Luận văn Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử một số taxon thuộc chi sâm (panax l.) ở vùng Tây Nghệ An

vitzky và cộng sự [23] công bố trong một loạt các công trình nghiên cứu về họ Araliaceae ở miền Bắc Việt Nam [24,25,26]. Từ đó, Sâm vũ diệp đã đƣợc ghi nhận trong tất cả các tài liệu về cây thuốc và hệ thực vật ở Việt Nam. Viguier (1908 – 1923) là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam chỉ mô tả đặc điểm và phân bố của chi Panax. Nhƣng không trích dẫn tài liệu tham khảo, dẫn đến gây khó khăn cho ngƣời nghiên cứu tiếp theo và chƣa xác định đƣợc các loài có phân bố ở Việt Nam. [27] Phạm Hoàng Hộ (1970) [28] là ngƣời đầu tiên ghi nhận thứ Sâm nhật 9 (P. schinseng Nees var. japonicum Mak.) có ở rừng dày ẩm, núi Langbian (Lâm Đồng) trong bộ “Cây cỏ Việt Nam”. Ông mô tả ngắn gọn về đặc điểm hình thái, sinh thái, phân bố và hình vẽ của thứ này. Năm 1973, Võ Văn Chi & cs trong cuốn “Cây cỏ thƣờng thấy ở Việt Nam” mô tả Panax pseudoginseng Nees – Tam thất kim bất [29]. Năm 1993, Phạm Hoàng Hộ [30] đã mô tả 3 loài thuộc chi Panax L. có ở Việt Nam là Sâm hai lần chẻ - P. bipinnatifidus Seem, có ở Hoàng Liên Sơn, Sâm nhật - P. japonica (Nees) Meyer có ở Langbian, Kon Tum và Giả nhân sâm - P. pseudoginseng Wall, có ở Sa Pa. Trong lần tái bản vào năm 2000, ngoài hai loài Sâm hai lần chẻ và Giả nhân sâm, Phạm Hoàng Hộ còn bổ sung thêm một loài Sâm ngọc linh - P. vietnamensis Ha et Grushv. có ở Gia Lai - Kon Tum. Còn loài Sâm nhật ông ghi có ở Langbian và cả ở Kon Tum. Nhƣ vậy theo Phạm Hoàng Hộ, trên địa bản tỉnh Kon Tum hoặc Gia Lai - Kon Tum cũ, có cả hai loài Sâm nhật và Sâm việt nam. Còn đối với Sâm nhật ở Kon Tum, ông không ghi rõ nguồn mẫu xác định và nơi phân bố cụ thể, điều này gây trở ngại cho việc các định loài Sâm nhật kể trên có thực sự phân bố tự nhiên ở Việt Nam hay không. Trong khi đó, loài Sâm nhật do Phạm Hoàng Hộ đã từng ghi nhận ở Langbian cũng chính là Sâm việt nam hay Sâm ngọc linh đƣợc Hà Thị Dụng và Grushvitzky [31] (1996) công bố là loài mới cho khoa học và đặt tên là P. vietnamensis Ha et Grushv. Năm 1993, Trần Đình Lý trong cuốn “1900 loài cây có ích ở Việt Nam”, mô tả rất ngắn gọn về phân bố và tác dụng của P. vietnamensis Ha et Grushv., P. bipinnatifidus Seem. và P. Pseudoginseng Wall. [32]. Năm 1995, Đỗ Tất Lợi trong cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam” đã mô tả rất chi tiết về lịch sử ra đời, hình thái, thành phần hóa học, tác dụng dƣợc lý, công dụng và liều dùng của hai loài là P. vietnamensis Ha et Grushv và P. pseudoginseng Wall.[33] Năm 1997, Võ Văn Chi [34] trong cuốn “ Từ điển cây thuốc Việt Nam” mô tả về P. pseudoginseng Wall. Loài của Nam Trung quốc và Bắc Việt Nam. Ở nƣớc ta cây mọc hoang và đƣợc trồng nhiều ở Hà Giang, Lào Cai, 10 Cao Bằng tại các vùng núi cao lạnh 1200 – 1500 m; Tam thất hoang P. bipinnatifidus Seem – Vũ diệp tam thất. Loài của Nam Trung Quốc và Bắc Việt Nam, ở độ cao 1900 – 2400 m trong rừng ẩm, cây mọc hoang ở vùng núi cao lạnh của tỉnh Lào Cai. Cũng đƣợc trồng và mọc tốt nhƣ Tam thất; Sâm ngọc linh P. vietnamensis Ha et Grushv là loài đặc hữu của Việt Nam mọc tập trung trong 13 xã thuộc 3 huyện miền núi Ngọc linh, thuộc hai tỉnh Kon tum và Quảng Nam. Cả ba loài này tác giả đều mô tả đầy đủ về hình thái, bộ phận sử dụng, nơi sống và thu hái, thành phần hóa học cũng nhƣ công dụng. Năm 1997, Lê Trần Đức trong cuốn “Cây thuốc Việt Nam trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu” đã mô tả rất chi tiết về đặc điểm hình thái, điều kiện sống, kĩ thuật trồng và chăm sóc, trị sâu bệnh, cách thu hái và chế biến, công dụng của P. pseudoginseng Wall. Phần cuối mô tả tác giả có ghi phụ chú cho biết P. vietnamensis Ha et Grushv và củ Tam thất mọc hoang – P. bipinnatifidus Seem cũng đƣợc dùng với hiệu quả gần nhƣ P. pseudoginseng Wall. [35] Năm 2000, Phạm Hoàng Hộ [36] trong cuốn “Cây cỏ Việt Nam” đã chỉnh sửa thành P. bipinnatifidus Seem. Sâm hai lần kép đƣợc tìm thấy ở núi Hoàng Liên Sơn. Điểm khác biệt là trong quyển 2 xuất bản năm 2000 Phạm Hoàng Hộ bổ sung thêm đặc điểm hình thái, sinh thái, phân bố và vẽ hình của loài P. vietnamensis Dung & Grushv. Sâm việt tìm thấy ở Gia Lai, Kon Tum. Nhìn chung các công trình của Phạm Hoàng Hộ còn mang tính chất thông kê đặc điểm hình thái, sinh thái, phân bố và vẽ hình chƣa mô tả đặc điểm chi, chƣa chỉ ra mẫu nghiên cứu và mẫu chuẩn cũng nhƣ bảo tàng lƣu giữ mẫu. Tuy nhiên đây đƣợc coi là tài liệu phân loại thực vật về chi Panax ở Việt Nam có giá trị nhất tới thời điểm này. Năm 2003, Lê Trọng Cúc & cs [37] trong “Danh lục các loài thực vật Việt Nam”, tập II mô tả về 3 loài: P. bipinnatifidum Seem. 1868 ( CCVN, 2: 640), - Aralia bipinnatifida C. B. Clarke, 1879, - P. pseudoginseng var. bipinnatifidus (Seem) H. L. Li, 1942 (FLPF, 54:187), - Vũ diệp tam thất, sâm vũ diệp, Trúc tiết nhân Sâm, tam thất lá xẻ, Tam thất hoang, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất, phân bố ở Lai Châu (Tà Phỉn), Lào Cai (Sa Pa), còn có ở Ấn 11 Độ, Trung Quốc; P. pseudoginseng Wall. 1829 (CCVN, 2: 641) đƣợc trồng ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phố Bằng, So Phin), Cao Bằng (Tắc Tẻ, Thông Nông), Vĩnh Phúc ( Tam Đảo), còn có ở Nêpal, Trung Quốc; P. stipuleanatus, Tsai & Feng, 1975 – Tam thất hoang, Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Sâm tam thất, Phan xiết ( H’Mông) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa: Núi Hàm Rồng, xã Tà Phỉn, xã Bản Khoang, còn có ở Trung Quốc (Vân Nam); P. vietnamensis Ha & Grushv. 1985 (“vietnamensis”) – Sâm ngọc linh phân bố ở Quảng Nam (Trà My, Trà Linh, Trà Cang), Kon Tum (Đac Glây, Đác Choong, Ngọc Linh, Đác Tô), Gia Lai (Long Hi), Lâm Đồng (Lang Bian). Tác giả mô tả ngắn ngọn về hình thái, phân bố, sinh thái và công dụng. Năm 2005, Nguyễn Tập [6] sau khi nghiên cứu và hệ thống lại các loài thuộc chi Panax đã kết luận chi Panax ở Việt Nam có 5 loài, trong đó 3 loài mọc tự nhiên là Sâm vũ diệp - P. bipinnatifidus Seem., Tam thất hoang - P. stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng và Sâm việt nam - P. vietnamensis Ha et Grushv. Cùng với hai loài nhập trồng là Nhân sâm - P. ginseng và Tam thất P. notoginseng. Đồng thời cũng chính thức mô tả loài Tam thất hoang - P. stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng. Từ đó đến nay, các tài liệu nhƣ: “Các loài cây thuốc cần bảo tồn”, “Danh lục đỏ cây thuốc Việt Nam”, “Danh lục thực vật Việt Nam” .v.v. đều đề cập đến loài Tam thất hoang - P. stipuleanatus H.T. Tsai et KM. Feng kể trên. Tác giả mô tả đầy đủ chi tiết về các loài Sâm này. Năm 2007 “Sách đỏ Việt Nam” [38] mô tả về 3 loài thuộc chi Panax gồm: P. bipinnatifidus (Seem). 1868 – Sâm vũ diệp (tên khác: Ngật đáp thất, Tam thất hoang, Tam thất lá xẻ, Trúc tiết nhân sâm, Vũ diệp tam thất) phân bố ở Lai Châu (Tả Phìn), Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Than Uyên, núi Hoàng Liên Sơn), còn có ở Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc; P. stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng. 1975 phân bố ở Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, núi Hoàng Liên Sơn), ngoài ra còn có ở Trung Quốc (Vân Nam); P. vietnamensis Ha & Grushv. 1985 phân bố ở Quảng Nam (Trà My), Kon Tum (Đăk Tô, Đắk Glei, núi Ngọc Linh, Gia Lai, Lâm Đồng, còn có ở Trung Quốc. Cả ba loài này Sách đỏ đều ghi lại đặc điểm nhận dạng, sinh học và sinh thái, phân bố, giá trị, tình 12 trạng, phân hạng, biện pháp bảo vệ kèm ảnh minh họa. Năm 2013, Phan Kế Long & cs. [39] đã ghi nhận bổ sung cho khu hệ thực vật Việt Nam thứ P. vietnamensis var. fuscidiscus K. Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai vốn đƣợc phát hiện trƣớc đó ở Vân Nam, Trung Quốc. Nhóm nghiên cứu đã phát hiện một số điểm phân bố của thứ loài này tại Mƣờng Tè, Tam Đƣờng và Sìn Hồ tỉnh Lai Châu nên đƣợc đặt tên là Sâm lai châu. Tác giả mô tả đầy đủ chi tiết về đặc điểm hình thái, phân bố, công dụng. Năm 2014, Phan Kế Long & cs. [40] tiếp tục nghiên cứu đặc điểm hình thái và DNA của 7 mẫu cây không có cơ quan sinh sản thuộc chi Panax thu thập đƣợc ở núi Phu Xai Lai Leng (Kỳ Sơn, Nghệ An). Kết quả cho thấy các mẫu nghiên cứu có mối quan hệ gần gũi với loài Tam thất hoang - P. stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng (dựa trên trình tự vùng gen ITS-rDNA). Các mẫu có đặc điểm chung là lá từ không xẻ thùy đến xẻ thùy 1 lần (thùy nông hoặc sâu); cuống lá có lá kèm. Đến năm 2016, Trần Ngọc Lân và cộng sự [41] đã nghiên cứu đặc điểm hình thái, thành phần hóa học và chỉ thị DNA của các mẫu đƣợc gọi là "Sâm puxailaileng" cũng thu thập ở địa điểm trên. Nghiên cứu đã cho thấy các mẫu này có mối quan hệ gần gũi với Sâm việt nam (P. vietnamensis), khác xa với Tam thất hoang (P. stipuleanatus) và Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus) và kết luận "Sâm phu xai lai leng" thuộc loài P. vietnamensis Ha et Grushv.. Các mẫu này đƣợc tác giả cho rằng có đặc điểm đặc trƣng phân biệt với "Tam thất hoang" ở "thân rễ mang các đốt mọc cùng 1 hƣớng, khi sấy khô thƣờng dẻo và chuyển màu đen" trong khi loài "Tam thất hoang" có "thân rễ có các đốt thƣờng mọc so le, khi sấy khô thƣờng cứng và chuyển màu trắng". Tuy nhiên, những đặc điểm quan trọng khác lại chƣa đƣợc mô tả chi tiết nhƣ: có hay không có lá kèm, hình dạng và màu sắc đĩa tuyến mật, hình dạng và màu sắc quả chín... Ngoài ra, các tác giả đã không đề cập tới nơi lƣu giữ các tiêu bản nghiên cứu. Sự không thống nhất của các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS-rDNA trên các cá thể thuộc chi Panax cùng thu thập ở vùng núi Phu Xai Lai Leng ở trên có thể do tại đây có sự tồn tại của nhiều hơn 1 loài Panax. Cả hai nhóm nghiên cứu đều cho rằng cần có những 13 nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm hình thái và chỉ thị phân tử của các loài để có đƣợc những kết quả chính xác hơn. Nông Văn Duy & cs (2016) [42] khi nghiên cứu đặc điểm hình thái và chỉ thị phân tử vùng gen ITS1-5.8S-ITS2, 18S rRNA và matK của quần thể "Sâm langbiang" phân bố ở Cao nguyên Lâm Viên (núi Lang Biang, Lâm Đồng) đã công bố đây là thứ mới của loài Sâm việt nam và đặt tên là P. vietnamensis var. langbianensis N.V. Duy. V.T. Tran & L.N. Trieu. Từ những nghiên cứu trên cho thấy chi Nhân sâm (Panax L.) ở Việt Nam gồm 03 loài và 02 thứ ở Việt Nam mọc hoang dã bao gồm Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus), Sâm việt nam hay còn đƣợc gọi là Sâm ngọc linh (P. vietnamensis var. vietnamensis), Sâm lai châu (P. vietnamensis var. fuscidiscus) và Sâm langbian (P. vietnamensis var. langbianensis). 14 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu Mẫu vật nghiên cứu bao gồm: - 04 mẫu Sâm tự nhiên ở khu vực núi Phu Xai Lai Leng (Ký hiệu Panax TB1 đến Panax TB4) trong đó có 02 mẫu có hoa non, lá, thân, rễ củ (Panax TB1 và Panax TB2). - 03 mẫu Sâm tại vƣờn ƣơm: 01 mẫu Sâm (Ký hiệu Panax TH1) gồm lá và củ đƣợc thu tại vƣờn ƣơm ở xã Na Ngoi, Kỳ Sơn, Nghệ An; 02 mẫu sâm gồm lá và củ (Ký hiệu Panax ML1 và Panax ML2) đƣợc thu tại vƣờn ƣơm ở xã Mƣờng Lống, Kỳ Sơn, Nghệ An thuộc sở hữu của Công ty TNHH TH true MILK. 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Phòng Thực vật học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam. 2.1.3. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu * Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm: - Taq PCR mastermix 2x (QIAgen, Mỹ). - BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ). - Dung dịch TBE 10x (10mM Tris, 0.9 mM axir boric, 0.01 mM EDTA) của hãng Invitrogen, Mỹ. - Thuốc nhuộm an toàn (Malaysia). - Kít tách chiết DNA (Trung Quốc). - Kít tinh sạch sản phẩm PCR: QIAgen Quick Gel Extraction Kit (QIAgen, Mỹ). - Agarose (Invitrogen, Mỹ). 15 - Sephadex G50 (Sigma, Mỹ). - Các hóa chất tách chiết và tinh sạch DNA (NaCl, CTAB, EDTA, Tris- HCl, β-Mercaptoethanol, Isopropanol, Sodium acetate 3M, ethanol 100%, 70%, Rnase (10mg/ml) - Hóa chất điện di agarose (agarose, đệm TAE, dye ...). * Hóa chất cho phản ứng PCR: - Taq DNA polymerase - MgCl2 - Mastermix 2X bao gồm: + dNTP + MgCl2 + Taq DNA polymerase 2.1.4. Thi t ị và dụng cụ nghiên cứu * Các thiết bị chính sử dụng trong thao tác thực hiện thí nghiệm: - Tủ lạnh thƣờng và tủ lạnh sâu. - Bể ổn nhiệt và lò vi sóng. - Tủ khử trùng, máy sấy chân không. - Máy khuấy từ, máy trộn. - Máy soi cực tím. - Máy khử trùng Mac - 250Nex (Sanyo, Nhật Bản). - Máy định lƣợng DNA NanoDrop One (Thermo scientific – Mỹ). - Cân phân tích (Precisa, Thụy Sĩ). - Máy ổn nhiệt (Memmert, Đức). - Máy trộn rung (Vortex - Fluka, Mỹ). - Máy ly tâm 5415D (Eppendorf, Đức). 16 - Máy ly tâm lạnh (Hitachi, Nhật). - Máy PCR Mastercycler (Eppendorf, Đức). - Máy điện di agarose gel (BioRad, Mỹ). - Máy soi gel (UVP, Mỹ). - Pipette, đầu côn, ống eppendorf. * Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu: Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi nhân bản vùng ITS-rDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi theo Phan Kế Long và cs. (2014) Ký hiệu cặp mồi Trình tự nucleotide (5’– 3’) Kích thƣớc Lý thuy t (bp) Nhiệt độ bắt cặp (Tm) C PaITS-F 5’- CAC TGA ACC TTA TCA TTT AG AG -3’ 700 49-50 PaITS-R 5’- CTT ATT GAT ATG CTT AAA CTC AG -3' * Phần mềm xử lý số liệu: - ClustalW [43 ] - GeneDoc 2.5 [44] - MEGA X [45] 17 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thí nghiệm 2.2.2. Phƣơng pháp thu thập mẫu Thu thập mẫu cây trƣởng thành trong các chuyến thực địa ở khu vực núi Phu Xai Lai Leng với cơ quan sinh sản để làm tiêu bản, chụp ảnh, ghi chép, gắn etiket cho mẫu, mô tả Đối với cây non và cây trong vƣờn ƣơm chỉ thu mẫu lá và ghi nhận đặc điểm hình thái lá, củ; thu 01 lá chét và bảo quản trong túi nylon có chứa silicagel. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc -20oC cho đến khi phân tích. Thiết kế mồi Tách chiết PCR Đọc kết quả trình tự gen Cặp mồi DNA Tổng số Phân tích số liệu, so sánh với các loài thuộc chi Panax và loài ngoài nhóm Vùng gen ITS- rDNA Cặp mồi Khai thác trình tự trong NCBI Mẫu lá sâm Giải trình tự 18 2.2.3. Phƣơng pháp định loại hình thái Chụp ảnh, mô tả mẫu vật thu thập đƣợc Phân loại mẫu vật sử dụng phƣơng pháp so sánh hình thái dựa vào các tài liệu có liên quan, đặc biệt là các tài liệu định loại ở Việt Nam, các nƣớc lân cận Việt Nam và tài liệu mô tả gốc của các chi. 2.2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu sinh học phân tử 2.2.4.1. Phương pháp tách chi t DNA tổng số DNA tổng số của các mẫu sâm đƣợc tách chiết bằng Dneasy Plant Mini Kit theo qui trình sau: - Lấy mẫu lá bảo quản lạnh sâu (-20◦C) đem nghiền trong nitrogen lỏng (-196◦C) thành dạng bột mịn. Lấy 100mg bột cho vào ống eppendorf 1,5ml. - Thêm 400μl đệm AP1 và 4ul Rnase A. Trộn đều bằng vortex và ủ ở 65◦C trong 10 phút. Đảo trộn 2 – 3 lần trong quá trình ủ. - Thêm 130μl đệm AP2. Trộn đều và ủ trong đá 5 phút. - Hút dịch ly giải vào cột QIAshredder Mini. Ly tâm tốc độ 14000rpm trong 2 phút. - Chuyển dịch qua cột vào ống eppendorf 1,5ml mới nhƣng không xáo trộn. Thêm 1,5 lần thể tích đệm AP3/E và trộn đều bằng pipet. - Chuyển 650μl hỗn dịch vào cột Dneasy Mini. Ly tâm tốc độ 8000rpm trong 1 phút. Loại bỏ dịch qua cột. Lặp lại bƣớc này với phần hỗn dịch còn lại. - Đặt cột vào ống thu mới. Thêm 500μl đệm AW và ly tâm 8000rpm trong 1 phút. Loại bỏ dịch qua cột. - Thêm 500μl đệm AW. Ly tâm 14000rpm trong 2 phút. Loại bỏ dịch qua cột. - Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml có ghi nhãn. Thêm 100μl đệm AE để hoà tan. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 6000rpm trong 1 phút. Lặp lại bƣớc này, thu đƣợc dịch chiết chứa DNA tổng số, bảo quản ở -20◦C. 19 - Kiểm tra nồng độ DNA tổng số bằng máy định lƣợng DNA NanoDrop One (Thermo scientific – Mỹ) (Hình 2.2). Hình 2.2. Máy đo NanoDrop one 2.2.4.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)  Ti n hành: - Sau khi đo nồng độ DNA khuôn, tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu nhƣ nhau để khi đƣa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn đƣợc giống nhau, và đạt nồng độ 10ng trong tổng thể tích là 25 l/ 1 phản ứng. - Tính lƣợng thể tích các thành phần khác trong phản ứng, trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn DNA. 20 - Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu trình và cho máy chạy. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với các thành phần nhƣ Bảng 2.2 Bảng 2.2. Các thành phần phản ứng PCR TT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl) 1 Taq PCR Mastermix 2x 12,5 2 Mồi xuôi 20 mM 1,0 3 Mồi ngƣợc 20 mM 1,0 4 DNA tổng số 10 ng 1,0 5 Nƣớc cất khử ion - 9,5 Tổng 25,0 Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau: (Hình 2.3) Hình 2.3. Chu trình phản ứng PCR 96 o C 96 o C 2 phút 30 giây 50 o C 25 giây 72 o C 72 o C 40giây 5 phút  35 chu kì 4 o C 21 2.2.4.3. Tinh sạch sản phẩm PCR Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng QIAquick  Các bƣớc tiến hành: Sử dụng Dneasy plant mini kit (Qiagen, Đức) để tinh sạch sản phẩm PCR. Các bƣớc tinh sạch sản phẩm: Bước 1: Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%. 22 Bước 2: Cắt đoạn gel chứa băng DNA của từng mẫu, cho vào eppendorf 1,5 ml. Bước 3: Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt. Bổ sung 3 lần thể tích dung dịch QG theo trọng lƣợng từng mẫu (1g gel tƣơng đƣơng 1000 μ dung dịch QG). Bước 4: Ủ ở 50 0C trong 10 phút cho tới khi gel tan hoàn toàn. Để làm tan gel tốt. lắc đều eppendorf vài lần trong quá trình ủ, mỗi lần cách nhau 2 - 3 phút. Bước 5: Khi gel đã tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch mẫu. Màu của dung dịch tốt là màu vàng của QG ban đầu. Bước 6: Hút toàn bộ dung dịch cho vào cột MinElute đặt trong ống thu dịch ly tâm của Kit và ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút. Bước 7: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, cho 700 μl dung dịch PE vào cột, để mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút. Bước 8: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác và ly tâm với 13.000 rpm trong 1 phút. Bước 9: Chuyển cột sang eppendorf 1,5 ml đã ghi kí hiệu mẫu, cho 10 μl EB vào cột và ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút. Bước 10: Bỏ cột, bảo quản sản phẩm PCR trong ống eppendorf ở -20 0C. Bước 11: Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự ở Công ty Macrogen (Hàn Quốc). 2.2.4.4. Phương pháp phân tích số liệu - Sử dụng chƣơng trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng đã đƣợc các tác giả khác công bố trên ngân hàng DNA (Genbank). - Các trình tự DNA đƣợc so sánh, phân tích với các loài thuộc chi Panax và loài Eleutherococcus senticosus là loài ngoài nhóm (Bảng 2.3) sử dụng các phần mềm ClustalW [46], GeneDoc 2.5 [47], phần mềm MEGA X [48] đƣợc dùng để phân tích tiến hóa phân tử và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phƣơng pháp Maximum Likelihood (ML) với giá trị 23 bootstrap