Luận văn Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati

gens) Ngoài ra những gen khác như mia A đóng vai trò thứ yếu hơn trong quá trình biến nạp [23]. TB TV được chuyển gen AND nhân TB TV Hệ gen VK AND nhân TB TV Hình 5. Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens Cơ chế chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens Quá trình chuyển T-ADN được bắt đầu ở vị trí biên phải và kết thúc ở vị trí biên trái. Nếu không có sự định hướng này, hiệu quả của quá tình chuyển gen sẽ rất thấp [5]. Đoạn T-ADN mang gen muốn được chuyển, trước tiên nó phải được hoạt hóa nhờ hoạt động của các gen vir. Hiện tượng này xảy ra khi A. tumerfaciens bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ vết thương của cây hoặc từ tế bào nuôi cấy. Khi nhận được các phân tử tín hiệu từ vết thương thực vật: hợp chất phenolic (cacbolic acid), acetosyringone (AS), hydroxy acetosyringone (OH-AS), flavonoid, đường đơn hoặc các tín hiệu khác như pH axit (pH 5 - 5,5), phosphat và opine, làm dẫn dụ Agrobacterium gắn vào thành tế bào thực vật (AS, OH-AS được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy tế bào thuốc lá - giống như những sản phẩm của chuyển hoá phenyl propanoid - một khâu chủ yếu trong chu trình tạo các chất thứ cấp như lignin và các chất thơm. Những chất này rất quan trọng đối với thực vật trong các điều kiện stress và bị thương, ta gọi là hợp chất dẫn dụ). Trong quá trình tiếp xúc giữa tế bào thực vật và Agrobacterium, vi khuẩn tạo ra các sợi cellulose và các sợi này kết tụ thành bó gắn lên bề mặt tế bào thực vật. Quá trình này làm cảm ứng và hoạt hoá các gen vùng vir. Sự thể hiện gen vir xảy ra nhờ hệ thống truyền cảm ứng gồm các sản phẩm của virA và virG. Chính các sản phẩm protein của các gen vir đã làm nhiệm vụ vận chuyển T-ADN. Một số bằng chứng chứng tỏ T-ADN được vận chuyển tới nhân tế bào thực vật và gắn hoá trị vào genome thực vật, sau đó, T-ADN được phiên mã nhờ ARN polymerase II [17], [19]. Quá trình chuyển T-ADN cho tế bào thực vật gồm ba sự kiện quan trọng: • Sự kiện thứ nhất: Hình thành khối u là quá trình biến đổi tế bào thực vật do xâm nhập và hợp nhất của T-ADN vào tế bào thực vật, sau đó biểu hiện các gen trong vùng T-ADN. • Sự kiện thứ hai: Các gen nằm trong vùng T-ADN sao chép trong các tế bào bị xâm nhiễm và không có vai trò trong quá trình chuyển. • Sự kiện thứ ba: Vùng ADN lạ đặt giữa các vùng biên của T-ADN có thể được chuyển cho tế bào cây trồng. Hình 6. Cấu trúc của Ti-plasmid và T-ADN Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium được sử dụng rộng rãi và hiệu quả do: - Số bản sao của gen được chuyển vào tế bào thực vật thấp. Do vây, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao. - Tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm. - Kỹ thuật đơn giản dễ thực hiện. 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHUYỂN CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ĐIỀU KHIỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Việt Nam là một nước có nền kinh tế phụ thuộc rất nhiều vào nông nghiệp, tuy nhiên, trong điều kiện biến đổi khí hậu toàn cầu như hiện nay, cây trồng ở Việt nam đang phải hứng chịu những tác động nặng nề do vấn đề hạn hán. Hạn đang được xem là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và làm cho sản lượng lương thực không ổn định. Hạn được xem là nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và làm cho sản lượng lương thực không ổn định. Vì vậy đã từ lâu, rất nhiều phòng thí nghiệm quan tâm đến việc chọn tạo giống chịu hạn. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu tập trung vào phương pháp truyền thống như lai tạo, chọn lọc cá thể, quần thể... và kết quả là nhiều giống chịu hạn đã được áp dụng trong sản suất. Gần đây, chọn giống chịu hạn theo định hướng di truyền phân tử như việc sử dụng các chỉ thị phân tử, lập bản đồ QTL liên kết với một số tính trạng chịu hạn đang được các nhà khoa học Việt Nam đặc biệt quan tâm. Phòng Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã lập bản đồ QTL liên kết với các tính trạng ở rễ lúa liên quan đến tính chịu hạn ở các giống vùng cao Việt nam và gần đây đã thiết lập phương pháp đánh giá tính chịu hạn bằng xử lý PEG và phân tích chỉ thị SSR liên kết với các tính trạng liên quan đến chịu hạn của các giống lúa Việt nam. Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long cũng có nhiều nghiên cứu chọn tạo giống chịu hạn, chịu mặn nhưng tập trung chủ yếu vào việc lai tạo truyền thống và các phương pháp chọn giống phân tử (83). Các nghiên cứu phân lập gen và tạo cây chuyển gen chịu hạn ở Việt Nam có thể nói là đang khá mới mẻ và đang ở giai đoạn ban đầu. Hiện tại, phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học cũng đã nghiên cứu phân lập gen và chọn dòng lúa chống chịu lạnh, nhân bản và phân tích các đoạn ADN pBC442 và pBC591 ở một số giống và dòng lúa có tính chịu lạnh khác nhau. Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học - Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đang thiết kế vector chuyển gen nhằm loại bỏ gen kháng sinh trong cây chuyển gen và đang tiến hành chuyển gen DREB1D/CBF4, DREB2A và TPS1 vào đậu tương nhằm tăng cường tính kháng với điều kiện hạn. Phòng Bệnh học Phân tử và chống chịu bất lợi ngoại cảnh-Viện Di truyền Nông nghiệp đang triển khai các thí nghiệm phân lập các gen mã hóa các nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn, thiết kế các vector chuyển gen và nghiên cứu biểu hiện của các yếu tố phiên mã trên cây mô hình lúa chuyển gen. Tập đoàn giống lúa Việt nam gồm 59 giống đã được khảo sát khả năng hình thành callus, tái sinh và tiếp nhận gen lạ. Các gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn: OsNAC1, OsNAC6, ... đã được phân lập và đang được thử nghiệm khả năng biểu hiện trên các giống lúa Việt Nam. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. GIỐNG LÚA Hạt của giống lúa Pusa Basmati do trung tâm kỹ thuật gen và công nghệ sinh học quốc tế (ICGEB) Ấn Độ cung cấp. Basmati là giống lúa dạng hạt dài được trồng phổ biến ở Ấn Độ và Pakistan. Đặc điểm nổi bật của giống lúa này là có mùi thơm, dẻo và hương vị tinh tế. Ấn Độ là nước trồng và xuất khẩu nhiều nhất loại gạo này, tiếp theo là Pakistan. Giống lúa Basmati là nguồn phát triển chủ yếu trong lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa ở khu vực Punjab. Hạt gạo basmati dài hơn hầu hết các loại gạo khác, khi đã nấu chín có đặc điểm đặc trưng là hạt gạo rời chứ không dính. Cơm nấu bằng gạo basmati có thể