Luận văn Nghiên cứu chiết, tinh sạch thu chế phẩm saponin triterpen từ rau má và khảo sát một số hoạt tính sinh học

c nhóm này 18 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 2 0 A B C D E Hình 1.6: Khung Lupan d - Nhóm hopan (IV): Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17. Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin A có trong cỏ thảm Mollugo hirta L. 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7A B C D E 2 2 3 0 2 9 Hình 1.7: Khung Hopan 1.4.1.2. Saponin triterpenoid tetracyclic Phần aglycone có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammaran, lanostan, cucurbitan 19 a - Nhóm dammaran (V): Ðại diện là các saponin của nhân sâm. Phần aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh. Khi tác dụng với acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran. Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật. Hai genin chính là: protopanaxadiol và protopanaxatriol. Phần đường nối vào OH ở cabon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh. Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran còn gặp trong hạt táo (Ziziphus jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst. 2 3 5 10 7 8 13 9 4 6 1 11 15 16 28 29 19 18 30 12 14 17 2021 22 23 24 25 27 26 Hình 1.8: Khung Dammaran b - Nhóm lanostan (VI): Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải sâm - Holothuria spp. là một ví dụ của nhóm này. Một nhóm phụ của nhóm lanostan là nhóm cycloartan có cấu trúc 9,19 cyclo (9b) lanostan. Các saponin abrusosid A, B, C, D có trong cam thảo dây Abrus precatorius là những saponin thuộc nhóm này. 20 2 3 5 10 7 8 9 4 6 1 11 15 16 28 29 19 30 12 14 17 2021 22 23 24 25 27 26 18 13 Hình 1.9: Khung Lanostan c/ Nhóm cucurbitan (VII). Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp trong họ Cucurbitaceae. Ở đây nhóm CH3 góc thay vì ở vị trí C10 lại đính ở C9. 2 3 5 10 7 8 4 6 1 11 15 16 28 29 30 12 14 17 2021 22 23 24 25 27 26 13 H 9 Hình 1.10: Khung Cucurbitan 1.4.2. Tính chất lý hóa của Saponin triterpen. Nhóm Triterpen mang khá đầy đủ tính chất của nhóm Saponin như: 21 Có vị đắng, dễ gây kích ứng niêm mạc, có tác dụng phá huyết và có khả năng tạo bọt nhiều và bền vững trogn môi trường acid. Tan tốt trong nước, trong ethanol, methanol loãng, rất ít tan trong aceton, hecxan. Khi thủy phân các saponin (bằng dung dịch acid loãng và nóng bằng enzym) thì sẽ được các phần đường và phần aglycon hay genin. Phản ứng mầu Liebermann – Burchard: Saponin triterpen được hòa tan trong chlorofom và cho vào hỗn hợp dung dịch anhydrid acetic acid sulfuric thấy phản ứng đổi màu từ xanh da trời, lục, hồng đến đỏ. Phản ứng Rosenheim: Các saponin triterpen cho mầu tím, chuyển sang mầu xanh lơ sau 20 phút khi tác dụng với hỗn hợp chlorofom và acid tricloracetic. [8, 10] 1.4.3. Cấu tạo của các hợp chất Triterpen có trong rau má: Trong rau má các Saponin triterpen chiếm chủ yếu là: Asiaticoside, Madecassoside, Asiatic axit và Madecassic acid. [8, 10] Bảng 1.5: Công thức cầu tạo của các hợp chất Saponin triterpen trong rau má. Asiaticoside Tên hóa học: Urs-12-en-28- oic acid, 2,3,23-trihydroxy-, O-6-deoxy- .alpha.