Luận văn Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn s7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen

g đƣợc tích cực thực hiện tại Viện Bảo Vệ thực vật (BVTV). Nhóm nghiên cứu Viện Bảo Vệ thực vật cũng hợp tác chặt chẽ với chuyên gia Trung Quốc và Pháp để xác định tác nhân gây bệnh dựa trên RT-PCR, giải trình tự sản phẩm PCR và hiển vi điện tử . Căn cứ vào đặc điểm triệu chứng bệnh trên cây, đặc điểm hình thái, kích thƣớc tiểu thể virus trên kính hiển vi điện tử và kết quả lây bệnh nhân tạo nhằm khẳng định nguyên tắc Koch, cũng nhƣ giải trình tự sản phẩm PCR trên phân đoạn S10 và S3 của hệ gene virus, nhóm nghiên cứu Viện BVTV cũng xác định tác nhân gây bệnh là virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV)[10]. Ngoài ra, các nghiên cứu lan truyền thực hiện tại Viện Bảo vệ Thực vật cũng xác định đƣợc môi giới truyền bệnh là rầy lƣng trắng giống nhƣ nghiên cứu của các tác giả Trung Quốc. Dựa vào các nghiên cứu trên, Bộ NN & PTNT thống nhất gọi lại tên bệnh tại Việt Nam là bệnh lùn sọc đen (LSĐ) và virus gây bệnh là virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV). 1.2.4.2. Các nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán virus SRBSDV Năm 2010, Viện Bảo vệ Thực vật đã nghiên cứu phát triển quy trình chẩn đoán SRBSDV bằng phƣơng pháp PCR/RT-PCR. Quy trình bao gồm các bƣớc: Giải trình tự sản phẩm PCR vùng gen bảo thủ có chiều dài 600 bp và phân tích trình tự gen sử dụng chức năng BLAST trong ngân hàng gen để xác định độ tƣơng đồng với tất cả các trình tự nucleic acid hiện có trong ngân hàng gen. Sau đó, gia phả trình tự gene thu đƣợc đƣợc phân tích bằng phần mềm MEGA-4.1 với trình tự gen tƣơng ứng của các virus có độ tƣơng đồng cao nhất cũng nhƣ các virus có cùng nhóm hoặc cùng phân nhóm và các virus thuộc nhóm hay phân nhóm khác cùng họ[6]. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 20 Từ năm 2012 đến nay, Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp và Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã phân lập và giải trình tự toàn bộ phân đoạn S7, S9 và S10 của 13 chủng SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái trồng lúa từ miền Trung trở ra. Trên cơ sở phân tích trình tự hệ gene phân đoạn S10 của các chủng vius đã thiến kế cặp mồi đặc hiệu cho chủng SRBSDV ở Việt nam và phát triển quy trình chẩn đoán dựa trên kỹ thuật RT-PCR. Nghiên cứu đã tối ƣu hóa đƣợc phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số, thiết kế đƣợc cặp mồi đặc hiệu dùng trong chẩn đoán SRBSDV, tối ƣu đƣợc loại mẫu và vị trí xét nghiệm, tối ƣu loại phản ứng RT-PCR dùng trong xét nghiệm SRBSDV và thời gian RT-PCR tƣơng ứng [5,12]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã nghiên cứu cơ sở khoa học của việc chẩn đoán SRBSDV bằng kỹ thuật kháng nghuyên kháng thể và đã (1) tạo mẫu nhiễm bệnh, tinh sạch phân tử virus từ mẫu nhiễm bệnh và tạo thành công kháng thể đa dòng SRBSDV và (2) tinh sạch và biểu hiện thành công protein vỏ P10, 2 polypeptide P1 và P2 trên protein P10 phục vụ cho việc tạo kháng thể đặc hiệu [5]. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 21 CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Mẫu lúa Tổng số 51 mẫu lúa bệnh có những đặc điểm nhiễm bệnh điển hình của bệnh lúa lùn sọc đen nhƣ cây lúa lùn, lá vặn xoắn, gốc thân có nốt, vết sần mầu trắng đến đen... đại diện cho các vùng sinh thái trồng lúa khác nhau của Việt Nam nhƣ: (1) đồng bằng Bắc bộ, (2) Hà Nội và các tỉnh vùng ven, (3) Trung du và miền núi phía Bắc, (4) các tỉnh Bắc Trung bộ và (5) các tỉnh Duyên hải Miền Trung đƣợc thu thậpphục vun cho nghiên cứu. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu gồm có: - Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng PCR nhân bản trình tự S7 của SRBSDV do Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) thiết kế dựa trên trình tự S7 đã đƣợc công bố trên Ngân hàng gen Thế giới (mã số EU 784841). - Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng RT-PCR một bƣớc nhằm xét nghiệm sự có mặt của SRBSDV đƣợc thiết kế theo nghiên cứu của Zhou và cs (2008) là SRBSDVS10F3/R3 (525bp) [39]. - Các bộ kít dùng trong nghiên cứu gồm: pGEM®-T Easy Vector (Promega); GenJET TM Gel Extraction (Thermo Scientific); RevertAid TM First Strand cDNA Synthessis (Thermo Scientific); kít ELISA (IgG & conjugate) để phát hiện virus RRSV, RGSV, RTBV, RTSV, RGDV và RBSDV do TS. Omura, Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản chuyển giao; kit Read-to-go của GE healthcare cho phản ứng RT-PCR 1 bƣớc; pJet1.2 cloning kit và first strand cDNA kit của Fermentas... - Các enzyme dùng trong nghiên cứu gồm: Dream Taq DNA polymerase, T4 DNA ligase (Thermo Scientific) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 22 Bảng 1:Trình tự các cặp oligo nucleotide sử dụng trong nghiên cứu. Tên mồi Trình tự mồi T7-Fw 5‟-AATACGACTCACTATAG-3‟ SP6-Rv 5‟-TATTTAGGTGACACTATAG-3‟ SRBSDVS10F3 5-TATTCAAAGTTATTTCCGT-3‟ SRBSDVS10R3 5-ACATGAATAGTTTCAAGT-3′ - Các hóa chất và d ụng cụ tiêu hao khác dùng trong nghiên cứu: bột cellulose CF11, SDS , Phenol, ống PCR 0,2 ml, đầu tip 2, 20, 200 và 1000 µl, chày cối sứ ... đạt tiêu chuẩn cho Sinh học Phân tử. 2.1.3. Thiết bị Các thiết bị dùng trong nghiên cứu gồm: Máy PCR 9700 của hãng Applied Biosystem, hệ thống điện di DNA của hãng Biorad, máy ly tâm Universal 30RF của hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus, máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader của hãng UVItec, máy giải trình tự ABI 3100, . 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Thu mẫu Những mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh đặc trƣng (nhƣ cây lùn, lá xanh đậm, xoắn đầu lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân) đƣợc thu thập trên đồng ruộng tại các tỉnh thành miền Bắc và miền Trung. 2.2.2. Xét nghiệm mẫu 2.2.2.1. Phương pháp Sandwich ELISA Nguyên tắc: Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 23 trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phƣơng pháp này đƣợc thiết kế cho việc phát hiện và định lƣợng vật chất nhƣ peptides, protein, antibodies, hormone, Đôi khi nó còn đƣợc gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay). Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. ELISA đƣợc dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh... Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bƣớc: - Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể - Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm. Tiến hành: - Mẫu khi lấy về trữ ở -20oC, chọn những lá vừa không non cũng không già, phiến lá lớn, cân 0,5g cho vào cối, thêm 2,5ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn chỉ thấy dạng dung dịch. Sau đó đổ vào eppendoff gần đầy và ghi ký hiệu thật cẩn thận. - Mẫu sau đó đƣợc đem ly tâm tốc độ 5000vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 4oC, dùng Micropipette P1000 hút phần dịch nỗi sang một eppendoff 1.5ml mới và cũng ghi nhãn cẩn thận (loại bỏ cặn lắng) và giữ ở 4oC. Sử dụng bộ kit ELISA (IgG & conjugate) để phát hiện virus RRSV, RGSV, RBTV, RBSDV do TS. Omura, Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản chuyển giao, quy trình ELISA đƣợc tiến hành nhƣ sau: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 24 - Đĩa và sơ đồ bố trí đƣợc chuẩn bị. Mỗi đĩa đƣợc bố trí 2 đối chứng âm và 2 đối chứng dƣơng. Pha loãng kháng thể 1/250 trong dung dịch đệm (coating buffer). Trên mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100µl, chạy trên 5 đĩa, nhƣ vậy tổng cộng là 30ml, do đó phải pha dung dịch đệm là khoảng 35ml: pha loãng 140µl kháng thể vào trong 35ml dung dịch đệm kháng thể, trộn thật kỹ trƣớc khi dùng. Hút 100µl dung dịch vừa pha vào mỗi giếng, dùng băng keo dán kín lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC trong 2 giờ. - Hỗn hợp đƣợc rửa với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa, rửa 3 lần mỗi lần 3 phút. Sau đó, mỗi đối chứng âm và dƣơng đƣợc hoà tan với 1ml nƣớc cất, hút 100µl mỗi loại đối chứng vào các giếng đối chứng, tiếp theo hút 100µl mẫu vào các giếng đã đƣợc bố trí. Đem ủ ở 4oC qua đêm. - Hỗn hợp đƣợc rửa lại với PBS – T 3 lần mỗi lần 3 phút. Sau đó, pha kháng thể có gắn enzyme vào dung dịch đệm (tƣơng tự nhƣ pha kháng thể ở bƣớc 2). Hút 100µl dung dịch kháng thể có gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đó đem ủ ở 37oC trong 2 giờ. - Hỗn hợp đƣợc rửa lại với PBS – T 3 lần, mỗi lần 3 phút. Sau đó, hoà tan pNPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ml của pNPP, chờ 5 phút để pNPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Hút 100µl hỗn hợp cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 30 phút. - Kết quả đƣợc đọc bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ + Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu dƣơng tính với kháng nguyên. + Những giếng không màu: giếng chứa mẫu âm tính với kháng nguyên. Các mẫu cho kết quả âm tính với kháng nguyên của RRSV, RGSV, RBTV, RBSDV sẽ đƣợc phân loại riêng để tiếp tục phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 25 2.2.2.2. RT-PCR một bước Nguyên tắc cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA dƣới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase). Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuôn mRNA. Sợi kép RNA/DNA sẽ tách nhau ra dƣới tác động của nhiệt độ cao, giải phóng sợi đơn cDNA. Tiếp sau đó, enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi đơn cDNA thứ hai để có đƣợc sợi đôi cDNA hoàn chỉnh. Tiến hành: Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 đƣợc sử dụng để tiến hành tổng hợp cDNA sợi đôi từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễm bệnh lùn sọc đen. Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau: Thành phần phản ứng: Mồi xuôi 10 pmol : 1 µl Mồi ngƣợc 10 pmol : 1 µl RNA sợi đôi : 0.3 µl Đệm 10X : 1.5 µl dNTP 10 mM : 1.5 µl Reverse transcriptase (200u/µl) : 0.5 µl Taq DNA polymerase (5u/ µl) : 0.2 µl RiboLock TM RNase Inhibitor (20u/µl) : 0.3 µl ddH2O : 8.7 µl Tổng thể tích : 15µl Phản ứng RT-PCR một bƣớc đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 26 Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC cho đến phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide. 2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 1% Nguyên tắc: Điện di là một quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dƣới tác dụng của điện trƣờng. DNA là phân tử tích điện âm nên trong môi trƣờng trung tính hoặc kiềm, dƣới tác dụng của điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển theo chiều từ cực âm sang cực dƣơng. Các phân tử DNA sẽ chuyển động với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào điện tích, hình dạng, kích thƣớc của chúng. Do vậy phƣơng pháp điện di đƣợc sử dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc, hình dạng khác nhau. Tiến hành: Sau khi gel agarose 1% đƣợc chuẩn bị, tiến hành tra mẫu gồm 5 l mẫu DNA đƣợc trộn với 1 l loading dye 6X có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50 g/ml và tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel (Firereader-UVITEC), các đoạn DNA gắn với EtBr đƣợc biểu hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen. Các mẫu điện di lên băng dƣơng tính với SRBSDV đƣợc giữ lại để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.3. Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11 Nguyên lý: Các phân tử RNA sợi đôi (dsRNA) có đặc tính bám vào cột CF-11 trong điều kiện môi trƣờng đệm STE có chứa 16.5% EtOH và mất khả năng bám cột trong môi LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 27 trƣờng đệm STE không chứa EtOH. Vì vậy hệ gen virus đƣợc tách ra khỏi hệ gen và RNA của lúa bằng phƣơng pháp chạy qua cột CF-11. Tiến hành: Quy trình phân lập hệ gen của SRBSDV đƣợc thực hiện theo những bƣớc sau: - Nghiền nhỏ khoảng 1g mẫu lúa, chuyển mẫu đã đƣợc nghiền sang ống falcol sạch, bổ sung 10-20ml STE 2X vào mẫu để làm đệm cho phản ứng. Tiếp tục bổ sung vào hỗn hợp 2ml SDS 10% và lắc đều. Sau đó, bổ sung vào hỗn hợp 10ml phenol đã bão hòa, lắc nhẹ trong khoảng 45 phút. - Ly tâm hỗn hợp trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, chuyển dịch nổi sang ống mới, thêm vào H2O đến thể tích 20ml. Sau đó, bổ sung 4ml EtOH tuyệt đối vào dung dịch, tạo điều kiện để phân tử dsRNA bám vào cột (~16.5%EtOH) - Cân 2g bột CF-11 vào cốc đong, bổ sung 10ml dung dịch STE 1X chứa 16.5% EtOH. Sau đó, đƣa hỗn hợp lên cột và tiếp tục bão hòa cột bằng 10x10ml STE1X chứa 16.5% EtOH. Quá trình gắn cột xảy ra khi hỗn hợp mẫu (đã chuẩn bị) chảy từ từ qua cột đã đƣợc bão hòa. - Sau khi gắn cột, rửa cột bằng cách cho chảy từ từ qua cột 10x10ml STE 1X chứa 16.5% EtOH - Cột sau khi rửa, đẩy cột bằng cách cho chảy từ từ 10ml STE 1X không chứa EtOH qua cột, làm mất khả năng bám cột của các phân tử dsRNA, thu dịch đẩy vào ống Falcol sạch. Sau đó, tách hoàn toàn dsRNA bằng cách thêm 0,6V Isopropanol vào dịch đẩy cột, lắc đều hỗn hợp, ủ ở -20oC ít nhất 4h. - Ly tâm dịch trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Rửa cặn 2 lần bằng EtOh 70% để làm tan các muối. Sau đó, cặn đƣợc phơi trong không khí đến khi khô và tiếp tục đƣợc hòa tan bằng 50µl H2O (cất 2 lần). Sản phẩm thu đƣợc đƣợc giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 28 2.2.4. Tổng hợp cDNA từ dsRNA 2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi Các phân đoạn S7 của các chủng SRBSDV trên thế giới có trên GeneBank đƣợc tổng hợp, so sánh và phân tích mức độ tƣơng đồng bằng phần mềm MEGA5. Vùng bảo thủ của các phân đoạn này sẽ đƣợc lựa chọn và sử dụng để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phép nhân bản phân đoạn S7. Các cặp mồi có sẵn trình tự sẽ đƣợc chúng tôi đặt sinh tổng hợp tại công ty Sigma. 2.2.4.2. Tổng hợp cDNA sợi 1 Nguyên tắc: cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA dƣới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase). Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuôn mRNA. Sợi kép RNA/DNA đƣợc xử lý với kiềm hoặc ribonuclease (phân hủy sợi khuôn RNA) để tạo thành sợi đơn cDNA. Tiếp sau đó, DNA polymerase I tổng hợp sợi đơn cDNA thứ hai để có đƣợc sợi đôi cDNA hoàn chỉnh. Tiến hành: Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 đƣợc sử dụng để tiến hành tổng hợp cDNA sợi 1 từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễm bệnh lùn sọc đen. Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau: Thành phần phản ứng: Mồi xuôi 10 pmol : 1 µl Mồi ngƣợc 10 pmol: 1 µl RNA sợi đôi : 1 µl Đệm 5X : 4 µl dNTP 10 mM : 2 µl Reverse transcriptase (200u/µl): 1 µl H2O : 10 µl Tổng thể tích : 20µl LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 29 Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 42oC trong 60 phút. Sản phẩm phản ứng sau đó đƣợc sử dụng trực tiếp để làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại các đoạn trình tự đặc hiệu. 2.2.4.3. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đƣợc Karl Mullis cùng cộng sự phát minh năm 1985 và đƣợc tiếp tục hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất enzyme DNA polymerase bền nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus và một số loài vi khuẩn khác. Nguyên tắc của kỹ thuật này là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase trong môi trƣờng thích hợp có dƣ các dNTPs và cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng nhiều triệu lần so với ban đầu. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ đều có ba giai đoạn cơ bản:  Giai đoạn biến tính (Denaturing): Tách DNA mạch kép thành dạng mạch đơn ở nhiệt độ cao (94-95°C) trong thời gian ngắn.  Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Các đoạn mồi đặc hiệu sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung bằng cách hạ nhiệt độ xuống khoảng 30-65°C.  Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extending): Nhờ hoạt tính của enzyme DNA polymerase các dNTP đƣợc lắp ráp để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với mạch DNA khuôn bắt đầu từ đoạn mồi. Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ 68-72°C. Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào kích thƣớc đoạn gen cần nhân bản. Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC cho đến khi phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 30 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi nhân trình tự phân đoạn S7 nhƣ sau: Thành phần Thể tích dd H2O 9,8 l Đệm Taq DNA polymerase 10X 1,5 l Taq DNA polymerase (5u/ µl) 0,5 l dNTPs 2mM 1,5 l Mồi xuôi 10 pmol 0,6 l Mồi ngƣợc 10 pmol 0,6l cDNA khuôn 0,5 l Tổng thể tích 15 l Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau: 2.2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas Bộ kit GenJETTM Gel Extraction đƣợc thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn. Bộ kít sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thƣớc từ 25 bp đến 20 kb, hiệu suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ 100 bp đến 10 kb. Quy trình đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng nhƣ sau: Băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác bằng lƣỡi dao sạch từ gel agaros và đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (binding buffer) đƣợc bổ sung vào với 1 thể tích bằng khối lƣợng miếng gel (1 µl:1 mg) và ủ ở 0° trong 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đã hòa tan đƣợc chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng đƣợc LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 31 gạn bỏ. 500 µ đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung vào cột và ly tâm 1 phút với vận tốc 10.000 vòng/phút. Phần dịch đi qua màng đƣợc gạn bỏ. Lặp lại bƣớc này một lần nữa. Cột tinh sạch có chứa DNA đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới và bổ sung 100 µl Elution buffer vào chính giữa lớp màng silica của cột. Ly tâm 1 phút với tốc độ 10.000 vòng phút để thu DNA. Mẫu DNA tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20° để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. 2.2.5. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEM®-T Easy Cloning 2.2.5.1. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Phân đoạn S7 đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq polymerase, do đó sản phẩm tạo ra là các đoạn DNA có sẵn đầu A. Các đoạn DNA này dễ dàng ghép nối vào vector pGEMT có đầu T nhờ tác dụng của enzyme T4 ligase. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT đầu T đƣợc thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ kit, với các thành phần nhƣ sau: Thành phần Thể tích (µl) Đệm phản ứng 2X 10 µl Sản phẩm PCR 3 µl Vector đầu T pGEMT-T 1 µl T4 DNA ligase (5 u/µl) 1 µl H2O cất khử ion vô trùng 5 µl Tổng thể tích 20 µl Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó đƣợc ủ trong bể ổn nhiệt 16°C qua đêm. Plasmid pGEM-T có kích thƣớc khoảng 3kb có chứa trình tự mã hóa của gen kháng chất kháng sinh ampicillin (Hình 9), nhờ đó các tế bào mang vector có thể sinh trƣởng bình thƣờng ở môi trƣờng có chứa ampicillin với nồng độ ức chế tối thiểu. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 32 Hình 9: Vector nhân dòng pGEM-T và một số vị trí cắt của các enzyme cắt giới hạn trên vector pGEM-T Ngoài ra, vector này đƣợc thiết kế có gắn operon Lac chuyển hóa đƣờng lactose. Tại vùng ranh giới giữa promoter của operon này và gen cấu trúc lacZ mã hóa cho enzyme -galactosidase có vùng trình tự nhân dòng đa điểm cắt (Hình 9). Thiết kế này cho phép phân biệt đƣợc tế bào nào mang plasmid nguyên bản (không gắn thêm sản phẩm PCR) và tế bào nào mang plasmid tái tổ hợp có gắn thêm sản phẩm PCR. Đối với tế bào mang plasmid nguyên bản, gen lacZ hoạt động bình thƣờng để tổng hợp enzyme -galactosidase nên khi bổ sung cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG vào môi trƣờng, enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm màu xanh trong môi trƣờng có oxy. Đối với tế bào mang plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA lạ xen vào giữa Lac-promoter và gen lacZ làm cho enzyme -galactosidase không đƣợc tổng hợp nên khi có mặt X-gal và IPTG, quá trình chuyển hóa cơ chất không xảy ra và không tạo ra sản phẩm màu xanh. 2.2.5.2. Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.coli chủng DH5α Tế bào khả biến E.coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) đƣợc làm tan trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, 10 µl hỗn hợp phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào đƣợc sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó đƣợc chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút. Tiếp theo, 450µl LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ 37°C LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 33 trong vòng 20 phút trƣớc khi đƣợc nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong thời gian 30 phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100 µg/ml và ủ ở 37°C qua đêm. 2.2.6. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi lắc trong 5ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế bào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Tế bào đƣợc hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme RNase . Sau đó, 250 µl đệm P2 (lysis solution) đƣợc bổ sung vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo đều 4-6 lần. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. Tiếp theo, 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung và ly tâm 30- 60 giây, sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa. Cột tinh sạch chứa plasmid đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng/phút trong 1 phút. Lƣợng plasmid tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C. 2.2.7. Cắt enzyme giới hạn Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dƣơng tính sẽ đƣợc nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Lại Phương Liên – K20 Di truyền học 34 Enzym cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử là những enzyme endonuclease có khả năng nhận biết vị trí đặc hiệu trên DNA và phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi tại đó mà không gây tổn hại đến bazơ nucleotide. Trình tự nhận biết của enzyme giới hạn đƣợc cấu tạo từ 4 đến 6 đôi bazơ và có cấu trúc đối xứng nghịch đảo. Enzym cắt giới hạn có thể cắt ngay chính giữa trình tự nhận biết để tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng hoặc có thể cắt lệch tâm để tạo ra hai đoạn DNA có kiểu đầu dính. Phản ứng cắt giới hạn với EcoRI để kiểm tra sự có mặt của phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hợp có thành phần nhƣ sau: Thành phần Thể tích pGEM-T/S7 3,0 µl Đệm Fast Digest 10X 0,5 µl Enzyme EcoRI (10u/µl) 0,5 µl H2O khử ion vô trùng 1,0 µl Tổng thể tích 5,0 µl 2.2.8. Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng Nguyên tắc:Đoạn trình tự gen đặc hiệu sau khi đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T sẽ đƣợc đọc trên hệ thống m