được xác định bởi mùi thơm của nó. Gạo Basmati hiện nay có hai loại: trắng và nâu. Hiện nay có một số dòng lúa basmati như: các dòng truyền thống bao gồm Basmati-370, Basmati-385 và Basmati-Ranbirsinghpura (RSPura), và các dòng lai giống bao gồm Pusa Basmati 1 (còn được gọi là 'Todal', bởi vì hạt có râu ở đầu), các dòng gạo thơm có nguồn gốc từ giống basmati cổ nhưng không được xem là giống basmati thật, như PB2 (còn gọi là sugandh-2), PB3 và RH-10. Giống lúa Pusa Basmati-1(PB1) đã được các nhà khoa học tại Viện Nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ, New Delhi đưa vào nghiên cứu và chứng minh khả năng nhận gen tốt và trở thành giống mô hình của Ấn độ trong lĩnh vực chuyển gen thực vật. Đây cũng là giống lúa có đặc tính di truyền tốt (hạt gạo dài, thơm, chứa kiềm) và cây dạng hơi thấp lùn. PB1 có năng suất cây trồng cao hơn so với các giống truyền thống (có thể cao gấp đôi). Tuy có nguồn gốc từ Ấn Độ nhưng khi được gieo trồng trong điều kiện được tưới tiêu bình thường ở Việt Nam, giống lúa Pusa Basmati 1sinh trưởng và phát triển tốt, có tiềm năng về năng suất và chất lượng. 2.1.2. CHỦNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM VÀ VECTOR Thư viện cDNA chịu hạn của lúa, các vector nhân dòng pSK II, pUC19-Ubi, chủng vi khuẩn E.coli DH5α, chủng vi khuẩn A. tumerfaciens: EHA105 được cung cấp bởi Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. Vector chuyển gen pBCKH được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của GS. Shinozaki, Trung tâm quốc tế Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản. Bộ kit Gateway LR Clonase II enzym mix, các trình tự mồi (bảng1) và các hóa chất được mua của các hãng Merk, Sigma và Invitrogen... Bảng 3. Trình tự các cặp mồi đã được sử dụng trong nghiên cứu Tên mồi Trật tự mồi OsNac6-F 5‘-AGGATCCAGAAGGGGGAGAGAGATGAG-3’ OsNac6-R 5’-AGGATCCTGGTCGTCTAGAATGGCTTG-3’ OsNac6-F-1 5‘-AGGATCCATGAGCGGCGGTCAGGACCT-3’ OsNac6-R-1 5’-AGGATCCCTAGAATGGCTTGCCCCAGT-3’ Ubi-F 5’-CCCTGCCTTCATACGCTATT-3’ Nos-RT50 5’-AGACCGGCAACAGGATTCAA-3’ Out-L 5’-CAGCTATGACCATGATTACGC-3’ Out-R 5’-GGGTTTTCCCAGTCACGACGTTG-3’ T3 5’-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3’ T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ 2.1.3. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ a. Hóa chất Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen bao gồm: MS, LB, YEM. Bảng 4. Thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được dùng trong thí nghiệm Nhóm Hóa chất Hàm lượng (mg/l) Đa lượng KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4 180,54 KH2PO4 170 CaCl2 332,02 Vi lượng H3BO3 6,2 MnSO4 22,3 ZnSO4 8,6 KI 0,83 Na2MoO4 0,25 CuSO4 0,025 CoCl2 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Vitamin Glysin 2 Nicotinic acid 0,5 Myo-Inositol 100 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine HCl 0,1 Bảng 5. Thành phần môi trường LB (Luria-Bertani medium) Hóa chất Hàm lượng (g/l) Bacto-Tryptone 10 Bacto-yeast extract 5 NaCl 10 Bảng 6. Thành phần môi trường YEM (Yeast-extract-manitol medium) Thành phần Hàm lượng (g/l) K2H2PO4 0,5 MgSO4 . 7H2O 0,2 NaCl 0,1 Yeast extract 0,4 Manitol 10 Các hoá chất sử dụng cho nuôi cấy vi sinh vật như: Triptone, cao nấm men, agar được mua từ hãng Difco; hoá chất sử dụng trong nuôi cấy mô như: 2,4-D, BAP, kinetine, casein,mua từ hãng Sigma; thang chuẩn ADN 1kb và enzym Taq ADN polymerase mua từ hãng Invitrogen. Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu Sinh học Phân tử. b. Thiết bị Các máy móc thiết bị chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: tủ cấy vô trùng (Daikin & Envirco), tủ sinh trưởng (Binder), máy PCR ABI 9700, máy giải trình tự ADN tự động ABI 3100, máy quang phổ kế (Jasco V530), máy đo pH (Horiba), máy ly tâm (Heraus), bể ổn nhiệt (Lauda) và các thiết bị khác. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1.PHÂN LẬP GEN OsNAC6 TỪ THƯ VIỆN cADN CHỊU HẠN Ở LÚA 2.2.1.1. Nhân gen OsNAC6 từ thư viện bằng kỹ thuật PCR Dựa vào trình tự nucleotide của gen OsNAC6 được công bố trên ngân hàng gen, chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu OsNac6-F/OsNac6-R (bảng 1) để nhân trình tự nucleotide mã hóa gen OsNAC6. Mồi OsNac6-F gồm 27 nucleotide; gồm trình tự nhận biết của enzym giới hạn BamHI ở đầu 5’, 15 nucleotide ở vùng không mã hóa gen đầu 5’ và 5 nucleotide ở vùng mã hóa gen bắt đầu từ trình tự khởi đầu dịch mã (ATG) ở đầu 3’. Mồi OsNac6-R dài 27 nucleotide; gồm trình tự nhận biết của enzym giới hạn BamHI ở đầu 5’, 7 nucleotide ở vùng không mã hóa gen đầu 5’ và 13 nucleotide ở vùng mã hóa gen bắt đầu từ trình tự kết thúc dịch mã (CTA). Kỹ thuật PCR nhân gen OsNAC6 được thực hiện với tổng thể tích là 50 μl bao gồm các thành phần với tỷ lệ như sau: H2O Đệm 10X Mồi F (10 pmol) Mồi R (10 pmol) dNTPs 10 mM Taq DNA polymerase Thư viện cDNA : 34.5 μl : 5 μl : 2 μl : 2 μl : 5 μl : 0,5 μl : 1 μl Tổng thể tích : 50 μl Phản ứng PCR được thực hiện với chu kì nhiệt: khởi đầu 940C trong 5 phút, 30 chu kỳ nhiệt tiếp theo (mỗi chu kỳ gồm nhiệt độ biến tính ADN là 940C trong 45 giây, nhiệt độ gắn mồi là 550C trong 45 giây và nhiệt độ kéo dài chuỗi là 720C trong 60 giây), kéo dài 7 phút ở 720C. Sản phẩm PCR lần một được dùng làm khuôn cho PCR lần 2 với chu trình nhiệt như trên. Sản phẩm PCR lần 1 và lần 2 được điện di trên gel Agarose 1% để kiểm tra băng kích thước khoảng gần 1000bp. Sản phẩm PCR lần 2 được tinh sạch bằng cột GeneluteTM Minus EtBr (Sigma Cat G-2199) 2.2.1.2. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng cột GeneluteTM Minus Etbr (Sigma Cat # G-2166) Băng ADN sau khi điện di xác định đúng kích thước sẽ được cắt và chạy qua kim tiêm 1ml để làm nhỏ trước khi chuyển qua cột. Để thu được ADN, cột đã chứa agarose và ADN sẽ được ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Sản phẩm thu được chính là ADN đã được tinh sạch có thể sử dụng cho các phản ứng tiếp theo. 2.2.1.3. Gắn sản phẩm PCR vào vector nhân dòng pSK II Sản phẩm PCR và vector nhân dòng được xử lý bởi enzym giới hạn BamH I với thành phần phản ứng như sau: Đệm của enzym (10X) Sản phẩm PCR/vector pSK II (1 μg/μl) BamH I (10 unit/μl) dH2O : 2 hoặc 5μl : 10 hoặc 20 μl : 1 hoặc 2 μl : 7 hoặc 23 μl Tổng thể tích : 20 hoặc 50 μl Phản ứng cắt được tiến hành ở 37oC trong 1 giờ, sau đó sản phẩm của phản ứng được chạy kiểm tra trên gel Agarose để xác định băng có kích thước tương ứng và được tinh sạch bằng phương pháp phenol lạnh với các bước như sau : Bước 1: Cắt lấy mẩu gel có chưa đoạn AND có kích thước cần