-L-mannopyranosyl- (1.fwdarw.4)- O-.beta.-D-glucopy ranosyl-(1.fwdarw.6)- .beta.-D- glucopyranosyl ester, (2.alpha., 3.beta.,4 .alpha.)- Công thức: C48H78O19 Trọng lượng phân tử: 959.12 Madecassoside Tên hóa học: O-6-Deoxy-alpha-L- mannopyranosyl-(1.4)-O-beta-D- glucopyranosyl-(1.6)-beta-D- glucopyranosyl (2alpha,3beta,4alpha,6b eta)-2,3,6,23-tetrahydroxyurs-12-en-28- oate Công thức: C48H78O20 Trọng lượng phân tử: 975.12 22 Asiatic acid Tên hóa học: Urs-12-en-28- oic acid, 2,3,23-trihydroxy- , (2alpha,3beta,4alpha)- Công thức: C30H48O5 Trọng lượng phân tử: 488.70 Madecassic acid Tên hóa học: 8,10,11-trihydroxy-9- (hydroxymethyl)-1,2,6a,6b,9,12a- hexamethyl- 2,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b- tetradecahydro-1H-picene-4a- carboxylic acid Công thức: C30H48O6 Trọng lượng phân tử: 504.70 1.4.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất saponin triterpen Cho đến nay trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu, thử nghiệm trên động vật và nghiên cứu in vitro về công dụng của Saponin triterpen trong rau má, cụ thể như sau: 1.4.4.1 Khả năng sản sinh collagen: Năm 1978, Poizot và Dumez đã nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp asiaticosides lên da, thử nghiệm được tiến hành trên chuột và thỏ; Kết quả cho thấy hỗn hợp asiaticosides góp phần làm mau liền vết thương. Theo nghiên cứu của các nhóm F.Bonte (1994, 1995), R.Tenni (1988) và FX Maquart (1990) từ các dịch chiết Saponin triterpen cho thấy có tác động mạnh mẽ lên việc duy trì làn da khỏe mạnh và ngăn chặn có hiệu quả hiện tượng lão hóa: Asiaticosid và madecassosid, cả hai triterpen này đều có khung ursenoic và đều có tính kích thích fibroblast tiết ra collagel trả lại đầy đặn và săn chắc cho da. Bonte cho biết 23 cả asiaticosid và madecassosid đều kích thích sự hình thành collagen I, trong khi đó một mình madecassosid chỉ giúp tiết ra loại Collagen III. Maquart sử dụng công thức gồm 30% acid asiatic, 30% acid madecassic và 40% asiaticosid, kết quả nghiên cứu của ông và đồng nghiệp cho thấy cả 3 hoạt chất đều tạo ra gian bào (làm cho da đầy đặn và nõn nà, bóng bẩy), nhưng chỉ một mình axit asiatic có khả năng kích thích fibroblast tiết ra collagen (làm cho da có khả năng đàn hồi tốt, không thể xay ra hiện tượng gấp nếp và chảy nhão) [14, 27] 1.4.4.2 Khả năng kháng khuẩn, nấm và kháng virut: Năm 1965, Tschesche và Wulff đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn, nấm của asiaticoside trên 07 loại vi sinh vật khác nhau: Kết quả cho thấy asiaticoside có khả năng kháng Pseudomonas pyocyaneus và Trichoderma mentagrophytes ở nồng độ là 1000µg asiaticosid/ml canh trường. Năm 2009, M.Obayed Ullah và cộng sự đã thử nghiệm khả năng kháng khuẩn, kháng nấm trên 16 chủng khác nhau bao gồm: Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger Kết quả cho thấy dịch chiết Saponin triterpen từ rau má đều có khả năng kháng 16 loài trên ở