Luận văn Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dõ hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [centella asiatica (l.) urban] họ hoa tán (apiaceae)

125,29 (C-12), 74,89 (C-3), 69,93 (C-2), 67,22 (C-23), 65,27 (C-6), 47,77, 47,48, 45,89, 43,05, 42,36, 41,26, 40,54, 39,75, 39,00, 38,72, 37,31 (2C), 30,85, 27,75, 24,55, 23,48, 23,39, 23,03, 22,75, 22,13, 21,10, 20,99, 20,79, 20,69, 18,61, 18,55, 17,05, 15,18 (2C). 180: 6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-amide Acid 175 (630 mg, 1 mmol) thu 180 (553 mg, 88%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 166-169 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1041, 1242, 1373, 1459, 1660, 1736, 2935, 3478. (+) ESI-MS m/z: 652 [M+Na] + (100). 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,87 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,96 (3H, br s), 1,07 (3H, s), 1,11 (3H, s), 1,29 (3H, s), 1,47 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,06 (3H, s), 3,73 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3,93 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,36 (1H, br s, H-6), 5,02 (1H, d, J = 10,0 Hz, H- 3), 5,25 (1H, m, H-2), 5,33 (1H, br s, H-12), 5,83 (1H, br s, -NH2), 6,34 (1H, br s, - NH2). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 181,36 (C-28), 170,80, 170,39 (2C), 138,99 (C-13), 125,56 (C-12), 74,88 (C-3), 69,87 (C-2), 67,45 (C-6), 65,34 (C-23), 54,38 (C-18), 47,79, 45,95, 43,05, 42,47, 39,80, 39,04, 38,57, 37,35, 37,08, 30,87, 30,71, 27,79, 25,60, 24,75, 23,50, 23,16, 21,45, 21,07, 20,86, 20,76, 18,67, 18,56, 18,29, 17,11, 15,35. 181: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 181 (557 mg, 75%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 145-148 °C. (+) ESI-MS m/z: 743 [M+H] + (100). 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,10 (3H, s), 1,14 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,51 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,98 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 2,69 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1‟), 3,12-3,15 (2H, m, H-7‟), 3,77 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,92 (1H, d, J = 11,5 Hz, H23b), 4,32 (1H, br s, H-6), 4,98 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,26 (1H, dt, J = 5,0, 11,0 Hz, H-2), 5,23-5,29 (1H, br s, H-12). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 180,02 (C-28), 172,56, 172,27, 172,20, 139,63 (C-13), 126,83 (C-12), 76,57 (C-3), 71,17 (C-2), 67,87 (C-6), 66,29 67 (C-23), 54,26 (C-18), 49,85, 47,52, 46,98, 43,81, 43,75, 42,26, 40,91, 40,74, 41,31, 40,30, 40,17, 38,79, 38,66, 31,95, 30,30 (2C), 28,94, 28,22, 28,18, 27,92, 25,21, 24,44, 24,04 (2C), 21,56, 20,99, 20,74 (2C), 19,14, 19,03, 17,69, 15,74. 182: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 182 (523 mg, 68%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 140-143 °C. (+) ESI-MS m/z: 771 [M+H] + (100). 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,11 (3H, s), 1,16 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,50 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,17 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-18), 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1‟), 3,09-3,20 (2H, m, H-9‟), 3,77 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23 a), 3,92 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,32 (1H, br s, H-6), 4,98 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,26 (1H, dt, J = 5,0, 10,5 Hz, H-2), 5,41 (1H, br s, H- 12). 