kiểm tra cho vào ống tiêm 1 ml, dùng áp lực đẩy gel agarose chứa ADN qua ống tiêm 1 ml và thu sản phẩm trong ống eppendorf 1,5 ml. Bước 2: Bổ sung 800 µl phenol (pH = 8,0), trộn đều bằng vortex, ủ ở -80oC trong khoảng 1 giờ. Bước 3: Hỗn hợp được làm tan ở nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút. Bước 4: Hút pha trên chuyển sang ống eppendorf mới và bổ sung một lượng tương đương dung dịch chloroform : isoamyl alcohol tỷ lệ 24 : 1. Lắc đều và tiếp tục hút pha trên chuyển sang ống eppendorf mới. Bước 5: Bổ sung 1/10 thể tích CH3COOK, pH = 5,2 và 2,5 lần thể tích cồn tuyệt đối giữ lạnh. Ủ hỗn hợp ở -20oC trong thời gian 1 giờ. Bước 6: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong khoảng 30 phút, thu kết tủa và làm sạch ADN bằng cồn 70%. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong thời gian 5 phút, thu kết tủa, làm khô và hoà tan ADN trong thể tích nước hợp lý. Vector pSK II sau khi cắt bởi BamH I được tiếp tục xử lý bởi enzym CIAP (alkaline phosphatase) để loại bỏ một nhóm PO4 ở đầu 5’ để tránh hiện tượng tự gắn lại của vector khi tiến hành phản ứng gắn với sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR và vector pSK II sau khi được xử lý với BamH I đều có đầu dính (GATC) của enzym BamH I ở hai đầu. Vì vậy, sản phẩm PCR sẽ được gắn vào vector pSK II khi có mặt enzym T4 ligase với thành phần phản ứng như sau : Đệm của enzym (10X) Sản phẩm PCR (50 ng/μl) Vector pSK II II (200 ng/μl) T4 ligase (10 unit/μl) dH2O : 1 μl : 1 μl : 1 μl : 1 μl : 6 μl Tổng thể tích : 10 μl Phản ứng gắn được tiến hành ở 250C trong thời gian 1 giờ. Biến nạp gen OsNAC6 vào tế bào E. coli Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli DH5α Dịch tế bào DH5a giữ ở -800C được cấy trải trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C, sau đó chọn một khuẩn lạc đơn để nuôi lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC trong 5 ml môi trường LB lỏng. 500 ml môi trường LB lỏng được bổ sung vào 5 ml dung dịch nuôi qua đêm và tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C khoảng 2 giờ (OD600=0,4 - 0,6). Dịch khuẩn được đem ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, thu cặn tế bào và hoà tan trong 20 ml CaCl2 0,1M lạnh. Tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 0,1M; giữ hỗn hợp trên đá trong khoảng 2 giờ, tiếp tục ly tâm ở tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Cặn tế bào được hòa tan trong 20 ml dung dịch CaCl2 0,1M và 10% glycerol. Tế bào khả biến DH5a vừa chuẩn bị được chia thành từng lượng nhỏ 80 - 100 µl vào các ống eppendorf và bảo quản ở -80oC. Biến nạp gen OsNAC6 vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt 10 μl vector nhân dòng pSK II mang gen OsNAC6 đã chuẩn bị ở trên (mục 2.2.1.3) được bổ sung vào tế bào khả biến DH5α. Hỗn hợp được trộn nhẹ và ủ trong đá 20 phút tạo điều kiện cho các vector bám lên thành tế bào. Sau đó, phản ứng sốc nhiệt được thực hiện bằng việc chuyển hỗn hợp phản ứng trên vào bể ổn nhiệt ở 420C trong 60 giây, ngay lập tức ủ hỗn hợp vào đá trong 5 phút. Hỗn hợp phản ứng sau đó được trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 100 μg/ml ampicilin, nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm. Kiểm tra gen OsNAC6 trong khuẩn lạc bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR và vector pSK II chỉ được gắn với nhau bởi một vị trí enzym giới hạn BamH I nên sản phẩm PCR có thể gắn vào vector theo chiều xuôi (forward) hoặc ngược (reverse). Vì vậy, phản ứng PCR đặc hiệu với mồi xuôi là mồi của promoter T3 (T3-F) và mồi ngược là mồi đặc hiệu của gen OsNAC6 (OsNAC6-R) được tiến hành để xác định sự có mặt xuôi chiều của gen OsDREB2A tái tổ hợp với vector pUC19-Ubi trong khuẩn lạc. Các khuẩn lạc cho sản phẩm PCR là các băng ADN có kích thước tương ứng với kích thước của gen OsNAC6 được tiếp tục nuôi để tách plasmid. 2.2.1.5. Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E. coli DH5α Phương pháp tách chiết ADN plasmid được cải tiến dựa trên phương pháp của Sambrook và cộng sự (1989) [66]. Gồm các bước sau: Bước 1 : Nuôi cấy lắc 1 khuẩn lạc đơn trong 2ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 370C. Bước 2 : Chuyển dung dịch nuôi qua đêm vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm ở tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút. Bước 3 : Thu cặn tế bào, hòa tan trong 150 μl dung dịch I để lạnh (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH = 8,0) và 10 mM EDTA). Bước 4 : Bổ sung 300 µl dung dịch II (0,2 N NaOH, 1% SDS), đảo nhẹ. Bước 5 : Tiếp tục bổ sung 200 µl dung dịch III để lạnh (60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml axit acetic đậm đặc; 28,5 ml nước), đảo nhe. Bước 6 : Dung dịch tế bào được ủ trong đá khoảng 10 phút và ly tâm 12.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Bước 7 : Thu dịch trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml sạch và bổ sung 2 µl enzym RNase (10 µg/ml). Bước 8: Bổ sung một lượng tương đương dung dịch phenol : chloroform : isoamyl alcohol theo tỷ lệ 25 : 24 : 1, ly tâm 12.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng. Bước 9 : Chuyển pha trên cùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới rồi bổ sung một lượng dung dịch chloroform : isoamyl alcohol theo tỷ lệ 24 : 1 với thể tích tương đương. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng. Bước 10 : Thu pha trên cùng và chuyển sang một ống eppendorf 1,5 ml mới và bổ sung CH3COOK 3M (pH = 5,2) với tỷ lệ 1/10 thể tích. Bổ sung 2,5 lần thể tích cồn tuyệt đối giữ lạnh, kết tủa ADN ở -80oC trong 1 giờ. Ly tâm 12.000 vòng/phút khoảng 30 phút ở 4oC. Bước 11 : Rửa ADN bằng cồn 70%, sấy khô, hòa tan ADN trong 50 µl nước hoặc TE. GIẢI TRÌNH TỰ GEN OsNAC6 Gen OsNAC6 gắn với vector nhân dòng pSK II cùng với cặp mồi T3, T7 được gửi đi để đọc trình tự hai chiều nhờ máy giải trình tự ABI 3100. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN OsNAC6 BẰNG KỸ THUẬT GATEWAY Tạo vector trung gian Gen OsNAC6 trong vector tách dòng pSK II-OsNAC6 được thu nhận lại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu OsNac6-F/OsNac6-R (bảng 1) để nhân trình tự nucleotide mã hóa gen OsNAC6. Phản ứng PCR được tiến hành như mô tả ở phân phân lập gen OsNAC6 (mục 2.2.1.1), chỉ khác là thành phần phản ứng sử dụng sợi khuôn là 50 ng plasmid pSK II-OsNAC6. Sản phẩm PCR được điện di trên gel Agarose 1%, tinh sạch bằng cột GeneluteTM Minus EtBr (mục 2.2.1.2), xử lý enzym giới hạn Bam HI, gắn vào vector pUC19-Ubi đã xử lý Bam HI và loại gốc phosphate trước đó (mục 2.2.1.3) để tạo vector trung gian pUC19-Ubi-OsNAC6. Chiều gắn của gen OsNAC6 trong vector pUC19-Ubi được kiểm tra bằng cặp mồi Ubi-F/OsNac6-R (bảng 1). Vector pUC19-Ubi-OsNAC6 có chiều gắn xuôi được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α, nuôi lỏng thu sinh khối, tách plasmid và giải trình tự trước khi gắn vào vector chuyển gen. Tạo vector chuyển gen Việc gắn cấu trúc gen gồm promoter Ubiquitin, OsNAC6 và trình tự kết thúc phiên mã trong vector pUC19-Ubi-OsNAC6 vào vector nhận pBCKH để tạo ra vector chuyển gen pBCKH-Ubi-OsNAC6 được thực hiện theo quy trình Gateway kit (Invitrogen). Phản ứng gateway được tiến hành trong hỗn hợp phản ứng 5 μl với các thành phần phản ứng như sau : LR clonase buffer Vecor cho (pUC19-Ubi) 100 ng/μl Vector nhận (pBCKH) 20 ng/μl TE LR clonase : 1 μl : 0,5 μl : 0,5 μl : 2,5 μl : 0.5μl Tổng thể tích : 5 μl Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 250C trong thời gian 1giờ, sau đó bổ sung 0,5 μl proteinase K ủ ở 370C trong 10 phút để loại bỏ protein. 1,5 μl hỗn hợp phản ứng được dùng để biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α như trình bày ở mục 2.2.1.4. Các khuẩn lạc mọc trên môi trường LB chứa 50 μg/ml kanamycine được kiểm tra sự có mặt của gen OsNAC6 trong vector chuyển gen pBCKH bằng phản ứng PCR với các cặp mồi: OsNac6-F/Out-R, Ubi-F/OsNac6-R, Ubi-F/Nos-RT50, OsNac6-F/OsNac6-R (bảng 1). Các khuẩn lạc chứa vector chuyển gen pBCKH mang gen OsNAC6 được sàng lọc trong môi trường LB lỏng chứa 50 μg/ml kanamycin. Plasmid được tách như trình bày ở mục CHUẨN BỊ CÁC TẾ BÀO KHẢ BIẾN AGROBACTERIUM VÀ TẠO TẾ BÀO AGROBACTERIUM TÁI TỔ HỢP MANG GEN OsNAC6 Chuẩn bị tế bào khả biến Agrobacterium Dựa trên phương pháp của Shen và Forde (1989), Mersereau và CS (1990) với một số cải tiến và cụ thể như sau: Bước 1: Cho 5ml dịch chứa chủng A. tumefacines bão hoà vào 500 ml YEM. Nuôi khuẩn lắc 200 vòng/phút ở 280C khoảng 8 giờ đến khi đo OD600 = 0,5 - 0,8. Bước 2: Dịch khuẩn để lạnh rồi ly tâm 6000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở 40C. Bước 3: Thu cặn tế bào và bổ sung 5 - 10 ml nước lạnh, dùng pipet nhẹ nhàng hút lên xuống làm tan cặn tế bào. Bổ sung thêm nước lạnh đến thể tích 500 ml, ly tâm 6.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở 40C. Bước 4: Thu cặn tế bào và bổ sung 250 ml nước đá và ly tâm 6.000 vòng/phút trong khoảng 5 phút ở 40C. Bước 5: Thu cặn và bổ sung 5 ml glycerol 10%. Bước 6: Hoà tan dịch tế bào và chia tế bào khả biến Agrobacterium ra thành từng lượng nhỏ 80 - 100 µl và xử lý qua nitơ lỏng trước khi bảo quản ở -800C. Biến nạp gen OsNAC6 vào tế bào khả biến Agrobacterium Gen OsNAC6 trong vector pBCKH được chuyển vào tế bào khả biến Agrobacterium EHA105 bằng xung điện với các bước như sau: Bước 1: Thêm 100 ng plasmid tái tổ hợp vào các tế bào khả biến Agrobacterium EHA105 và trộn đều, để hỗn hợp trong đá khoảng 30 phút. Bước 2: Chuyển hỗn hợp vào cuvet điện đã giữ lạnh và ủ trong đá từ 5 - 10 phút. Tiến hành chuyển plasmid tái tổ hợp vào tế bào Agrobacterium EHA105 bằng máy xung điện với các thông số như sau: Điện dung : 25 μF Điện thế : 2.4 KV Điện trở : 200 Ω Thời gian : 5 giây Bước 3: Ngay lập tức sau khi xung điện truyền qua