Luận văn Nghiên cứu đặc điểm nhiễm giun lươn (strongyloides) ở các đối tượng khám và điều trị tại viện sốt rét - Kí sinh trùng – côn trùng trung ương năm 2017 - 2018

nh nh n nhiễm giun lư n kh m v iều trị tại Khoa Kh m ệnh chuy n ng nh Viện S t rét - Ký sinh trùng - C n trùng Trung ư ng. Tiêu chí tuyển chọn bệnh nhân: - Tuổi: từ 5 ến 80 tuổi. - ược chẩn o n x c ịnh nhiễm giun lư n theo hướng dẫn chẩn o n của Viện S t rét - Ký sinh trùng - C n trùng Trung ư ng (xét nghiệm ph n t m thấy ấu trùng giun lư n hoặc có dấu hiệu l m s ng của bệnh giun lư n v ELISA dư ng t nh). - Bệnh nh n ồng ý tham gia nghi n cứu v tu n thủ iều trị ầy ủ. Tiêu chuẩn loại trừ: - Nh h n 5 tuổi (c n nặng dưới 15 kg), hoặc lớn h n 80 tuổi. - Phụ nữ có thai hoặc cho con . 2.1.3. Nguyên liệu nghiên cứu - Mẫu ph n mẫu huyết thanh của bệnh nh n. 2.1.4. Đị điểm và thời gi n nghiên cứu - ịa iểm nghi n cứu: Nghi n cứu ược thực hiện tại Viện S t rét - Ký sinh trùng - C n trùng Trung ư ng v Viện Sinh th i v t i nguy n sinh vật. - Thời gian nghi n cứu: từ năm 2017 - 2018. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU + ặc iểm h nh th i c c giai oạn ph t triển của giun lư n. + ịnh danh ấu trùng giun lư n ằng kỹ thuật ph n tử. + ặc iểm nhiễm giun lư n ở c c i tượng nghi n cứu theo tuổi, giới t nh ịa phư ng. + ặc iểm l m s ng v cận l m s ng của bệnh nh n nhiễm giun lư n. + Thay ổi l m s ng v cận l m s ng của bệnh nh n nhiễm giun lư n sau iều trị. 21 2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 3 1 Cỡ mẫu nghiên cứu - Mẫu nghi n cứu h nh th i, sinh học v ph n tử giun lư n: Ấu trùng giun lư n thu từ 2 mẫu ph n của bệnh nh n bị nhiễm giun lư n với cường ộ cao ược nu i cấy ể nghi n cứu h nh th i, sinh học v ịnh danh bằng kỹ thuật ph n tử. - C mẫu nghi n cứu ặc iểm nhiễm bệnh giun lư n: 89 bệnh nh n kh m v iều trị tại Viện S t rét Ký sinh trùng v c n trùng trung ư ng ược chẩn o n ị nhiễm giun lư n p ứng c c ti u ch lựa chọn. 2.3.2 Các kỹ thuật áp dụng 2.3.2.1. Thu thập thông tin về triệu chứng lâm s ng - Thu thập th ng tin của ệnh nh n từ bệnh n lưu trữ tại khoa kh m bệnh chuy n ng nh Viện S t rét - Ký sinh trùng - C n trùng Trung ư ng gồm: Tuổi, giới t nh ịa n cư tr l do ến kh m... Kh m l m s ng: C n nặng, chỉ s sinh tồn, triệu chứng c năng thực thể trước iều trị. 2.3.2.2. Lẫy mẫu phân v mẫu huyết thanh + Mẫu m u: - Huyết tư ng: Lấy 2 ml m u ở tĩnh mạch v o tuýp có chất ch ng ng EDTA ể xét nghiệm huyết học. - Huyết thanh: Lấy 2 ml m u v o tuýp kh ng có chất ch ng ng ể chắt huyết thanh l m xét nghiệm ELISA xét nghiệm sinh hóa. + Mẫu phân: Lấy 1 lượng ph n ằng ngón ch n c i v o lọ ựng mẫu. 2.3.2.3. Xét nghiệm huyết học - Ph n t ch tr n m y Celatac F (24 th ng s ): Trong nghi n cứu n y ch ng t i ph n t ch: s lượng hồng cầu (SLHC), Hemoglobin (Hb), S lượng bạch cầu (SLBC) v BCAT trước v sau iều trị. 2.3.2.4. Xét nghiệm sinh hóa - Xét nghiệm sinh hóa m u với c c chỉ s AST, ALT creatinine ure v o c c thời iểm trước iều trị v sau iều trị 1 tuần. - Ph n t ch tr n m y AU680, sử dụng hóa chất của Berkman coulter. 22 2.3.2.5. Xét nghiệm phân tìm ấu trùng giun lươn - Xét nghiệm ph n t m ấu trùng giun lư n ằng phư ng ph p soi trực tiếp với dung dịch nước mu i sinh lý v dung dịch lugol. + Dụng cụ: K nh hiển vi lam k nh 75 x 25 mm lamen 22x 22 mm, que tre, lọ nhựa hoặc thủy tinh y ằng có nắp t dạ k nh pipet nh giọt. + Hóa chất: Lọ dung dịch nước mu i sinh lý lọ dung dịch lugol. - Tiến h nh th nghiệm: 1. Dùng t viết k nh nh dấu m s bệnh nh n l n góc phiến k nh. 2. Nh 1 giọt nước mu i sinh lý v o giữa n tr i phiến k nh v 1 giọt lugol v o giữa phải phiến k nh. Sao cho lượng 2 giọt vừa ủ, khoảng c ch giữa 2 giọt vừa phải. 3. Dùng que tre lấy ph n một mẩu nh bằng hạt ỗ xanh ặt v o giọt nước mu i sinh lý trước trộn ều cho tan ph n; sau ó lấy phần tư ng tự ặt v o giọt lugol v nh ều. nh ều ph n v o dung dịch ể tạo th nh một dịch treo. 4. ậy lamen l n mỗi giọt mẫu ặt nghi ng một cạnh lamen xu ng lam k nh rồi từ từ hạ lamen sao cho dung dịch tr n ều khắp lamen, kh ng ị tr n ra xung quanh kh ng có ọt. 5. Soi dưới k nh hiển vi ở vật k nh 10x. 6. Ghi kết quả v o phiếu xét nghiệm trường hợp kh ng ph t hiện ấu trùng th ghi kết quả l kh ng thấy. Ghi chú: Mỗi mẫu ph n l m 2 ti u ản v o c c thời iểm trước iều trị v sau iều trị 1 tuần. 2.3.2.6. Kỹ thuật xét nghiệm ELISA tìm kh ng thể kh ng giun lươn - Trong nghi n cứu n y ch ng t i sử dụng bộ KIT ELISA của h ng SCIMEDX- Mỹ, với ộ nhạy v ộ ặc hiệu th ng o của nh sản xuất l 100%. Ngu ên tắc hoạt đ ng của b kit: Bộ kit hoạt ộng theo nguy n tắc phản ứng ELISA gi n tiếp ph t hiện kh ng thể: kh ng nguy n Strongyloides gắn sẵn trong c c giếng nhựa 23 polystyren kết hợp với kh ng thể ặc hiệu có trong huyết thanh người sau ó kh ng thể kết hợp với kh ng kh ng thể IgG người gắn men peroxidase. Phức hợp n y ược ph t hiện bằng c ch cho th m c chất. Men peroxidase ph n giải H202 tạo oxy nguy n tử sẽ oxi hóa c chất l m thay ổi m u phản ứng. + Dụng cụ: - Bộ Micropipet: 5 c i (0 - 5 l ; 2 - 20 l ; 20 - 200 l ; 200 - 1000 l ; Micropipet 8 ầu : 20 - 200 l) - Tủ ấm, tủ sấy m y ly t m. - ầu Eppendorf, tube lấy m u gi ựng ng nghiệm ng nghiệm kim lấy m u ng c c ong.... - o mật ộ quang (OD –Optical Density), ằng m y ELISA Elx 808 ở ước sóng 450 nm. + óa chất H nh 2 2: Bộ Kit Strongyloides ELISA Bảng 2.1 Thành phần bộ kit TT Nội dung (mô tả) Ký hiệu lọ 1 Bản nhựa Microwells, 96 giếng, với 12 thanh, mỗi thanh 8 giếng gắn sẵn kh ng nguy n MPS 12 x 8 24 TT Nội dung (mô tả) Ký hiệu lọ Strongyloides. 2 1 lọ dung dịch chứa kh ng thể 2 gắn Enzym peroxidase (conjugate) CONJ 3 1 lọ chứa 1 ml dung dịch pha lo ng huyết thanh dư ng t nh chuẩn. CONTROL(+) 4 1 lọ chứa 1ml huyết thanh m t nh chuẩn. CONTROL (-) 5 1 lọ chứa 11 ml c chất Tetramethylbenzidine (TMB). SUB 6 1 lọ chứa 25 ml dung dịch ệm pha lo ng với nước cất 20 lần trước khi dùng. WASHB 7 2 lọ chứa 30 ml dung dịch ệm DIL 8 1 lọ dung dịch chứa 11 ml aicd phosphoric 0,37 M ể dừng phản ứng STOP C c bước thực hiện ELISA: - Chuẩn ị: dung dịch rửa: 475 ml nước cất + 25 ml wash uffer pha lo ng huyết thanh ệnh nh n (pha lo ng 1/64): 5µl huyết thanh + 315 µl dung dịch ệm. Chứng m chứng dư ng kh ng cần pha lo ng. - C c ước tiến h nh: + Bẻ s giếng cần dùng (s ệnh nh n chứng m v chứng dư ng) nh s . + Cho lần lượt v o mỗi giếng 100 µl chứng m chứng dư ng v huyết thanh ệnh nh n ược pha lo ng như tr n. + Ủ ở nhiệt ộ ph ng trong v ng 10 ph t. + Rửa 03 lần với dung dịch rửa chuẩn ị mỗi lần 360 µl dung dịch 25 rửa/giếng. + Nh v o mỗi giếng 02 giọt (100 µl) Conjugate ủ ở nhiệt ộ ph ng 05 ph t. + Rửa 03 lần ằng dung dịch rửa chuẩn ị như ở tr n. + Nh v o mỗi giếng 02 giọt (100 µl) c chất TMB ủ ở nhiệt ộ ph ng 05 ph t. + Nh v o mỗi giếng 02 giọt (100 µl) dừng phản ứng. - ọc kết quả mật ộ quang ằng m y ELISA Elx 808 ở ước sóng 450 nm. Ghi trị s OD của từng giếng. C ch nh gi kết quả như sau: Nếu OD > 0 2: Dư ng t nh. Nếu OD ≤ 0 2: Âm t nh. 2.3.2.7. Định loại hình th i v phân tử c c giai đoạn ph t triển của giun lươn - Thu thập v nu i ấu trùng giun lư n: Ấu trùng giun lư n thu từ mẫu ph n của 02 bệnh nh n có s lượng ấu trùng nhiều ến từ H Nội v S n La, bằng kỹ thuật lọc qua giấy Harada- Mori theo quy tr nh như sau: Dùng th a gỗ phiết khoảng 5-6 g ph n l n tr n giấy thấm Harada-Mori cuộn tr n lại v ặt trong hộp nhựa chứa một lượng nước nh dưới y ủ ở 30°C. Ấu trùng sẽ di chuyển xu ng phần nước dưới y hộp nhựa [82]. Sau 12, 24, 48, 72h chuyển phần nước dưới y sang ĩa petri kiểm tra dưới k nh hiển vi ể thu ấu trùng. X c ịnh v m tả c c giai oạn ph t triển. o k ch thước c c giai oạn ph t triển v ịnh loại ấu trùng theo khóa ịnh loại v m tả của Miyazaki (1991)[83]. Định loại phân tử kỹ thuật PCR. Chọn gen ch: Vùng iến ổi (Hyper-Variable Region, HVR I) thuộc gen 18S của mẫu giun lư n ược sử dụng ể ịnh danh ấu trùng giun lư n. Quy tr nh thực hiện: 1. T ch chiết DNA tổng s bằng DNeasy Tissue Kit (QIAgen) theo quy tr nh của nh sản xuất như sau: 26 + Cho mẫu cần t ch chiết v o ng eppendorf 1,5ml, + Bổ sung 180µl dung dịch ệm ATL v 20 µl Proteinase K. + Ủ hỗn dịch ở 550C/3h cho ến khi mẫu tan ho n to n. + Bổ sung th m 200µl ệm AL rồi trộn ều. + Ủ hỗn dịch ở 700C trong 10 ph t rồi trộn ều. + Th m 200µl ethanol 100% v chuyển to n ộ hỗn dịch v o cột spin. + Ly t m t c ộ 8000 v ng/ph t trong 1 ph t chuyển cột spin sang ng eppendoff mới. + Th m 500µl ệm AW1 ly t m 8000 v ng/ph t trong 1 ph t dịch qua cột. + Th m tiếp 500µl ệm AW2 rồi ly t m 13000 v ng/ph t trong 3 ph t. + ặt cột spin v o ng eppendorf 1,5ml rồi bổ sung th m 200 µl dung dịch ệm AE ể y n tại nhiệt ộ ph ng trong 1 ph t sau ó ly t m 8000 v ng/ph t trong 1 ph t. Nh n ản tr nh tự ch ằng kỹ thuật PCR ti u chuẩn, sử dụng cặp mồi SSU18A 5'-AAAGATTAAGCCATGCATG-3' v SSU26R 5'- CATTCTTGGCAAATGCTTTCG-3' [84] với th nh phần phản ứng v iều kiện như sau: Bảng 2.2.Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR TT Thành phần Thể tích (µl) 1 PCR buffer 10X 2,5 2 dNTP 10mM 0,5 3 MgSO4 50mM 1 4 Primer mix (10pmol/µl) 1 5 Platinum Taq DNA polymerase 0,2 6 Nước cất khử ion 18,8 7 DNA khu n mẫu 1 Tổng thể t ch 25 27 - Chu tr nh nhiệt của phản ứng PCR như sau: iến t nh ở 950C/1 ph t tiếp theo l 35 chu kỳ - 950C/30 gi y 500C/1 ph t 720C/1 ph t v kết th c 72 0C/5 ph t. - iện di kiểm tra kết quả PCR tr n gel agarose 1% nhuộm ethidium romide v soi èn UV. C ch tiến h nh như sau: + Chuẩn bị gel agarose 1%: C n 0 5 gram agarose cho v o c c ong chịu nhiệt rồi cho 50 ml dung dịch ệm TBE 1X v o c c. Cho v o l vi sóng un ến khi agarose tan chảy hết. Bổ sung 5µl ethidium romide (10mg/ml) v o, rồi ổ thạch tan chảy v o hệ th ng iện di g i lược có răng tạo giếng ến ngập răng lược khoảng 0,5 cm, ể nguội ở nhiệt ộ ph ng. Khi thạch nguội chuyển miếng thạch v o hộp iện di chứa ệm TAE 1X, bổ sung ệm sao cho dung dịch ệm ngập bản gel. + Tra mẫu: lấy 5µl sản phẩm trộn với 2µl loading uffer tra v o từng giếng tr n gel. + Tra chỉ thị ph n tử (DNA marker): tra 5µl chỉ thị ph n tử v o giếng chứa thang chuẩn. + Chạy iện di ở 100-120V trong 20-30 ph t. + Rửa sạch bằng nước cất, soi qua tia cực t m. - Tinh khiết sản phẩm PCR bằng bộ hóa chất QIAquick PCR purification kit (QIAGEN Inc. Mỹ) theo quy tr nh như sau: + Th m 200µl PB v o 40µl sản phẩm rồi trộn ều. + Chuyển cột ly t m 13000 v ng/ph t trong 1 ph t dịch qua cột. + Th m 750µl PE ly t m 13000 v ng/ph t trong 1 ph t dịch qua cột. + Ly t m tiếp 13000 v ng/1 ph t trong 1 ph t dịch qua cột. + Chuyển cột sang ng eppendorf mới th m 30µl dung dịch EB ly t m 13000 v ng/ph t trong 1 ph t. Sản phẩm PCR tinh sạch thu nhận v giữ ở - 20 0C cho ến khi sử dụng. Sản phẩm PCR ược gửi ọc tr nh tự tại c ng ty Macrogen (H n Qu c) bằng kỹ thuật giải tr nh tự trực tiếp sản phẩm PCR bằng m y tự ộng ABI 28 Prism 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystem), sử dụng BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem). - Sử dụng chư ng tr nh phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), version 7 ể xử lý ph n t ch ộ s liệu tr nh tự gen v x y dựng c y ph t sinh chủng loại. 2.4. IỀU TRỊ CHO BỆNH NHÂN Bệnh nh n sau khi ược chẩn o n nhiễm giun lư n, v o viện ược iều trị bằng Ivermectin theo ph c ồ NIMPE 08/PP 11. Ivermectin: Vi n nén 3mg v 6 mg. (biệt dược: Pizar, Stromectol, Mectizan, Ivomec). Liều dùng: Ivermectin 0,2 mg/kg thể trọng, liều duy nhất, u ng v o uổi s ng trước khi ăn. Bệnh nh n u ng dưới sự theo dõi gi m s t của c n ộ y tế nếu ị n n trong v ng 30 ph t th ệnh nh n ược u ng nhắc lại. iều trị thu c kết hợp với iều trị triệu chứng. 