dùng để đánh giá độ tin cậy của cây phát sinh chủng loại đƣợc tính với 1.000 lần lấy mẫu thử (resampling) [45, 46]. Bảng 2.3. Danh sách trình tự sử dụng trong nghiên cứu thu thập trên Genbank TT Loài/thứ ITS 1 P. ginseng U41680 U41681 2 P. quinquefolius U41688 U41689 3 P. japonicus Nhật Bản (JP) U41702 AF263373 4 P. japonicus var. major U41683 5 P. japonicus var. bipinnatifidus U41679 6 P. japonicus var. angustifolius AY271915 7 P. japonicus var. bipinnatifidus HQ112421 8 P. notoginseng U41685 9 P. zingiberensis U41699 10 P. vietnamensis var. vietnamensis Trà Linh, Quảng Nam KJ418193 11 P. vietnamensis var. langbianensis Langbian, Lâm Đồng KX768322 12 P. vietnamensis var. fuscidiscus Mƣờng Tè, Lai Châu, Việt Nam (MT) KJ418191 24 TT Loài/thứ ITS 13 P. vietnamensis var. fuscidiscus Tam Đƣờng, Lai Châu, Việt Nam (TĐ) KJ418187 14 P. vietnamensis var. fuscidiscus Sìn Hồ, Lai Châu, Việt Nam (SH) KJ418184 15 P. pseudoginseng U41693 U41694 16 P. assamicus AY233322 17 P. trifolius U41698 18 P. wangianus U41690 19 P. sinesis AY271920 20 P. omeiensis U41692 U41686 21 P. shangianus AY233328 22 P. stipuleanatus HQ112444 HQ112441 AY271921 AY271922 23 P. stipuleanatus Tam Đƣờng, Lai Châu, Việt Nam (TĐ) KJ418196 24 Eleutherococcus senticosus AB570259 25 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đặc điểm nhận bi t chi Panax Trên cơ sở kết hợp giữa phân loại về hình thái và đặc điểm trình tự vùng gen ITS-rDNA, đề tài đã xác định đƣợc 03 loài thuộc chi Panax ở khu vực Tây Nghệ An. Khóa định loại các loài thuộc chi Panax ở vùng Tây Nghệ An 1a. Gốc cuống lá có phần phụ dạng gai. 1. Panax notoginseng 1b. Gốc cuống lá không có phần phụ 2a. Lá chét có cuống dài 0,5-0,8 cm 2. Panax stipuleanatus 2b. Lá chét không cuống hay gần nhƣ không cuống3. Panax zingiberensis 3.1.2. Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen ex C.H. Chow - Tam thất F.H.Chen ex C.H. Chow, 1975. Acta Phytotax. Sin. 13(2):41; Xiang Q. et al. 2007. Fl. China, 13: 490. - Aralia quinquefolius var. notoginseng Burk. 1920 Cây thân thảo, cao 20-60 cm. Thân rễ nạc, rễ củ 1 hoặc nhiều hơn, màu trắng đục, hình con quay, chiều dài từ 5-12cm, đƣờng kính khoảng 1-5cm. Lá 3-6, mọc vòng ở đỉnh thân, kép chân vịt, gốc cuống không có gai hay có phần phụ dạng gai. Lá chét 3-7 hình trứng ngƣợc, trứng ngƣợc-thuôn, cỡ 3,5-13 x 1,5-7 cm, dạng màng, hai mặt có lông thƣa trên gân, gốc xiên, mép có răng nhỏ, đỉnh nhọn. Chƣa thấy đƣợc hoa (Hình 3.1, Hình 3.2). Theo tài liệu nghiên cứu, loài này có hoa màu lục vàng nhạt với 5 lá đài, cánh hoa 5, nhị 5 và bầu dƣới, 2 ô. Quả mọng hình cầu dẹt, khi chín có mầu đỏ, hạt hình cầu mầu trắng [34]. 26 Hình 3.1. Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen ex C.H. Chow - Tam thất (lá mẫu TH1). Ảnh: Vũ Đình Duy 27 Hình 3.2. Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen ex C.H. Chow - Tam thất (củ mẫu TH1). Ảnh: Vũ Đình Duy 28 Loc. class.: China: Yunnan: mountains near Mengzi, forests, 5000 ft. Typus: A. Henry 11407 (K). Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 7-8, mùa quả tháng 9-10. Cây mọc trong rừng ở độ cao 1200-1800m. Phân bố: Việt Nam. Còn có ở Trung Quốc. Mẫu nghiên cứu: TH1 Địa điểm thu mẫu: Vƣờn ƣơm Công ty TNHH TH true MILK, Na Ngoi, Kỳ Sơn, Nghệ An. Nơi lưu trữ mẫu: Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Giá trị sử dụng: Cây làm thuốc. Đặc điểm sinh học phân tử: Mẫu Panax TH1 có trình tự vùng gen ITS-rDNA dài 588bp và tƣơng đồng với P. notoginseng U41685 (Phụ lục 1). Kết hợp giữa kết quả nghiên cứu hình thái và sinh học phân tử, đề tài có thể khẳng định mẫu TH1 thuộc loài P. notoginseng Seem. 3.1.3. Panax stipuleanatus Tsai et Feng- Tam thất hoang Tsai & Feng, 1975. Acta Phytotax. Sin. 13(2): 44, pl. 7, f. 4, 6; N. T. Bân, 2003. Checkl. Pl. Spec. Vietn. 2: 1076; Xiang Q. et al. 2007. Fl. China, 13: 490 Cây thân thảo, sống nhiều năm, cao khoảng 50-70 cm, với thân rễ mập giống nhƣ rễ tre, dài khoảng 7-12 cm, đƣờng kính 1-2,8 cm (Hình 3.3B, Hình 3.3). Thân khí sinh, mọc thẳng, nhẵn, đặc, cao 35-56, đƣờng kính 0,3-0,5 cm. Lá mọc vòng ở đỉnh thân, xòe ra. Lá kép chân vịt, có 5 (-7) lá chét, dạng màng, gân mặt trên lá có lông dạng móc; đôi lá chét dƣới cùng thƣờng nhỏ nhất, hình thuôn rộng với cuống nhỏ dài khoảng 0,5-0,8 cm, gốc gần tròn, chóp tròn, mép có răng cƣa hoặc nguyên. Chƣa thấy đƣợc hoa, quả và hạt nên việc xác định tên các mẫu Sâm Panax thu ở khu vực Phu Xai Lai Leng là P. stipuleanatus Tsai & Feng chƣa đủ tin cậy (Hình 3.3). Theo tài liệu nghiên 29 cứu, loài này có hoa màu vàng xanh. Cụm hoa tán mọc đơn độc ở đỉnh thân giữa các lá, dài khoảng 12-16 cm với 5 lá đài nhỏ, cánh hoa 5, nhị 5 và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹt, đƣờng kính 0,6-1,2 cm, khi chín có màu đỏ. Hạt 1 hoặc 2, màu xám trắng [38]. Ghi chú: Trong số các mẫu vật nghiên cứu thu đƣợc ở khu vực Phu Xai Lai Leng có hai dạng khác nhau về lá: dạng có lá chét nguyên Hình 3.1C, Hình 3.1) và dạng có lá chét xẻ (Hình 3.3C, Hình 3.3). Hình 3.3. Mẫu Panax thu ở khu vực Phu Xai Lai Leng. A. Cây đủ rễ và lá; B. Rễ củ; C. Lá; D. Hạt phấn; E. Cuống hoa; G. Hoa. Ảnh: Phạm Văn Thế. Loc. class.: China: Yunnan: Maguan, forests in valleys, 1100-1700 m, 7 Dec. 1947. Typus: K. M. Feng 1364 (KUN) 30 Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 4-5, quả tháng 5-9 (10). Nhân giống tự nhiên chủ yếu bằng hạt. Quả chín thƣờng bị chim ăn, hạt rơi xuống đất lại bị loại sóc nhỏ ăn nhân hạt. Cá biệt trong tự nhiên, quả chín tồn tại đến tháng 9 hoặc tháng 10. Cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt, quả chín rụng ngay xuống đất, xung quanh gốc cây mẹ, nếu không bị tác động, hạt sẽ nảy mầm vào tháng 3 năm sau [33]. Phần thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu thân rễ, vào đầu mùa xuân năm sau. Khi thân rễ bị gãy, phần đầu mầm còn lại có khả năng tiếp tục tái sinh. Cây đặc biệt ƣa ẩm và ƣa bóng, mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dƣới tán 10 rừng kín thƣờng xanh ẩm, hoặc rừng có xen lẫn với sặt gai, ở độ cao từ 1600- 2300m [47]. Phân bố: Ở nƣớc ta, Tam thất hoang phân bố ở ở Lào Cai, Tây Nghệ An và Hà Giang. Trên thế giới Tam thất hoang đƣợc tìm thấy ở tỉnh Vân Nam - Trung Quốc. Mẫu nghiên cứu: TB1-TB4 và ML1 ở Tây Nghệ An. Địa điểm thu mẫu: Khu vực Phu Xai