nồng độ từ 300 – 5000 µg/ml. [23] Năm 1989, Zheng và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết asiaticosid từ rau má lên HSV -2 (Herpes simplex virus) là loại vi rút gây viêm màng não, kết quả cho thấy asiaticosid có khả năng chống lại hoạt động của HSV-2. [24] Theo Giáo sư, Dược sỹ Bửu Hội, Rakoto Ratsimamanga và Boiteau, Rau má chứa một glycoside gọi là asiaticosid với công thức C55H88O23. Chất glycoside này có tinh thể tan trong rượu, độ nóng chảy 230 – 2330C, có thể cho dẫn xuất tan trong nước gọi là oxyasiaticoside có tác dụng điều trị được bệnh lao. 1.4.5.3 Chống ung thư: Nghiên cứu của Dalton và Ehrlich cũng đã ghi nhận phần các hợp chất Saponin triterpen của rau má diệt được các tế bào ung thư loại lymphoma, nhưng đã không xác định được chính xác loại terpenoid nào; trong khi đó hoạt tính diệt bào của các 24 triterpenoids loại ursane như axit ursolic và oleanolic rất có thể giống cơ chế của các axit asiaticoside. Các nghiên cứu “in vitro” về axit ursolic va oleanolic ghi nhận các axit này có khả năng ngăn chặn sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư ở các nồng độ từ 1 đến 20 microM. (Anticancer Research số 16 – 1996 và Cancer letter số 10 – 1996). Mặt khác cả axit oleanolic và ursolic đều làm giảm sự sinh sản của tế bào nội mạc ở nồng độ từ 5 đến 20 microM (Planta Medica số 64 – 1998). Do đó các triterpenoid này rất có thể sẽ hữu dụng để trị ung thư bằng cách ngăn chặn tiến trình angiogenesis (tiến trình tăng trưởng của các mạch máu nhân tạo để nuôi dưỡng tế bào mới sinh) cần đến sự sinh sản của các tế bào nội mạc để tạo ra các mạch máu mới. Các axit oleanolic và ursolic cũng có các tác động chống u bướu. Trong nghiên cứu về khả năng chống ung thư của rau má, kết quả ghi nhận là liều cho uống một dịch chiết rau má chứa lượng cao terpenoid 1g/kg trong 5 ngày, uống cách nhật, ức chế được sự tăng trưởng của bướu ung thư và kéo dài được thêm thời gian sống của chuột bị chích tế bào ung thư lymphoma vào cơ thể. Sự ức chế rõ rệt hơn khi chuột được cho dùng dịch chiết Rau má trước khi bị chích tế bào ung thư và cơ thể, kết quả không rõ rệt khi bắt đầu cho chuột dùng dịch chiết rau má 10 ngày sau khi bị chích tế bào ung thư. Liều tương đương để áp dụng đối với người vào khoảng 4,8 g/ngày. [12] 1.4.4.4 Một số công dụng khác: Điều hòa miễn dịch: Qua hai nghiên cứu của Dicarlo et al (1964) trên chuột và nghiên cứu in vitro của Labadie et al (1989). Có khả năng chống co thắt: được chứng minh bằng nghiên cứu in vitro thử nghiệm trên lợn của Dhar et al (1968). [26] Trong rau má chứa hoạt tính sinh học quan trọng như madecassol, asiatic acid, saponin asiaticosid, thankunisid, isothankunisid giúp sinh cơ. Tính sinh cơ của rau má đã được chứng minh là sinh cốt giao (gelatin), đặc biệt là sinh sợi myosin và elastin là 2 chất cốt giao cơ bản trong việc tham gia cấu tạo da, cơ, xương, sinh hồng cầu, bổ 25 máu, lọc máu, liền sẹo, chống nhăn và giải độc gan, chống xơ gan, tăng trí nhớ, an thần, chống stress [12, 16] 1.4.5. Ứng dụng Saponin triterpen: 1.4.5.1. Ứng dụng trong y tế Một số công trình nghiên cứu của thế giới trong những năm gần đây một phần nào đã cho thấy xu hướng sử dụng các sản phẩm từ thảo mộc trong việc bảo vệ, bồi bổ sức khoẻ đã được nghiên cứu từ rất lâu và Saponin triterpen trong rau má được sử dụng làm thuốc chữa khá nhiều, điều này được thể hiện rõ trong các công bố ở bảng 1.7, 1.8. [23, 26] Bảng 1.6: Một số công trình nghiên cứu khả năng chữa bệnh của rau má của các quốc gia trên thế giới. Tên bệnh Quốc gia Tác giả nghiên cứu Viêm cuống phổi Ỉa chảy Ấn Độ Fiji Ấn Độ Philippin Thái Lan Burkill (1966) Singh (1986) Saklani (1989) Velazco (1980) Anderson Bệnh lỵ Banglades Ấn Độ Alam (1992) Burkill (1966), Saklani (1989), Rao (1982), Pushpangadan (1984), Deka (1982), Boisya (1980) Động kinh Ấn Độ Malaysia Ramaswamy (1970) Burkill (1966) Sốt Guam Ấn Độ Nepal Thái Lan Haddock (1974) Shah (1971), Sahu (1984) Bhattarai (1989) Mokkasmit (1971) Viêm dạ dày Nepal Manandhar (1986) Viêm gan Ấn Độ Đài Loan Pushpangada (1984) Yanfg (1987), Lin (1990) Viêm Guam Ấn Độ Thái Lan Tonga Hackdock (1974) Rastoni (1960) Panthong (1986) Singh (1984) Bệnh Trung Quốc Shishkin (1973) 26 phong Ấn Độ Madagascar Nepal Singh (1980), Jain (1984), Sahu (1989), Ikram (1981), John (1984) Voigtlander (1984) Suwal (1970) Bệnh bạch da Ấn Độ Ramaswamy (1970), Rastogi (1960) Bệnh tâm thần Ấn Độ Fuji Nigeria Chopra (1949), Tiwari (1979), Rastogi (1960) Singh (1986) Adesina (1982) Dưỡng não Ấn Độ Nepal Nigeria Thái Lan Ramaswamy (1970), Rastogi (1960), John (1984), Singh (1980), Shah (1971), Sebastian (1984), Sahu (1989), Ikram (1981) Suwal (1970) Adesina (1982) Wasuwar (1967), Mokkhasmit (1971ab) Giảm đau Nigeria Papua New Guinea Adesina (1982) Holsworth (19830 Thấp khớp Ấn Độ Nepal Chopra (1949) Suwal (1970) Bệnh giang mai Ấn Độ Nepal Chopra (1949), Ikram (1981) Suwal (1970) Thuốc bổ Banglades Trung Quốc Ấn Độ Malaysia Nepal Thái Lan Alam (1992) Shishkin (1973) Chopra (1949), Sebastian (1984), Ikram (1981) Burkill (1966) Suwal (1970) Anderson (1986), Mokkhasmit (1971) Lành vết thương Fiji Ấn Độ madagascar Malaysia Papua New Guinea Ấn Độ Singh (1986) Holdsworth (1983), Jain (1984) Voigtlander (1984) Burkill (1966) Holdsworth (1983) Jain (1984), Sebastian (1984) 27 Bảng 1.7: Thành phần cao rau má trong các loại thuốc đông y chữa bệnh Tên bệnh Thành phần của cao rau má (%) Bệnh nhiễm trùng Sốt Kích thích ăn uống Giang mai Ho gà Viêm phế quản Bệnh lao Bệnh phong Thuốc giải độc Chứng loạn thần kinh Căng thẳng thần kinh Động kinh Chống béo phì Mất ngủ Chảy máu cam Nhiệt miệng Mụn trứng cá Bệnh trĩ Đái tháo đường Hen suyễn Vô sinh Tăng sinh lực cho nam Lọc huyết thanh 11 10 11,5-37 100 100 16,6 50 100 5 30 50 17 100 28,5 65 90 40 26 90 14 8 13 1.4.6.2 Ứng dụng trong mỹ phẩm và thực phẩm: Các nghiên cứu chuyên sâu về từng hoạt chất Saponin từ rau má đã giúp các thương hiệu mỹ phẩm lớn như Guerlan, Estee Lauder, Givenchy, Orlanne, Clinique nhanh chóng hình thành nhiều loại mỹ phẩm cao cấp mới chứa chất chiết xuất từ rau má dưới dạng creame, lotion gel chống lão hóa, chống nhăn và dưỡng da. Ngoài ra, người ta cũng đưa ra hoạt chất rau má vào các dạng mặt nạ chăm sóc mặt và toàn thân, vào các loại dầu massage, các loại xà bông, sữa tắm để điều trị chàm, mụn nhọt và một số bệnh viêm da. 28 Qua các công trình đã công bố của Trung Quốc và Ấn độ là hai quốc gia phát triển mạnh nhất trong việc chiết xuất các hợp chất triterpen (đặc biệt là 3 hợp chất axit asiatic, madecassic và asiaticoside) và đã sản xuất dưới dạng sản phẩm thương mại bán cho khắp các nước trên thế giới phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt là lĩnh vực dược. Hình 1.11: Một số sản phẩm từ rau má: 29 Hiện nay, ở nước ta rau má chủ yếu được sản xuất dạng trà tan và nước uống đóng hộp. Hình 1.12: Một số sản phẩm thực phẩm sản xuất từ rau má 30 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Rau má: Rau má mua ở chợ, nguồn từ Văn Giang – Hưng Yên, Hà Đông – Hà Nội, Vĩnh Phúc. Rau má tươi → rửa sạch → sấy khô → nghiền mịn. Rau má khô nguồn từ Vĩnh Phúc, Bắc Giang. 2.1.2. Hóa chất: - Hóa chất: Etanol 400 nhà máy rượu Hà Nội, n-butanol, chlorofom của J.T Barker (Pittsburgh, Mỹ), silicagel 60 F254 của Merck - Các chủng vi sinh vật thử nghiệm do bệnh viện Quân y 103 cung cấp 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị: Thiết bị thí nghiệm gồm: Tủ sấy, máy cất quay, thiết bị sấy phun, máy HPLC (Shimadzu, Nhật) của Phòng Thí nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường Đại học Bách khoa 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp chiết tách saponin triterpene 2.2.1.1 Tách chiết Saponin triterpene thô bằng dung môi ethanol Áp dụng quy trình chiết trong Dược điển Anh năm 2009, dung môi để chiết triterpen là ethanol 400. Rau má tươi được đem sấy đạt độ khô 12%, sau đó nghiền nhỏ thành bột; cho bột này vào bình thủy tinh miệng rộng cùng với một lượng ethanol 400 vừa đủ, tiến hành trộn đều, ủ trong 2 giờ cho nguyên liệu ngấm đều dung môi. Tiếp đó tiến hành cho bột rau má đã ủ vào bình ngấm kiệt, và bổ sung 400 ngập phần nguyên liệu 2 – 4cm, ngâm 24 giờ tiến hành mở van cho chảy nhỏ giọt để thu dịch chiết và tiếp tục bổ sung ethanol 40% để đạt được tỉ lệ chiết rau má/ethanol là 1:8. Dịch chiết được cô cách 31 thủy bằng thiết bị bốc hơi chân không, sau đó sấy khô ở 800C đến khối lượng không đổi và thu được cao có chứa saponin triterpene, cao này được gọi là cao cồn có chứa saponin. [8, 26] 2.2.1.2 Phương pháp chiết saponin triterpene thô bằng nước cất Lấy 1000g rau má tươi sau khi đưa vào máy ép nghiền trục vít thu được một lượng dịch là 573,8 g, và 421g bã. Lượng bã được bổ sung thêm 842 ml nước cất và đun khối dịch lên nhiệt độ 600C trong thời gian 2h, khối dịch được làm nguội và tiếp tục cho vào ép trục vít loại bỏ bã được 382,5g bã. Dich ép lần 2 được trộn với dịch ép lần 1, sau đó cô đặc 10 lần và sấy phun thu được bột Saponin triterpen thô. [8] 2.2.2. Phương pháp tinh sạch saponin triterpen: 2.2.2.1 Tinh sạch Saponin triterpen bằng n-Butanol và chlorofom: Theo nguyên tắc các Saponin triterpen tan trong n-Butanol mà không tan trong chloroform. Vì vậy, đầu tiên dùng n-Butanol để chiết triterpene có trong cao Saponin triterpen thô, sau đó dùng chloroform để loại tạp chất. Bước 1: chiết nóng bằng n-Butanol hai lần. +Lần 1: Tỉ lệ cao Saponin ethanol: n-Butanol là 1:8, đun hồi lưu trong 1h ở 1000C (có khuấy từ). Lọc dịch chiết và thu được dịch chiết lần 1, còn phần cao thu được đem chiết lần 2. + Lần 2: Với tỉ lệ cao cồn: n-butanol là 1: 5, đun hồi lưu trong 1h ở 1000C (có khuấy từ). Lọc nóng dịch chiết và thu được dịch chiết lần 2, bỏ bã cao. Dịch chiết lần 1 và 2 đem cô đặc máy cô chân không. Đem dịch chiết đã cô sấy ở 800C đến khối lượng không đổi và thu hồi được cao saponin butanol (cao có chứa hỗn hợp các saponin). Dung môi n-butanol được thu hồi. Bước 2: Cao Saponin butanol tiếp tục đem tinh sạch bằng chloroform 2 lần. + Lần 1: Với tỉ lệ là cao thô saponin: chloroform là 1: 7. Cho chloroform vào cao thô và khuấy đều, để trong vòng 15- 20 phút cho chloroform hòa tan hết tạp chất cho trong cao thô, gạn bỏ dịch chlorofom ở trên thu được cao saponin lần 1. 32 + Lần 2: Cao saponin thu được ở lần 1 tiếp tục cho chloroform vào với tỉ lệ 1:5 để tinh sạch lần 2. Cho chloroform vào cao, khuấy đều, để trong thời gian 15 – 20 phút sau đó chiết lấy dịch và sấy khô đến khối lượng không đổi. Cao thu được là cao saponin toàn phần, cao này có chứa hỗn hợp các saponin. [8, 26] 2.2.2.2. Phương pháp kết tủa saponin triterpen bằng ete Theo các tài liệu đã công bố cho biết hợp chất Saponin có thể bị kết tủa dạng tinh khiết trong ete khi được tinh sạch sơ bộ. Chúng tôi tiến hành lấy cao cồn Saponin triterpen đem chiết nóng 2 lần bằng n-Butanol (các bước tương tự như trên) thu được dịch n-Butanol đem cô dịch rồi bổ sung ete etylic khan theo tỉ lệ 1:10 thu được các hạt tinh thể mầu trắng. Các hạt tinh thể trắng được tách ra khỏi dịch đem sấy khô đến khối lượng không đổi thu được Saponin triterpen toàn phần. [8] 2.3. PHƯƠNG PHÁP LOẠI BỎ CHẤT MÀU Cao Saponin triterpen thu được bằng phương pháp chiết suất tuy đã qua nhiều giai đoạn loại tạp nhưng vẫn chưa thật sự tinh khiết, nhất là vẫn còn một lượng lớn các chất màu, chất nhựa và các chất màu tạo thành trong quá trình chiết tách có sử dụng nhiệt vì vậy cần phải loại bỏ các hợp chất này để cho sản phẩm tinh sạch hơn. 2.3.1 Phương pháp tảy màu bằng than hoạt tính Than hoạt tính – là một chất gồm chủ yếu là nguyên tố carbon ở dạng vô định hình (bột), một phần nữa có dạng tinh thể vụn grafit (ngoài carbon thì phần còn lại thường là tàn tro, mà chủ yếu là các kim loại kiềm). Than hoạt tính có diện tích bề mặt ngoài rất lớn, nếu tính ra đơn vị khối lượng là từ 500 đến 2500 m2/g, do vậy nó là một chất lý tưởng dùng để lọc hút nhiều loại hóa chất. Tiến hành cho dịch chiết Saponin triterpen đã qua các công đoạn tách và sạch chạy qua cột được nhồi than hoạt tính. [8] 2.3.2 Phương pháp tảy màu bằng silica gel Silica gel thực chất là điôxit silic. Công thức hóa học đơn giản của nó là SiO2.nH2O (n<2), nó được sản xuất từ natri othosilicat (Na2SiO4) hoặc Silic TetraClorua (SiCl4). Silica gel là dạng hạt, có cấu trúc rỗng của Silica được tổng hợp 33 từ oxyt silic. Nó có dạng cục hoặc viên hình cầu tuỳ thuộc phương pháp tạo hạt khi điều chế, có loại trong suốt như thuỷ tinh, có loại đục. Độ xốp thay đổi trong giới hạn 20 - 60%, đường kính lỗ xốp khoảng 3 - 10 nm, bề mặt riêng 200 - 800 m2/g. Tiến hành cho dịch chiết Saponin triterpen đã qua các công đoạn tách và tinh sạch chạy qua cột được nhồi Silicagel. [20] 2.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TRITERPEN 2.4.1. Phương pháp định tính Saponin triterpen 2.4.1.1 Phương pháp định tính Saponin triterpen bằng phản ứng tạo bọt. Dựa vào tính chất dễ tạo bọt của saponin để có thể phát hiện sơ bộ Saponin, đối với đa số các Saponin triterpen tạo bọt bền trong môi trường axit. Cách tiến hành: lấy hai ống nghiệm cao 25cm, ống thứ nhất cho 5ml dung dịch NaOH 0,1N (pH 13), ống thứ hai cho 5ml dung dịch HCl 0,1N (pH 1). Cho vào mỗi ống 5ml dung dịch Saponin trong hòa tan trong cồn 400C. Lắc mạnh 2 ống, nếu có bọt nhiều và bền vững ở môi trường kiềm (ống 1) là Saponin steroid, có bọt nhiều và bền vững ở môi trường acid (ống 2) là saponin triterpen. [8] 2.4.1.2 Phản ứng Liebermann – Burchard: Người ta còn có thể xác định saponin thuộc nhóm triterpenoid hay nhóm steroid bằng phản ứng cổ điển được áp dụng nhiều nhất là phản ứng Lieberman Buchard hay còn gọi là phản ứng tạo mầu. Theo lý thuyết nếu là saponin triterpenoid phản ứng sẽ cho mầu nâu đỏ, còn nếu là saponin steroid phản ứng sẽ cho màu xanh lá cây. Cách tiến hành: lấy 1ml anhydrid acetic + 1ml chlorofom đã để lạnh ở 00C, sau đó thêm 1 giọt acid sulfuric. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch saponin toàn phần, lắc mạnh chờ phản ứng xảy ra. [8] 2.4.1.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng: Chạy trên bản mỏng là Silicagel 60F254 của Merck Mẫu thử là cao saponin triterpen toàn phần của rau má được hòa tan bằng ethanol 400 và mẫu chuẩn là Saponin triterpen của Pháp. Tiến hành chấm sắc kí và chạy sắc kí với hệ dung môi là: 34 Ethanol : Methanol = 6:4 Bản sắc kí sau khi chạy cách mép trên khoảng 1cm thì lấy ra ra để khô trong không khí và soi dưới đèn tử ngoại để quan sát các vết. Dưới đèn tử ngoại thì saponin triterpenoid có huỳnh quang màu xanh. Tiếp đến, sử dụng thuốc thử andehyt acetic và H2SO4 với tỉ lệ 9:1 để phun và bản mỏng, sau đó sấy ở nhiệt độ 1200C, thời gian 15 phút lấy ra quan sát kết quả (các vệt có mầu xanh đậm). [16, 30] 2.4.2 Phương pháp định lượng Saponin triterpen 2.4.2.1. Định lượng Saponin triterpen bằng phương pháp cân khối lượng không đổi Cân chính xác lượng bột rau má khô, đem chiết bằng dung môi cồn hoặc nước. Dịch chiết thu được đem cô chân không đến nồng độ dịch chiết giảm 10 lần. Tiếp tục sấy ở nhiệt độ 800C đến khối lượng không đổi đem cân xác định trọng lượng của cao Saponin triterpen. [4] 2.4.2.2. Định lượng Saponin triterpen bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Mẫu thử là cao saponin triterpen toàn phần của rau má được hòa tan bằng ethanol 400 và mẫu chuẩn là Saponin triterpen của Pháp. Các điều kiện tiến hành HPLC: Máy HPLC LC-10AD (Shimadzu, Nhật). Cột Supelcosil LC18 (250 x 4,6 mm), kích thước hạt 5 µm, kèm cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6 mm). Pha động: acetonitril - metanol - nước (25: 20: 55). Tốc độ dòng: 0,7ml/phút. Mẫu thử: cân chính xác khoảng 10 mg saponin toàn phần, hòa tan trong 5 ml pha động, lọc qua lọc 0,45 µm trước khi bơm vào máy HPLC. Thể tích bơm: 10 µl. Dectector PDA, bước sóng phát hiện: 203 nm, nhiệt độ cột 300C. [22] 2.5 Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa của Saponin triterpen. 2.5.1 Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn: Tiến hành xác định khả năng kháng khuẩn của chế phẩm Saponin triterpen theo Phương pháp khuếch tán đĩa thạch theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam 3. 35 Đĩa thạch Muller-Hinton được đổ dày 7mm được môi trường đặc hiệu và đục lỗ đường kính 9mm, sau đó cấy ria trên bề mặt thạch chủng vi khuẩn có nồng độ 108 tế bào/ml (mỗi chủng cấy ria lên một đĩa thạch), để 15 phút se mặt thạch, sau đó mỗi giếng thạch cho 400µl (nồng độ 0,5g/ml) dịch Saponin triterpen. Số chủng thử nghiệm: 04 chủng gồm: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, E.coli, Pseudomonas aeruginosa. Tất cả các đĩa thạch được đặt trong tủ ấm 370C, sau 24 giờ lấy ra đo đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch tẩm thuốc thử. [23] 2.5.2 Xác định khả năng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH: Chế phẩm Saponin triterpen được xác định khả năng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). [29] Nguyên tắc: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế ức chế gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH. Xác định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng có hấp thu cực đại tại 517 nm. Cách tiến hành: Dùng 0.5 mg dung dịch chất cần khảo sát (nồng độ 200µg/ml, 150 µg/ml, 100µg/ml, 50µg/ml, 10µg/ml pha trong methanol) cho vào 2.5 ml dung dịch DPPH (nồng độ 50µg/ml pha trong methanol). Hỗn hợp được lắc đều và để ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thu sau 5, 10, 20, 30 phút ở bước sóng 517 nm, mỗi lần đo 3 lần lấy giá trị trung bình. Mẫu trắng được tiến hành trong cùng điều kiện nhưng không sử dụng Saponin triterpen. Khả năng ức chế gốc tự do (S%) được tính theo công thức sau: S (%) = [1 – (Ats – Atc)] x 100 Trong đó: Ats: Độ hấp thu của mẫu thử ở thời điểm t = 5 phút, 10 phút, 20 phút, 30 phút. Atc: Độ hấp thu của mẫu trắng 36 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN NGUYÊN LIỆU 3.1.1.Nghiên cứu hàm lượng Saponin triterpen trên 02 loại rau má Dựa vào diện tích trồng nhiều của một số loại rau má ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên hai loại rau má phổ biến được trồng hiện nay là rau má Tây Phi và rau má Việt Nam. Cây rau má trong điều kiện khí hậu tốt có chu kỳ thu hái từ 20 - 25 ngày đối với giống rau má Tây Phi, và 25 – 30 ng