siêu xoắn được tạo ra do liên kết hydro giữa một số phần của phân tử DNA plasmid hay do lực hút tĩnh điện giữa các phần của phân tử với nhau, dạng vòng mở do bị đứt gãy một mạch đơn của chuỗi DNA mạch kép và dạng mạch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 thẳng khi cả hai mạch DNA dều bị đứt gãy. Dạng siêu xoắn có cấu trúc không gian gọn nên khi điện di chúng thường chạy nhanh nhất, tiếp đến là mạch thẳng và cuối cùng là mạch vòng. DNA sau đó được hoà tan trong dung dịch RNase 0,01mg/ml nhằm loại bỏ RNA và được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Theo lý thuyết khi một DNA plasmid mang gen ngoại lai, chúng sẽ có kích thước bằng tổng kích thước của plasmid và kích thước của gen ngoại lai. Do vậy trong điện di đồ, chúng sẽ chạy chậm hơn (thấp hơn) so với đối chứng âm (các plasmid chưa mở vòng), dựa vào đó chúng ta có thể kết luận sơ bộ được những plasmid này có kích thước lớn hơn và có thể chúng mang gen ngoại lai. Hình 3.3. Chọn dòng pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA) Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling or grammar Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 ĐC: Đối chứng âm 1- 7: DNA plasmid của các dòng pGEX6p1 Kết quả điện di cho thấy ở tất cả các đường chạy đều xuất hiện 2 băng chạy trước rõ nét hơn, điều đó chứng tỏ lượng DNA plasmid của chúng tôi thu được tồn tại ở dạng siêu xoắn nhiều hơn dạng thẳng. Hình 3.3 cho thấy, đối với các dòng mang vector pGEX6p1, dòng 1 và 3 (ký hiệu pGEX/htPA p1 và pGEX/htPA p3) là hai dòng có kích thước lớn hơn các dòng khác và lớn hơn so với đối chứng âm; do vậy rất có thể các dòng này mang cDNA mã hóa h-tPA. Đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có thể mang cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3). Formatted: Centered Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Hình 3.4. Chọn dòng pET21a(+) mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA) ĐC: Đối chứng âm (vector pET21a(+) không mang h-tPA) 1- 5: DNA plasmid của các dòng pET21a(+) Tương tự, đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có kích thước lớn hơn các dòng khác và đối chứng âm; do vậy rất có thể các dòng này mang cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3). Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling or grammar Formatted: Space After: 0 pt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái