Luận văn Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa kháng đạo ôn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR

át hoặc liên quan đến tính kháng đạo ôn được tiến hành một cách dễ dàng. Qua phân tích di truyền trên quần thể con lai F3 của cặp lai C101LAC (giống cho gen kháng Pi-1) và CO39 (giống dễ mắc bệnh đạo ôn) bằng kỹ thuật RFLP. Năm 2008, Masahiro và cộng sự cũng đã phát triển được một chỉ thị STS sử dụng cho chọn các dòng lúa mang gen kháng Pi-b trong bảy giống lúa nội địa của Hàn Quốc [46]. * Chỉ thị SSR Chỉ thị SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1- 6bp. Hiện tượng các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến ở động vật và thực vật. Tuy nhiên, tùy từng loài mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thường có các kiểu lặp lại : - Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau. - Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác. - Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau. Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 23 và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật. Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL). Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR Thuận lợi to lớn của phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình. Hơn nữa, khá năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gene, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền (Hokanson và cộng sự, 1998) [39]. SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những marker này so với những marker khác, như AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn. Chỉ thị SSR là một công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền. Khi các primer SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử dụng kỹ thuật này hoàn toàn không đắt tiền. Hơn nữa, sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là sự xác định những primer SSR thích hợp không cần thiết trong những loài có quan hệ gần [35], [39]. Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết kế primer chi Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 24 phí cao liên quan đến trình tự mồi chính xác cho loài quan tâm có thể không có sẳn, và vì thế khó để ứng dụng cho các nhóm không có hoạt động nghiên cứu, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau. Về cơ bản các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ di truyền hoặc nghiên cứu sự đa dạng di truyền hoặc phân lập gen, hoặc xác định gen, Tuy nhiên, mỗi loại chỉ thị có ưu nhược điểm riêng vì thế tuỳ vào mục đích, yêu cầu và điều kiện cụ thể của mỗi nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng chỉ thị nào cho thích hợp. Trong số các chỉ thị phân tử, thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế. Hiện nay, đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ Bộ gen lúa và như vậy trung bình cứ 157kp của phân tử ADN có một chỉ thị SSR [24], [25], [27], [29], [46], [64]. Đối với các nghiên cứu về bệnh lúa, SSR là một trong những kỹ thuật di truyền được xem là rất thích hợp trong việc lập bản đồ liên kết di truyền, phân tích đa dạng di truyền và trong các chương trình chọn giống kháng đạo ôn. Năm 2004, Fjellstrom và cộng sự phân tích trình tự genom gần locus Pi-z của dạng lúa Nipponbare, đã phát hiện một số lượng lớn các đoạn SSR có thể sử