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 179,99 (C-28), 172,54, 172,23 (2C), 139,68 (C-13), 126,79 (C-12), 76,51 (C-3), 71,19 (C-2), 67,86 (C-6), 66,28 (C-23), 54,29 (C-18), 46,95, 43,81, 43,74, 41,73, 40,91, 40,74, 40,27, 40,16, 38,77, 38,66, 31,94, 31,62, 31,38, 30,63, 30,57, 30,47, 30,44, 30,39, 30,31, 28,92, 28,29, 27,79, 24,44, 24,25, 24,04, 24,00, 21,56, 21,00, 20,74, 20,73, 19,45, 19,09, 17,69, 15,75. 183: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-decylamine Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 183 (613 mg, 78%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 138-141 °C. (+) ESI-MS m/z: 785 [M+H] + (100). 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,92 (3H, d, J = 7,0 Hz), 0,93 (3H, s), 0,98 (3H, br s), 1,13 (3H, s), 1,27 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,01 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,13-2,39 (1H, m, H- 1‟), 2,55-2,57 (1H, m, H-1‟), 3,02-3,09 (1H, m, H-10‟), 3,25-3,22 (1H, m, H-10‟), 3,61 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23a), 3.90 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-23b), 4,23 (1H, s, H- 6), 5,14 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,30 (1H, dt, J = 4,0, 11,0 Hz, H-2), 5,56 (1H, br s, H-12), 5,89-5,92 (1H, m, -NH). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 180,00 (C-28), 172,55, 172,25 (2C), 139,71 (C-13), 126,83 (C-12), 76,55 (C-3), 71,18 (C- 2), 67,88 (C-6), 66,29 (C-23), 54,31 (C-18), 47,55, 46,98, 43,83, 43,76, 41,97, 41,31, 40,94, 40,79, 40,30, 40,18, 40,01, 38,79, 38,74, 38,68, 32,02, 31,95, 30,71, 30,65, 30,52, 30,30, 28,94, 28,32, 27,85, 26,41, 25,22, 24,46, 24,03, 21,55, 20,98, 20,72 (2C), 19,16, 19,09, 17,68, 15,75. 184: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-glycine ethyl ester 68 Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 184 (600 mg, 84%). Chất rắn, màu trắng. (+) ESI- MS m/z: 716 [M+H] + . 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,99 (3H, br s), 1,10 (3H, s), 1,14 (3H, s), 1,26 (3H, t, J = 7,5 Hz), 1,31 (3H, s), 1,51 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,04 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,15 (1H, d, J = 10,0 Hz, H- 18), 3,19-3,20 (1H, m, H-1‟a), 3,29-3,30 (1H, m, H-1‟b), 3,63-3,68 (2H, m, H-2, - OH), 3,77 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23a ), 3,92 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-23b), 4,12 (2H, q, J = 7,0 Hz, H-1‟‟), 4,32 (1H, br s, H-6), 5,08 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,26 (1H, t-like, H-12), 5,41 (1H, t-like, -NH). 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,56 (C-28), 172,57, 172,28, 172,19, 177,40, 139,13 (C-13), 127,26 (C-12), 76,59 (C-3), 71,17 (C-2), 67,96 (C-6), 66,29 (C-23), 62,20 (C-1‟‟), 54,28 (C-18), 48,66, 48,49, 43,75, 43,69, 41,19, 40,85, 40,34, 40,12, 38,71, 38,64, 38,40, 31,88, 31,62, 28,87, 26,43, 25,34, 24,38, 24,11, 21,55, 20,98, 20,73, 18,84, 18,53, 17,71, 15,72, 14,49. 185: N-(6β-hydroxy-2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-imidazol Acid 175 (630 mg, 1,0 mmol) thu 185 (550 mg, 81%). Chất rắn, màu trắng. (-) ESI- MS m/z: 715 [M+Cl] - , (+) ESI-MS m/z: 681 [M+H] + . 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,69 (3H, s), 0,88 (3H, s), 0,91 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,00 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,09 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,97 (3H, s), 2,00 (3H, s), 2,06 (3H, s), 2,47 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 3,57 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23a), 3,83 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-23b), 4,35 (1H, br s, H-6), 5,06 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 5,16 (1H, dt, J = 4,5, 11,0 Hz, H-2), 5,24 (1H, t-like, H-12), 7,04 (1H, s, H-4‟), 7,52 (1H, s, H-2‟), 8,24 (1H, s, H-5‟). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 176,17 (C-28), 172,55, 172,27, 172,16, 138,68 (C-13), 138,05 (C-2‟), 129,87 (C-5‟), 127,69 (C-12), 119,37 (C-4‟), 76,57 (C-3), 71,13 (C-2), 67,78 (C-6), 66,27 (C-23), 52,36 (C-18), 47,87, 47,06, 43,74, 43,44, 41,12, 41,00, 40,51, 39,98, 39,77, 38,72, 36,48, 31,45, 31,29, 28,84, 28,65, 26,29, 25,67, 24,36, 23,98, 20,97, 20,72, 18,93, 18,40, 17,62, 15,70. 69 Quy trình chung thủy phân nhóm acetyl Chất 177-185 (1 mmol) trong MeOH (10 mL) đƣợc thêm dung dịch KOH 4N (2 mL) và khuấy ở nhiệt độ phòng 16 giờ. Dung môi đƣợc cất loại dƣới áp suất giảm, cặn còn lại đƣợc hoà tan trong H2O (15 mL) và acid hóa với HCl 5% đến pH ≈ 4. Hỗn hợp đƣợc chiết với CH2Cl2 (3x50 mL). Dịch chiết đƣợc rửa với nƣớc, làm khan bằng Na2SO4 và cất loại dung môi đến khô. Sản phẩm thu đƣợc qua sự tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (95/5). 186: N,N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol 177 (250 mg, 0,122 mmol) thu đƣợc 186 (60 mg, 83%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 219-221 °C. (+) ESI-MS m/z: 592 [M+H] + (100). 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz)  (ppm): 0,83 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,90 (6H, s), 0,93 (3H, s), 0,99 (3H, s), 1,28 (3H, s), 2,34 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 3,10–3,11 (2H, m, H-1‟), và 3,19-3,20 (2H, m, H-1‟), 3,47-3,49 (4H, m, H-2‟), 4,00-4,04 (3H, m, H-23a, H-23b,-OH), 4,16-4,17 (1H, m, H-2), 4,24 (1H, br s, H-6), 4,31 (1H, br s, H-3), 4,72 (2H, br s, -OH), 5,12 (1H, br s, H-12). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz)  (ppm): 175,12 (C-28), 130,00 (C-13), 125,00 (C-12), 75,77 (C-3), 67,48 (C-2), 65,96 (C-6), 63,72 (C-23), 59,78 70 (C-2‟), 58,89 (C-2‟), 51,53 (C-18), 49,20, 48,93, 47,54, 47,40, 47,17, 46,81, 46,64, 43,12, 38,28, 36,97, 36,87, 32,77, 30,19, 30,04, 23,88, 23,06, 21,18, 20,77, 18,28, 18,15, 18,10, 17,48, 14,99, 14,90. 187: N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-propanol 178 (240 mg, 0,35 mmol) thu đƣợc 187 (145 mg, 75 %). Chất rắn, màu trắng. (+) ESI-MS m/z: 562 [M+H] + . IR (KBr) ν* (cm-1): 1051, 1147, 1378, 1451, 1584, 1640, 2922, 3379, 3500. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,13 (3H, s), 1,42 (3H, s), 3,16-3,22 (1H, m, H-1‟), 3,28-3,31 (1H, m, H-1‟), 3,32-3,33 (H-3‟ chồng lấp), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,59-3,63 (3H, m, H-3, H-23b, H-3‟), 3,73-3,76 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6), 5,41 (1H, t, J = 4,0 Hz, H-12), 7,28 (t, J = 5,5 Hz, - NH), 7,36 (t, J = 5,5 Hz, -NH). 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,38 (C-28), 139,41 (C-13), 127,38 (C-12), 78,19 (C-3), 69,67 (C-2), 68,43 (C-6), 65,91 (C-23), 61,02 (C-3‟), 54,37 (C-18), 50,24, 44,80, 43,93, 40,91, 40,36, 40,13, 38,82, 38,57, 38,36, 32,90, 31,62, 28,94, 24,19, 24,14, 23,99, 21,56, 19,13, 19,05, 17,70, 15,24. 188: 2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-amide Chất 180 (429 mg, 0,68 mmol) thu 188 (240 mg, 70%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 270-273 °C. IR (KBr) ν* (cm-1): 1047, 1374, 1454, 1557, 1648, 2864, 2926, 3245, 3422. 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, s), 1,13 (3H, s), 1,17 (3H, s), 1,42 (3H, s), 2,13 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-18), 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,79 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6), 5,40 (1H, t, J = 4,0 Hz, H-12). 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 183,65 (C-28), 78,19 (C-3), 69,69 (C-2), 68,39 (C-6), 65,91 (C-23), 54,63 (C-18), 50,26, 47,59, 44,80, 43,96, 41,21, 40,97, 40,34, 39,99, 39,82, 38,74, 38,56, 38,51, 31,96, 31,62, 28,98, 26,48, 25,34, 24,49, 24,10, 21,57, 19,21, 19,07, 17,68, 15,24. 189: N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine 181 (200 mg, 0,27 mmol) thu đƣợc 189 (113 mg, 68%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 150-153 °C. (+) ESI-MS m/z: 617 [M+H] + (100). 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,08 (3H, s), 1,10 (3H, s), 71 1,13 (3H, s), 1,40 (3H, s), 2,16 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-18), 2,95 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1‟), 3,12-3,19 (2H, m, H-7‟), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,74 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,30 (H-3 trùng với dung môi ), 4,55 (1H, br s, H-6), 5,41 (1H, br s, H-12), (7,14 (t, J = 5,5 Hz) và 7,20 (t, J = 5,5 Hz) – NH, đồng phân). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,28 (C-28), 139,70 (C-13), 127,25 (C-12), 78,16 (C-3), 69,86 (C-2), 68,39 (C-6), 65,90 (C-23), 54,39 (C-18), 50,20, 47,61, 44,80, 43,98, 43,59, 41,22, 40,91, 40,75 (2C), 40,34, 40,15, 38,53, 31,96, 31,62, 30,24, 29,87, 28,94, 28,59, 27,94, 27,39, 26,47, 24,52, 24,09, 21,54, 19,33, 19,26, 19,09, 17,68, 15,25. 190: N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine 182 (125 mg, 0,162 mmol) thu đƣợc 190 (68 mg, 65%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 145-148 °C. (+) ESI-MS m/z: 645 [M+H] + (100). 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,13 (3H, s), 1,42 (3H, s), 2,16 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18), 2,76 (2H, t, J = 7,0 Hz, H-1‟), 3,09-3,18 (2H, m, H-9‟), 3,32 (1H, d, J = 10,0 Hz, H-3), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,74-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6), (5,41 (br s) và 5,44 (br s), - NH, đồng phân). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,11 (C-28), 139,71 (C-13), 127,15 (C-12), 78,16 (C-3), 69,65 (C-2), 68,35 (C-6), 65,91 (C-23), 54,39 (C-18), 50,22, 47,57, 44,78, 43,98, 41,81, 41,21, 40,92, 40,74, 40,29, 40,13, 38,77, 38,51, 31,95, 31,61, 30,57, 30,53, 30,42 (2C), 30,35, 30,27, 28,92, 28,25, 27,78, 25,27, 24,52, 24,10, 21,56, 19,32, 19,30, 17,68, 15,26. 191: N-(2α,3β,6β,23-tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-decylamine 183 (150 mg, 0,191 mmol) thu đƣợc 191 (82 mg, 65%). Chất rắn, màu trắng. Mp = 142-145 °C. (+) ESI-MS m/z: 659 [M+H] + (100). 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,94 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,99 (3H, d, J = 6,0 Hz), 1,08 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,13 (3H, s), 1,42 (3H, s), 2,15 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-18), 2,78 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-1‟), 3,09-3,19 (2H, m, H-10‟), 3,33 (H-3, trùng dung môi), 3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23a), 3,60 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b), 3,73-3,78 (1H, m, H-2), 4,40 (1H, br s, H-6), (5,41 (br s, 1H, -NH) và 5,44 (br s, -NH), đồng phân). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz)  (ppm): 180,14 (C-28), 139,69 (C-13), 127,16 (C-12), 78,16 (C-3), 72 76,55 (C-2), 69,88 (C-6), 68,35 (C-23), 54,36 (C-18), 50,23, 47,70, 44,79, 43,75, 43,81, 41,75, 40,91, 40,70, 40,31, 40,17, 38,81, 38,66, 38,53, 33,52, 31,94, 31,62, 31,55, 30,36, 30,27, 28,93, 28,31, 27,75, 26,40, 25,20, 24,52, 24,09, 24,00, 21,55, 20,97, 20,72, 17,68, 15,73. 3.4. Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro Phép thử đƣợc thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội. Các dòng tế bào Các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC) gồm: ung thƣ biểu mô biểu bì miệng KB (CCL -17TM), ung thƣ gan Hep G2 (HB - 8065TM), ung thƣ phổi LU-1 (HTB - 57TM), ung thƣ vú MCF-7 (HTB - 22TM) và ung thƣ da SK-Mel 2 (HTB - 68TM). Nguyên lí Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2 - yl )- 2, 5 - diphenyltetrazolium) đƣợc mô tả lần đầu tiên bởi tác giả Tim Mosman, 1983. Đây là phƣơng pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím đen) bởi hoạt động của enzyme dehydrogenase trong ty thể. Sản phẩm formazan đƣợc hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bƣớc sóng 540 nm. Giá trị OD phản ánh số lƣợng tế bào sống. Nếu chất thử có hoạt tính gây độc tế bào thì số lƣợng tế bào sống giảm và giá trị OD giảm. Giá trị thể hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào). Chuẩn bị thí nghiệm Dòng tế bào đƣợc lƣu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trƣờng dinh dƣỡng nhƣ DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine Serum) và một số thành phần thiết yếu khác. Tế bào đƣợc nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 37 oC, vô trùng tuyệt đối) và đƣợc cấy chuyển 1-2 lần trƣớc khi thí nghiệm. Tế bào phát triển ở pha log sẽ đƣợc sử dụng để thử độc tính. Mẫu thử đƣợc hòa tan bằng dung môi DMSO với nồng độ ban đầu là 20 mg/ml. Tiến hành pha loãng 2 bƣớc trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao 73 xuống thấp lần lƣợt là 2564, 640, 160, 40 và 10 µg/ml. Nồng độ chất thử trong đĩa thử nghiệm tƣơng ứng là 128, 32, 8, 2 và 0,5 µg/ml. Chất tham chiếu Ellipticine pha trong DMSO với nồng độ 0,01mM. Tiến hành thí nghiệm Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào. Tiếp đó, pha tế bào bằng môi trƣờng sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 3-5x104 tế bào/ml tùy theo từng dòng tế bào). Lấy vào mỗi giếng 10 µl chất thử đã chuẩn bị ở trên và 190 µl dung dịch tế bào. Đối chứng dƣơng của thí nghiệm là môi trƣờng có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trƣờng nuôi cấy. Đĩa thí nghiệm đƣợc ủ ở điều kiện tiêu chuẩn trong 72 giờ. Mỗi giếng thí nghiệm đƣợc tiếp tục ủ với 10 µl MTT (5 mg/ml) trong 4h. Sau khi loại bỏ môi trƣờng, tinh thể formaran đƣợc hòa tan bằng 100 µl DMSO 100%. Kết quả thí nghiệm đƣợc xác định bằng giá trị OD đo ở bƣớc sóng 540 nm trên máy quang phổ Genios Tecan. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Xử lý kết quả thực nghiệm Giá trị IC50 đƣợc xác định thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển và phần mềm máy tính Rawdata. % ức chế tế bào = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng (-)) x 100% (Trong đó, HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử thấp ở nồng độ thấp, HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp ). Giá trị IC50 ≤ 20 µl/ml (với dịch chiết thô) và IC50 ≤ 20 µM (với chất sạch) đƣợc đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào đáng quan tâm, có khả năng ức chế hoặc diệt tế bào ung thƣ. Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm ± độ lệch chuẩn (SD) [111, 112, 113]. 3.4.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Thử hoạt tính Sinh học – Viện Hóa học kết hợp với Phòng Thử nghiệm Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học. 74 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chất asiatic acid trên mô hình chuột BALB/c gây độc gan bằng paracetamol thông qua các chỉ tiêu: Nghiên cứu sự thay đổi chỉ số AST và ALT (Sự thay đổi enzyme chức năng gan) Nghiên cứu sự thay đổi khối lƣợng gan Nghiên cứu sự thay đổi hàm lƣợng MDA trong gan Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Hoá chất: Thiobarbituric acid (TBA, Sigma), potassium chloride solution (KCl), acetic acid (pH=3,5) and sodium dodecyl sulfate (SDS), các hóa chất cần thiết khác v.v. Dụng cụ: panh, kéo, sirange, kim uống, đĩa 96 giếng Động vật: chuột BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, đƣợc nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học. Chuột đƣợc cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nƣớc uống tự do. Hoạt tính bảo vệ gan đƣợc thử nghiệm tại Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo mô hình gây độc gan thực nghiệm bằng paracetamol [114]. Việc làm tiêu bản vi thể tế bào gan, quan sát tiêu bản và nhận dạng những thay đổi đƣợc thực hiện tại Bộ môn giải phẫu bệnh, Bệnh viện 103. Chuột nhắt trắng thuần chủng BALB/c, không phân biệt giống, khỏe mạnh có khối lƣợng 22±2 g đƣợc chia thành 5 lô (6 con/lô) nhƣ sau: Lô 1 (đối chứng sinh lý): uống nƣớc cất (0,2-0,3 ml/ con/ ngày). Lô 2 (đối chứng bệnh lý): uống nƣớc cất (0,2-0,3 ml/ con/ lô ngày) + paracetamol Lô 3 (đối chứng tham khảo): uống silymarin liều 50 mg/ kgP/ ngày. Lô 4 (thử mẫu): uống asiatic acid liều 20mg /kgP/ngày. Lô 5 (thử mẫu): uống asiatic acid liều 4mg /kgP/ ngày. Chuột đƣợc uống liên tục 7 ngày trƣớc và 2 ngày sau khi gây độc cho gan, mỗi ngày uống 1 lần vào buổi sáng. Ngày thứ 7 sau uống mẫu 1 giờ, chuột nhịn đói 14-16 giờ trƣớc đó, gây độc gan bằng cách cho uống paracetamol đƣợc pha trong dung dịch CMC 1% với thể tích 0,2ml/kg (chỉ cho các lô 2,3,4,5) với liều 400mg/ kgP một lần duy nhất. Sau 48 giờ uống paracetamol, lấy máu làm xét nghiệm hóa sinh chức năng gan qua định lƣợng AST, ALT, quan sát đại thể và vi thể mô bệnh học của gan, xác định khối lƣợng gan và hàm lƣợng MDA (malon dialdehyde) trong gan. Hàm lƣợng MDA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp so màu. 75 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập chất 4.1.1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ Chí Minh (RMHCM) Cao chiết n-BuOH của rau má RMHCM đƣợc tách theo phƣơng pháp trình bày ở mục 3.2.1. Bằng cách kết hợp các phƣơng pháp sắc ký, tổng cộng có 6 hợp chất đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc gồm: stigmasterol (43), β-sitosterol (44), asiatic acid (1), madecassic acid (10), hỗn hợp stigmasterol glucoside và β-sitosterol glucoside (1:1) (144), và madecassoside (14). Điều chú ý ở đây là hợp chất asiaticoside có hàm lƣợng rất ít trong mẫu RMHCM.  Hợp chất Stigmasterol (43) Hợp chất stigmasterol (43) đƣợc phân lập dƣới dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 169-171oC. Phổ 1H-NMR cho thấy có hai nhóm methyl với các tín hiệu singlet tại H = 0,70 ppm (3H, s, H-18) và H = 1,01 ppm (3H, s, H-19), ba nhóm methyl gắn với – CH với các tín hiệu doublet tại: H = 0,79 ppm (3H, d, J = 6,4 Hz, H-26), 0,84 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-27), 1,02 (3H, d, J = 6,7 Hz, H-21) và một nhóm methyl gắn với – CH2 với tín hiệu triplet tại: H = 0,80 ppm (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29). Ở vùng trƣờng thấp cho tín hiệu cộng hƣởng của một olefin proton  = 5,35 ppm (1H, br s, H-6) và hai olefin proton  = 5,02 ppm (1H, dd, J = 8,7, 15,2 Hz, H-22) và 5,16 (1H, dd, J = 8,6, 15,2 Hz, H-23), một proton cacbinol:  = 3,51 ppm (1H, m, H-3) chứng minh cho nhóm β-OH ở vị trí C-3. Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hƣởng của 29 carbon, trong đó có 3 carbon bậc bốn, 11 carbon bậc ba, 9 carbon bậc hai và 6 nhóm methyl. Phổ 13C-NMR cũng cho tín hiệu cộng hƣởng của hai liên kết đôi ở vị trí C-5 = C-6: ( = 140,8 và 121,7) và vị trí C-22 = C-23: ( = 138,3 và 129,3 ppm). 76 Phổ khối ESI-MS cho pic ion tại m/z 395 [M- H2O+H] +. Pic này là pic cơ bản, hình thành do tạo thành dẫn xuất liên hợp (3,5-dien) sau khi phân tử bị tách một phân tử nƣớc. Kết hợp các dữ kiện phổ ESI-MS, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT và so sánh với số liệu trong tài liệu [9] cho phép xác định cấu trúc của hợp chất là stigmasterol.  Hợp chất β-Sitosterol (44) Hợp chất β-sitosterol qua so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chúng với số liệu trong tài liệu [121].  Hợp chất asiatic acid (1) Hợp chất asiatic acid đƣợc phân lập từ cặn chiết n-BuOH dƣới dạng tinh thể màu trắng (CH2Cl2/MeOH), điểm nóng chảy Mp = 222-224 o C. Phổ hồng ngoại: cho đỉnh hấp thụ đặc trƣng của nhóm hydroxyl (3411 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930 và 2866 cm -1 ). Phổ 1H-NMR cho thấy có 6 nhóm methyl trong đó có 4 nhóm methyl gắn với carbon bậc 4 với các tín hiệu singlet tại: 0,72, 0,87, 1,07, 1,16 và hai nhóm methyl gắn với CH với một tín hiệu doublet tại H = 0,92 (J = 6,5 Hz) và một tín hiệu singlet tù tại H = 0,99 ppm. Ngoài ra, trên phổ có tín hiệu một nhóm -CH2 gắn với -OH ở H = 3,29 (d, J = 11,0 Hz, H-23a), H = 3,53 (d, J = 11,0 Hz, H-23b), 2 nhóm hydroxy gắn với -CH ở  = 3,38 (d, J = 9,5 Hz, H- 3) và 3,71 (m, H-2) và 1 tín hiệu của nối đôi ở  = 5,26 (br s, H-12). Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất asiatic acid có mặt của 30 carbon trong đó có 6 nhóm methyl, 9 nhóm carbon bậc 2, 8 nhóm carbon bậc 3 và 7 nhóm carbon bậc 4, nhóm cacboxylic với C = 181,6 ppm và tín hiệu nối đôi C-12 = C-13 ( = 139,8, 126,6 77 ppm). Phổ H-H-COSY cho thấy có sự tƣơng tác giữa hai proton ở H: 3,29 (d, J = 11,0 Hz), 3.53 (d, J = 11,0 Hz) gắn trực tiếp với carbon ở vị trí C-23, proton ở  = 3,38 (J = 9,5 Hz, H-3) tƣơng tác với proton ở  = 3,71 (m, H-2). Phổ HSQC cho thấy rõ giữa H-2 (3,72 ppm) và C-2 (69,7 ppm), giữa C-3 (72,2 ppm) và H-3 (3,38 ppm), tƣơng tác giữa C-12 (126,6 ppm) và H-12 (5,26 ppm). Phổ khối (ESI-MS) cho pic ion giả phân tử tại m/z 487 [M-H]-. So sánh các số liệu phổ MS, 1H- và 13C- NMR của hợp chất asiatic acid với số liệu của asiatic acid trong tài liệu [122, 123], thấy hoàn toàn trùng khớp. Hợp chất madecassic acid (10) Phổ hồng ngoại của hợp chất madecassic acid cho đỉnh hấp thụ đặc trƣng của nhóm hydroxyl (3416 cm -1 ), nhóm CH2, CH3 (2930 và 2867 cm -1 ). Phổ 1H-NMR cho thấy có 4 methyl singlet, hai methyl doublet tại 0,92 và 1,10 ppm. Ngoài ra trên phổ có các tín hiệu của nhóm hydroxymethine (-CHOH) tại H: 3,31 (d, J = 9,5 Hz, H-3), 4,40 (m, H-6), tín hiệu ở H = 5,31 ppm đặc trƣng cho nhóm methine olephinic (=CH) và 2 tín hiệu doublet đặc trƣng cho nhóm -CH2 gắn với -OH tại H: 3,46 và 3,61 ppm. Sự có mặt của các nhóm này đƣợc củng cố bởi các tín hiệu trên phổ 13C-NMR ở C: 69,6 ppm (C-2), 78,2 (C-3), 68,4 (C-6), 126,9 và 139,0 ppm (C- 12 và C-13). Phổ 1H và 13C- NMR của hợp chất madecassic acid gợi ý rằng hợp chất madecassic acid có cùng khung carbon với hợp chất asiatic acid. Phổ khối (ESI-MS) ion dƣơng cho pic ion giả phân tử tại m/z 505 [M+H]+. Các số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất madecassic acid hoàn toàn phù hợp với số liệu của madecassic acid trong [13]. Hỗn hợp stigmasterol glucoside và β-sitosterol glucoside (144) 78 Hỗn hợp stigmasterol glucoside+β-sitosterol glucoside đƣợc phân lập dƣới dạng tinh thể màu trắng, Rf = 0,4 (CH2Cl2:MeOH = 85:15). So sánh các dữ kiện phổ ESI-MS m/z 575 và 577 [M+H]+, phổ 1H, 13C-NMR và DEPT với tài liệu của hỗn hợp stigmasterol glucoside + β-sitosterol glucoside [53], cho phép xác định đây là hỗn hợp stigmasterol glucoside + β-sitosterol glucoside. Tỷ lệ giữa hai hợp chất này trong hỗn hợp là 1:1, đƣợc xác định thông qua tích phân trong phổ 1H-NMR.  Hợp chất Madecassoside (14) Hợp chất madecassoside đƣợc tách ra dƣới dạng bột màu trắng, có Rf trùng với Rf của madecassoside chuẩn tách từ cây rau má trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất madecassoside chứa các tín hiệu cộng hƣởng nhƣ đã đƣa trong phần thực nghiệm tại mục 3.2.1.2 và hoàn toà