cuvet bổ sung thêm 1ml môi trường LB lỏng vào cuvet và chuyển dịch huyền phù vi khuẩn sang ống falcon 15 ml. Ủ có lắc nhẹ (70 - 80 vòng/phút) trong khoảng 4 giờ ở 28ºC. Bước 4: Kết tủa các tế bào bằng cách ly tâm nhẹ (3.000 vòng/ phút), đổ bỏ dịch phía trên chứa môi trường và giữ lại 50 - 100 µl, sau đó cấy trải dung dịch chứa vi khuẩn đã cô đặc lên môi trường LB đặc có bổ sung 50 mg/l kanamycin. Bước 5: Nuôi các tế bào đã biến nạp ở 280C trong thời gian 2 ngày . Bước 6: Nuôi khuẩn lạc đơn trong môi trường YEB lỏng chứa 50 mg/l kanamycin ở 28ºC, lắc ở tốc độ 200 vòng/phút qua đêm. Tiến hành tách chiết plasmid tái tổ hợp từ các vi khuẩn sinh trưởng trên môi trường YEB lỏng có chứa kanamycin theo phương pháp tách chiết plasmid (đã trình bày ở trên) sau đó sử dụng phản ứng cắt enzym giới hạn và điện di kiểm tra trên agarose 1% hoặc sử dụng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu để kiểm tra sự có mặt của ADN mong muốn trong plasmid của vi khuẩn. Bước 7: Các khuẩn lạc có kết quả dương tính được nuôi trong môi trường YEB lỏng và giữ trong dung dịch glycerol 15% ở -70ºC. CHUYỂN GEN OsNAC6 VÀO GIỐNG LÚA PUSA BASMATI THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM Tạo callus Hạt lúa được bóc vỏ và được xử lý bằng cách rửa nước cất một lần khử trùng 4 -5 lần, ngâm và lắc nhẹ trong cồn 70% thời gian 1 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất khử trùng trước khi ngâm trong dung dịch Javen 50% có bổ sung tween 20 trong thời gian 20 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất khử trùng từ 4 - 5 lần. Hạt khử trùng được thấm khô và đặt trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D, BAP, casein, L-proline , giữ trong tối ở 280C. Sau 15 ngày, callus được tạo thành. Chuẩn bị callus và Agrobacterium EHA105 Trước khi chuyển gen 3 ngày, các callus có màu vàng, khô và có đường kính khoảng 1- 3 mm được chọn để chuyển gen. Các callus được cắt ra, tập hợp lại và trải đều trên môi trường tạo callus có ngăn bởi giấy lọc và nuôi ở 280C trong 3 ngày. Chủng Agrobacterium EHA105 chứa gen OsNAC6 được nuôi trong môi trường YEM lỏng có bổ sung 50 mg/l kanamycin, lắc 200 vòng/phút ở 280C trong thời gian 24 giờ. Nhiễm callus với Agrobacterium EHA105 Callus được nhiễm với Agrobacterium EHA105 mang gen OsNAC6 theo các bước như sau: Bước 1: Tế bào Agrobacterium EHA105 chứa gen OsNAC6 được nuôi qua đêm và đo OD600, sau đó được đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút, thu tủa và hòa tan vào môi trường MS lỏng, sau đó pha loãng tới nồng độ OD600 = 0,5. Bổ sung Acetosyringone ở nồng độ 30 μg/ml. Bước 2: Các callus được cho vào ống fancol chứa dung dịch MS đã được hòa Agrobacterium EHA105 được chuẩn bị ở bước trên. Hỗn hợp được cho vào máy lắc nhẹ trong 30 phút. Bước 3: Sau khi được lắc đều trong dịch khuẩn, callus được đổ ra tấm lưới đã khử trùng và được làm khô bằng cách đặt lên giấy thấm khử trùng để loại bỏ Agrobacterium còn lại, sau đó callus được chuyển lên môi trường Đồng nuôi cấy có ngăn bởi giấy lọc. Các callus sau khi được nhiễm Agrobacterium EHA105 chứa gen OsNAC6 được nuôi trong tối ở nhiệt độ 280C trong thời gian 3 ngày. Chọn lọc và tái sinh Sau quá trình lây nhiễm, các callus được rửa nhiều lần bằng nước đường khử trùng ha