dụng làm chỉ thị. Ba chỉ thị SSR gồm AP5659-1, AP5659-3 và AP5659-5 liên kết rất chặt với locus Pi-z đã được phát triển để chọn giống lúa mang gen kháng Pi-z [31]. Năm 2004, Chen và cộng sự đã sử dụng giống lúa Digu, kháng bền với đạo ôn, đây còn là một nguồn giống quan trọng cho việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn ở Trung Quốc. Gen kháng đạo ôn của giống lúa này đã được phân lập để xác định vị trí gen kháng trên nhiễm sắc thể bằng các marker phân tử. Ngoài ra, còn một số lớn các giống khác, mỗi giống chứa một gen kháng bệnh đạo ôn như gen: Pik s ,Pia, Pik, Pi-b, Pi-k p , Pi-ta 2 , Pi-ta, Pi-z, Pi-i, Pi-k m ,Pi-z t , Pi-t và Pi-11, và các thế hệ con lai giữa Digu và mỗi giống này đều được phân tích với các chủng kháng đạo ôn của Trung Quốc. Kết quả cho thấy, tính kháng của Digu với hai chủng kháng của Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 25 Trung Quốc là ZB13 và ZB15 đều được kiểm soát bởi hai gen đơn trội, riêng biệt. Hai gen kháng này khác biệt với các gen kháng đã biết, vì vậy, chúng được thiết kế như Pi-d(t)1 và Pi-d(t)2. Bằng cách sử dụng marker phân tử RFLP: G1314A và G45 phân tích ở quần thể F2, Pi-d (t)1 được xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 2 với khoảng cách giữa 1,2 và 10,6 cM, Pi-d (t)2 được xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 6 với khoảng cách giữa 3,2 và 3,4 cM bằng các marker SSR là RM527 và RM3. Những kết quả này cung cấp thông tin cần thiết, khi sử dụng nhiều hơn nữa các gen kháng đạo ôn của giống lúa Digu cho mục đích chọn giống và nhân dòng các gen kháng bệnh đạo ôn ở lúa [25]. Năm 2009, Y Jia đã lai giống lúa Japonica nhiệt đới Katy chứa gen kháng đạo ôn Pi-ta và giống lúa Japonica ôn đới M202 (Pi-ta) đã được lây nhiễm với chủng IB49 của Magnaporthe oryzae mà chứa Pi-ta. Con lai kháng được xác định bằng cách lai hồi quy qua năm thế hệ. Mỗi thế hệ, con lai kháng đã được lựa chọn sử dụng một chủng nấm có chứa AVR-Pita, và lai với giống bố mẹ M202 dễ bị nhiễm. Hai con lai trong số 22 BC5F1 được xác định kiểu gen bằng cách sử dụng 12 marker SSR xung quanh vùng genom của Pi-ta trên nhiễm sắc thể 12. Nhóm nghiên cứu đã kiểm tra kích thước của gen đưa vào trong 43 con lai BC5F2 bằng cách sử dụng các marker SSR. Kết quả đã chứng minh rằng, một loạt các kích cỡ của ADN liên kết với thể cho đã được đưa vào giống bố mẹ hồi quy M202 và các giống ưu tú, còn ADN không được liên kết với thể cho đã bị loại bỏ khỏi cá thể BC5F2. Tuy nhiên, kích thước các đoạn xung quanh bộ gen Pi-ta khác nhau giao động từ một nửa (14Mbp) đến toàn bộ nhiễm sắc thể (27Mbp) đã được tìm thấy từ thể cho. Tương tự như vậy, các phân đoạn lớn của các kích thước có thể so sánh của vùng genom Pi-ta có nguồn gốc từ giống Tetep của Việt Nam, cũng được nhận biết trong Pi-ta của các giống lúa ở Mỹ như: Katy, Madison, Kaybonnet, và Drew. Điều này cũng xác định rằng Tetep có nhiễm sắc thể 12 giống hệt với giống Tadukan của Philippines. Nghiên cứu này chứng tỏ, một t lệ lớn của nhiễm sắc thể được duy trì bởi sự chọn lọc nhân tạo đối với tính kháng đạo ôn trong quá trình chọn giống [63]. Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 26 1.5.1.2. Chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn bằng QTL Để lập bản đồ kiểm soát gen kháng đạo ôn, Năm 2011, Hossein Sabouri và cộng sự đã sử dụng marker phân tử để xác định và lập bản đồ gen của cả hai loại gen kháng đạo ôn là kháng hoàn toàn và kháng một phần [40]. Một vài gen kháng chất lượng đã được nghiên cứu và lập bản đồ trong hệ gen của lúa. Ngoài ra, bốn gen Pi- 14 (t), Pi-16 (t), Pi-d (t) và Pi-25 (t) đã được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 2. Các tác giả cũng chỉ ra rằng, khả năng kháng đạo ôn ở lá được kiểm soát bởi 2 gen và sự có mặt của các alen kháng ở bất kỳ locus nào cũng tạo ra tính kháng. Hai gen Pi24 (t) và Pi25(t) được xác định lần lượt trên nhiễm sắc thể 12 và 6. Mặt khác, Yohei K và cộng sự (2009) đã lập bản đồ di truyền tính kháng trên bộ gen lúa. Hầu hết trong số các gen này được liên kết với các gen chất lượng đã được báo cáo trước đây [64]. Fuluoka và Okuno (2001) phát hiện 5 QTLs cho FBR trên nhiễm sắc thể 2, 4, 9 và 12 mà đã liên kết QTL với một marker RFLP, G271, ở giữa nhiễm sắc thể 4 [32]. Trước đây, Ballini và cộng sự (2009) đã đưa ra 1000 gen kháng, 88 gen kháng đã được lập bản đồ, 341 và 165 meta QTLs, điều này đã cung cấp thông tin cập nhật hữu ích về các gen kháng đạo ôn cũng như những hiểu biết mới để giúp xây dựng giả thuyết về các chức năng phân tử của QTL đạo ôn. Vì vậy mà trong những năm qua, nhiều gen kháng chính đối với đạo ôn đã được lập bản đồ thông qua các marker phân tử [20]. Mặc dù các phân tích QTL về FBR cho các giống lúa ở Iran có một sự đa dạng tốt, nhưng chưa có nhiều thông tin về việc xác định QTL và sự liên kết của chúng với tính kháng đạo ôn trong các nguồn gen lúa. Vì vậy, trong nghiên cứu này hai giống lúa địa phương là Khazar và Tarom Mahalli đã được chọn lọc. Khazar (KHz) là một giống thấp cây, đẻ nhánh tốt, năng suất cao và kháng đạo ôn tốt. Ngược lại, Tarom Mahalli (TAM) là giống cao cây hơn, hạt dài và nhạy cảm với đạo ôn. Một bản đồ liên kết SSR ở lúa bao gồm 123150cM được xây dựng sử dụng 74 marker đa hình SSR. Tổng số, 7 QTLs độc lập đã được phát hiện thông qua việc lập bản đồ kết hợp với tính kháng đạo ôn trên nhiễm sắc thể 1, 3, 4, 5 và 11. Những QTL này có thể được sử dụng hỗ trợ chương trình chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS) để cải thiện tính kháng đạo ôn ở các giống thơm, chất lượng [43]. Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 27 1.5.1.3. Tạo giống lúa chuyển gen kháng đạo ôn Ứng dụng công nghệ chuyển gen để tạo giống kháng là một trong những hướng được quan tâm hiện nay. Với mục đích tăng cường khả năng kháng đạo ôn, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã chuyển một số gen từ các nguồn thực vật khác nhau vào lúa. Năm 1997, Stark và cộng sự đã chuyển gen tổng hợp Stilbene ở cây nho vào tế bào trần của giống lúa Nipponbare nhờ PEG. Những tế bào mang gen chuyển được sàng lọc, tái sinh thành cây hoàn chỉnh sau đó được xử lý với dịch nấm Pyricularia oryzae để đánh giá tính kháng. Các kết quả của nghiên cứu cho thấy, tính kháng với nấm Pyricularia oryzae của các dòng lúa chuyển gen đã được tăng lên [17]. Năm 1999, Nishizawa và cộng sự đã sử dụng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium để chuyển gen Cht-1 và Cht-3 vào giống lúa Nipponbare và Koshihikari. Gen Cht mã hoá cho enzyme Chitinaza thu phân chitin, một trong những protein liên quan đến khả năng gây bệnh của nấm. Trichosanthin (TCS) là gen mã hoá cho protein ức chế hoạt động của ribosom trong một số loài nấm gây bệnh (bao gồm cả nấm đạo ôn Pyricularia oryzae) [50]. Trong một nghiên cứu khác, Kanzaki và cộng sự (2002) đã thành công trong việc tăng cường khả năng kháng nấm đạo ôn của lúa bằng cách tạo ra các dòng lúa chuyển gen mang gen Defensin (gen có khả năng ức chế sự phát triển của nấm đạo ôn được tách dòng từ cây Wasabia japonica) [43]. Gần đây, hướng nghiên cứu nhằm tạo ra những dòng lúa mang gen kháng Pi cũng được các nhà khoa học quan tâm. Tác giả Chen D và cộng sự (2010) đã sử dụng 3 vector biểu hiện khác nhau là pCB 6.3kb, pCB 5.3kb và pZH01 2.72kb chuyển gen kháng Pi-d2 (gen có phổ kháng rộng đối với nhiều chủng nấm đạo ôn) vào các giống Zhonghua 9, Taipei 309 và Nipponbare. Kết quả cho thấy, 9 dòng lúa chuyển gen mang gen Pi-d2 có khả năng chống chịu đa dạng với 39 chủng nấm đạo ôn, t lệ kháng cao nhất đạt 91,7% [23]. Năm 2011, Amit và cộng sự đã chuyển gen kháng Pi54 vào giống lúa Taipei 309 (giống dễ nhiễm bệnh) sử dụng vector chuyển gen pCAMBIA. Kết quả cho Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 28 thấy, các dòng lúa mang gen Pi54 từ thế hệ T1 đến thế hệ T3 có khả năng kháng với nhiều chủng nấm đạo ôn [18]. 1.5.1.4. Các gen kháng đạo ôn và chỉ thị phân tử liên kết Hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được 96 gen kháng đạo ôn. Các gen kháng nằm trên hầu hết các nhiễm sắc thể, ngoại trừ nhiễm sắc thể số 3 và nhiễm sắc thể số 10. Nhiều báo cáo đề cập đến phần lớn các gen kháng bệnh đạo ôn trên cây lúa cùng nằm trên các nhiễm sắc thể số 6, 11 và 12. Các nhà khoa học đã xác định có bảy gen kháng nằm trên nhiễm sắc thể số 1 là Pit, Pi27(t), Pi24(t), Pitp(t), Pi35(t), Pi37 và Pish. Trên nhiễm sắc thể số 2 có chín gen kháng gồm Pidl(t), Pig(t), Pitq5, Piy1(t), Piy2(t), Pib, Pi25(t), Pi14(t) và Pi16(t). Bốn gen kháng Pi21, Pikur1, Pi39(t) và Pi(t) nằm trên nhiễm sắc thể số 4. Ba gen kháng trên nhiễm sắc thể số 5 là Pi26(t), Pi23(t) và Pi10. Trên nhiễm sắc thể số 6 có 15 gen kháng gồm Pi22(t), Pi26(t), Pi27(t), Pi40(t), Piz-5, Piz, Piz-t, Pi9, Pi25(t), Pid2, Pigm(t), Pitq1, Pi8, Pi13(t) và Pi13. Trên nhiễm sắc thể số 7 hiện mới chỉ xác định được có một gen kháng là Pi17(t). Trên nhiễm sắc thể số 8 có 5 gen kháng gồm Pi36, Pi33, Pizh, Pi29(t) và PiGD-1(t). Trên nhiễm sắc thể số 9 có 5 gen kháng gồm Pii2(t), Pi5(t), Pi3(t), Pi15 và Pii. Trong đó, gen Pi5(t) nằm trên nhiễm sắc thể số 9 liên kết chặt với các chỉ thị phân tử JJ80-T3, JJ81-T3 và JJ113-T3 [38]. Đã xác định được 17 gen kháng trên nhiễm sắc thể số 11 gồm Pia, PiCO39(t), Pilm2, Pi30(t), Pi7(t), Pi34, Pi38, PBR, Pb1, Pi44(t), Pi1, Pi18(t), Pise1, Pif, Mpiz, Pikur2, Piisi và 6 alen ở locus Pik là Pik, Pik-s, Pik-p, Pik-m, Pik- h và Pik-g. Trong đó, gen Pi1 nằm trên nhiễm sắc thể số 11, liên kết chặt với chỉ thị phân tử RM1233, RM5926 và RM224 [39], [59]. Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 29 Trên nhiễm sắc thể số 12 có 17 gen kháng gồm Pita, Pita-, Pitq6, Pi6(t), Pi12(t), Pi19(t), Pi20(t), Pi21(t), Pi24(t), Pi31(t), Pi32(t), Pi39(t), Pi62(t), Pi157, IPi(t), IPi3(t) và PiGD-3(t) [59]. Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 30 Bản đồ của các gen Pi1, Pita (Pi-4t) Pi5(t), Piz và Pik-m đã được thiết lập và công bố trên trang web: [67] Bảng 1.4. Một số gen kháng quan trọng Gen Nhiễm sắc thể Giống lúa cho gen(Donor) Dạng lúa Nguồn tham khảo Pi37 Số 1 St. No. 1 Japonica Lin và cs, 2007 Pib Số 2 Tohoku IL9 Japonica Wang và cs, 1999; Fjellstrom và cs, 2004 Piz Số 6 Zenith - Goto và cs, 1981, Hashimoto và cs, 1988, Hayashi và cs, 2006 Piz-t Số 6 Toride 1 Japonica Zhou và cs, 2006 Piz-5(Pi2) Số 6 Tadukan Indica Zhou và cs, 2006 Pi9 Số 6 75-1-127(101141) Oryza minuta Qu và cs, 2006 Pi40 (Pi40(t)) Số 6 IR65482-4-236-2-2 (Acc100882) Oryza australiensis Jeung và cs, 2007 Pid2 Số 6 Digu Indica Chen và cs, 2006 Pi33 Số 6 IR64 Indica Berruyer và cs, 2003 Pi36 Số 8 Q61 Indica Liu và cs, 2003 Pi5(t) Số 9 RIL260(Moroberekan) Japonica Jeon và cs, 2003 PiCO39(T) Số 11 CO39 indica Chauhan và cs, 2002 Pi44(t) Số 11 RIL29(Moroberekan) - Chen và cs, 1999 Pik-h(Pi54) Số 11 Tetep Indica Sharma và cs, 2005 (-) Không rõ Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 31 Bảng 1.5. Một số chỉ thị liên kết chặt với các gen kháng đạo ôn Gen Kiểu chỉ thị Tên chỉ thị Khoảng cách (cM) Nguồn tham khảo Pi37 SSR RM302 0 Chen và cs, 2005 SSR RM212 0 Chen và cs SSR FPSM1 0,07 Chen và cs SSR FPSM2 0,14 Chen và cs SSR FPSM4 0 Chen và cs SSR RM166 2,3 Fjellstrom và cs SSR RM208 0 Fjellstrom và cs SSR RM266 2,2 Fjellstrom và cs SSR RM138 1,5 Fjellstrom và cs SSR RM166 1,5 Fjellstrom và cs SSR RM208 0 Fjellstrom và cs STS S15628 0 Chen và cs STS FSTS1 0 Chen và cs STS FSTS2 0,14 Chen và cs STS FSTS3 0 Chen và cs STS FSTS4 0 Chen và cs SNP b2 ** 0 Hayashi và cs, 2006 SNP B3989 1,2 Hayashi và cs, 2006 Pi40 SSR RM3330 2,4 Jeung và cs, 2007 SSR RM527 1,1 Jeung và cs, 2007 Pi36 SSR RM5647 0,4 Liu và cs, 2007 Pi33 SSR RM72 < 11,5 Berruyer và cs, 2003 SSR RM44 < 11,5 Berruyer và cs, 2003 Pik-h SSR RM206 0,7 Sharma và cs, 2005 SSR TRS26 0,7 Sharma và cs, 2005 Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 32 SSR TRS33 0,6 Sharma và cs, 2005 SSR RM224 0 Fjellstrom và cs SSR RM144 0,9 Fjellstrom và cs SSR RM12233 0,8 Fjellstrom và cs Pi20(t) SSR RM1337 0 Li và cs, 2008 SSR RM5364 0 Li và cs, 2008 SSR RM7102 0 Li và cs, 2008 Piz SNP Z60510 0,11 Hayashi và cs, 2006 SNP Z5765 0,13 Hayashi và cs, 2006 SNP Z56592 0 Hayashi và cs, 2006 Piz-t SNP Z60510 0,17 Hayashi và cs, 2006 SNP Z5765 0,17 Hayashi và cs, 2006 SNP zt56591 0 Hayashi và cs, 2006 Pik-m SNP K641 1,3 Hayashi và cs, 2006 SNP K6441 0 Hayashi và cs, 2006 SNP K4731 < 3,5 Hayashi và cs, 2006 Pita SNP ta642 1,2 Hayashi và cs, 2006 SNP Ta801 0 Hayashi và cs, 2006 SNP Ta3 0 Hayashi và cs, 2006 SNP Ta577 0 Hayashi và cs, 2006 1.5.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn ở Việt Nam Chọn tạo các dòng/giống lúa kháng đạo ôn bền vững được xem là biện pháp đem lại hiệu quả cao trước nguy cơ hình thành chủng nấm mới và bùng phát dịch bệnh. Để có đủ cơ sở dữ liệu và nguồn vật liệu cần thiết phục vụ cho công tác chọn tạo các giống lúa kháng đạo ôn, đáp ứng được yêu cầu của thực tế sản xuất chúng ta cần phải tiến hành nghiên cứu một cách toàn diện hơn nữa trong giai đoạn hiện nay. Triển khai giống kháng luôn tỏ ra là một trong những biện pháp hiệu quả trong quản lý bệnh đạo ôn. Tuy nhiên, các giống đơn gen thường bị mất hiệu lực rất nhanh sau Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 33 khi xuất hiện các chủng mới do chỉ kháng được một vài chủng địa lý nhất định. Nghiên cứu qui tụ đa gen kháng đạo ôn đã được tiến hành ở Việt Nam và đã đạt được những hiệu quả nhất định trong công tác phát triển giống lúa kháng bệnh đạo ôn. * Xác định gen kháng hiệu quả, qui tụ gen kháng vào các giống lúa và nghiên cứu lai tạo trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn • Xác định gen kháng hiệu quả Phạm Văn Dư và cộng sự đã lây nhiễm 158 isolates của 3 nhóm nấm chính gây bệnh đạo ôn (L1, L2 và L4) ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long trên 31 giống đơn gen mang lần lượt 24 gen kháng bệnh đạo ôn (Pia, Pia, Pii, Pik-s, Pik-s, Pik, Pik-p, Pik-h, Piz, Piz5, Piz-t, Pita, Pita, Pib, Pit, Pish, Pish, Pi1, Pi3, Pi5(t), Pi7(t), Pi9(t), Pi12(t), Pi19(t), Pik-m, Pi20(t), Pita-2, Pita-2, Pita, Pi11(t) và Piz-5) cho thấy t lệ isolates thuộc nhóm L1 tấn công các gen kháng biến động từ 0% - 98%, nhóm này không tấn công được một số gen kháng như Pik-s, Pik-p, Pik-h, Piz, Pita, Pi5(t), và Pi19(t), tương đương với t lệ 73%, 100%, 95%, 98%, 100%, 93%, và 93%. Nhóm L2 không tấn công được các gen kháng Pik, Pik-p, Pik-h, Pi1, Pi7(t), và Pik-m với t lệ 100%, 97%, 94%, 94%, 97% và 97%. Isolates thuộc nhóm L4 rất độc tấn công được tất cả các gen kháng với t lệ rất cao biến động từ 46% - 100%. Đánh giá chung cho thấy, trong 24 gen kháng thử nghiệm không có một gen nào còn hiệu lực hoàn toàn ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Tuy nhiên, hai gen Piz và Pik-m có t lệ isolates nấm gây bệnh đạo ôn tấn công thấp nhất là 25%. Hai gen này có thể được sử dụng trong chương trình lai tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn. Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự đã lây nhiễm nhân tạo để xác định các gen kháng hiệu quả qua sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo với bộ giống chỉ thị do IRRI cung cấp và các dòng lúa thuần của Việt Nam, cho thấy hai gen Pi-1 và Pi-5 kháng tốt nhất với các nòi nấm ở những vùng sinh thái nông nghiệp miền Bắc, t lệ kháng với các nòi nấm đều rất cao (Pi-1 là 82%; Pi-5 là 78%) (Bảng 1.4). Các gen kháng nói trên sẽ được sử dụng để qui tụ vào giống/dòng lúa để cải tạo tính kháng của chúng [3]. Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 34 • Qui tụ gen kháng vào các giống lúa Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự đã đưa gen kháng vào dòng/giống lúa thuần có năng suất và phẩm chất tốt đồng thời không làm mất đi những đặc tính quí này của giống. Thông qua việc lai hồi giao (BC), sẽ dần đưa trở lại những đặc tính quí của cây vào những cây có kiểu gen mong muốn (sử dụng chỉ thị phân tử trong việc lựa chọn những cá thể mong muốn). Khi tiến hành lai tạo đưa gen kháng đạo ôn (Pi) vào dòng/giống lúa có đặc tính quí (năng suất và phẩm chất tốt). Để chọn tạo được dòng/giống lúa vừa kháng đạo ôn lại mang những đặc tính quí chúng ta phải tiến hành lai hồi giao (BC) để đưa trở lại dần những đặc tính quí đó. Quá trình được tiến hành qua 5 thế hệ (tới thệ hệ BC3F1), ở mỗi thế hệ lại sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng để chọn lựa những cây mong muốn [3]. • Nghiên cứu lai tạo trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự đã lai qui tụ gen kháng bệnh đạo ôn Pi-1 và Pi-5 vào dòng lúa được tạo ra bằng phương pháp đột biến phóng xạ bằng tia gama ở nhiệt độ (600C) giống lúa Bắc thơm 7. Quá trình qui tụ 2 gen kháng đạo ôn Pi-1 và Pi-5 được tiến hành cùng lúc. Khi đã có được 2 cá thể BC3F2Pi-1 và BC3F2Pi-5 mang kiểu gen đồng hợp tử gen kháng Pi-1 và Pi-5, đồng thời vẫn mang trên mình nền của dòng lúa triển vọng ban đầu. Tiến hành lai tạo đưa 2 gen Pi-1 và Pi-5 vào cùng một cá thể, đồng thời tiến hành sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lựa được dòng có triển vọng (đồng hợp tử 2 gen kháng đạo ôn) từ việc tiến hành tự thụ cá thể F1 (mang 2 gen kháng Pi-1 và Pi-5). Do gen Pi-1 và gen Pi-5 nằm trên 2 nhiễm sắc thể (NST) khác nhau (Pi-1 nằm trên NST số 11 và Pi-5 nằm trên NST số 9); Nên ta có thể qui ước như sau: p2p2 là cặp gen nằm trên NST số 9 của cây lúa được qui tụ gen Pi-1 (là gen lặn, không được biểu hiện ra bên ngoài kiểu hình) có vị trí tương ứng với vị trí của gen Pi-5 (có kiểu gen P2P2) trên NST số 9; p1p1 là cặp gen nằm trên NST số 11 của cây lúa được qui tụ gen Pi-5 (là gen lặn, không được biểu hiện ra bên ngoài kiểu hình) có vị trí tương ứng với vị trí của gen Pi-1 (có kiểu gen P1P1) trên NST số 11. Bởi vậy, khi tiến hành lai tạo giữa BC3F2Pi-1 và BC3F2Pi-5 chúng ta sẽ có những kiểu gen của F1 là P1p1P2p2. Khi F1 tiến hành tự thụ; sử dụng chỉ Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 35 thị phân tử để chọn cá thế mang kiểu gen đồng hợp tử trội gen kháng (có kiểu gen P1P1P2P2) mang hai gen Pi-1 và P-5 kháng đạo ôn. Qua nhiều thế hệ chọn lọc đánh giá dòng lúa triển vọng đã ổn định, có tiềm năng năng suất cao hơn giống Bắc thơm 7, chống chịu tốt, kháng đạo ôn và chống chịu sâu, chúng được đặt tên là dòng NB-01 [3]. Nguyễn Thị Lang và cộng sự đã tạo ra sáu tổ hợp lai, OM 24/IR 64, IR 24/OM 2514, C 53/IR 64, C53/OM 2514, OM 1308/TeTep và IR 36/C53. Trong số đó, có bốn tổ hợp lai đã được lập bản đồ bằng cách sử dụng marker phân tử. Các gen kháng là di truyền trội và nằm trên nhiễm sắc thể 6, 8 và 11. Marker SSR (RM 483) đã được sử dụng để phát hiện khả năng kháng đạo ôn của 100 giống địa phương ở Đồng bằng sông Cửu Long. So sánh giữa chọn lọc kiểu hình và kiểu gen cho thấy sử dụng marker SSR với mồi RM 483 chính xác đến 100%, so với hệ thống chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS). Những phương pháp này có thể được áp dụng trong thực tế để lựa chọn các giống lúa có gen kháng bệnh đạo ôn cao. Đa hình cũng cho thấy MAS đạt độ chính xác 100% khi sử dụng marker STS với mồi RG64 và chính xác đến 99,49% khi sử dụng marker SSR với mồi RM21. Ngoài ra, một số giống lúa kháng đạo ôn như P(OM1), OMP2, OMP4, OMP5 và OMP6 đã được báo cáo bởi nhiều nhà khoa học. Đây được coi là nguồn vật liệu có giá trị cho gen kháng để tạo ra các giống kháng bền [48]. Luận văn thạc sỹ Đặng Đình Hoàn 36 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn 34 giống lúa kháng đạo ôn được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân hàng gen của Viện Lúa đồng bằng sông Cửa Long (Bảng 2.1). Bảng 2.1. Danh sách 34 giống lúa kháng đạo ôn nghiên cứu TT SĐK Tên giống Kí hiệu Mẫu thu 1 958 Tan lanh D1 Hạt 2 1980 Nếp nương cẩm D 2 Hạt 3 2049 Nếp râu D 3 Hạt 4 2071 I mèo D 4 Hạt 5 2079 Lâu châu plat D 5 Hạt 6 2119 San pa toong D 6 Hạt 7 2131 Đle la tong D 7 Hạt 8 2134 Đle te lo D 8 Hạt 9 2136 Đ'le p'lu D 9 Hạt 10 2156 Lúa venth D 10 Hạt 11 2173 Lúa length D 11 Hạt 12 2380 Nếp cẩm D 12 Hạt 13 2431 Chiêm ngân D 13 Hạt 14 2