2.5. CÁC BIẾN SỐ VÀ CHỈ SỐ NGHIÊN CỨU: 2.5.1. Đặc điểm h nh thái và phân tử - K ch thước h nh th i của ấu trùng c c giai oạn ấu trùng L1, L2, L3 ở ngo i m i trường. - K ch thước v h nh th i của con ực trưởng th nh s ng tự do ở ngo i m i trường. - Tr nh tự oạn HVRI của gen 18S. 2.5.2. Đặc điểm nhiễm bệnh giun lƣơn C c chỉ s nghi n cứu gồm - Tuổi, giới t nh nghề nghiệp v n i cư tr của bệnh nh n. - ặc iểm l m s ng ệnh nh n nhiễm giun lư n: au bụng ti u chảy kéo d i ngứa, mề ay suy kiệt, tiền sử tiếp x c ất c t theo dõi mạch, nhiệt ộ, huyết p. 29 - ặc iểm cận l m s ng: + Một s chỉ s huyết học: S lượng hồng cầu, lượng huyết sắc t (hemoglobin) s lượng bạch cầu, tỷ lệ BCAT. Bảng 2.3 Giá trị các chỉ số huyết học Chỉ số Đơn vị B nh thƣờng Thấp Cao Hb g/L 120 – 170 < 120 >120 SLHC S lượng x 1012/L 3,9 – 5,8 < 3,9  5,8 SLBC S lượng x 109/L 4,0 – 10,0 < 4,0  10,0 BCAT % 0 – 4 0 > 4 + Một s chỉ s sinh hóa: SGPT SGPT, Creatinin, Ure Bảng 2 5 Chỉ số hó sinh máu Chỉ số Đơn vị B nh thƣờng Cao AST U/L ≤ 37  47 ALT U/L ≤ 40  50 Creatinin µmol/L 53 - 120  135 Ure mmol/L 2,5 – 7,5  15 - Xét nghiệm ph n t m thấy ấu trùng giun lư n. - Xét nghiệm ELISA (kit h ng Scimedx) Nếu OD > 0 2: Dư ng t nh. Nếu OD ≤ 0 2: Âm t nh. 2.6. XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 2.6.1. Nhập số liệu - Nhập s liệu bằng phần mềm Epi Data 3.1. 30 2.6 2 Phân tích số liệu - STATA: ph n t ch s liệu tr n phần mềm STATA 14.0. - Sử dụng th ng k m tả: ph n t ch ặc trưng c nh n v so s nh c c gi trị trước sau bằng test2 - Excel v Word: s liệu sau khi ph n t ch sẽ ược tr nh y dưới dạng bảng, biểu ồ ồ thị, bản ồ của phần mềm Excel v Word. 2.7. SAI SỐ VÀ BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC - Sai số: - Sai s trong qu tr nh iều tra, thiếu th ng tin ghi chép kết quả xét nghiệm v o phiếu trả kết quả. - Sai s trong qu tr nh thao t c kỹ thuật từ lấy mẫu xét nghiệm ến việc thực hiện quy tr nh xét nghiệm. - Sai s do người ọc kết quả xét nghiệm kh ng ch nh x c. - Sai s trong qu tr nh nhập s liệu. - Khắc phục: - Kiểm tra lại phiếu iều tra ngay sau khi iều tra. - C c quy tr nh lấy mẫu, bảo quản mẫu, kỹ thuật xét nghiệm, theo ti u chuẩn của h ng v Viện S t rét – Ký sinh trùng – C n trùng Trung ư ng. - Sử dụng c ng cụ m y móc cùng loại trong su t qu tr nh nghi n cứu. - Thực hiện kép nhập s liệu bởi hai người kh c nhau. 2.8. ẠO ỨC TRONG NGHIÊN CỨU - Có sự chấp thuận của i tượng nghi n cứu v bệnh nh n có quyền từ ch i tham gia nghi n cứu bất cứ l c n o m kh ng cần giải th ch lý do. - Chấp h nh nghi m chỉnh c c quy ịnh về ạo ức trong nghi n cứu y sinh học. - C c ệnh nh n nhiễm giun lư n ược iều trị v theo dõi ph c ồ NIMPE88/PP11 của Viện s t rét – KST – CT TƯ năm 2017. 31 CHƢƠNG 3 KẾT QU VÀ TH O LUẬN 3.1. ẶC IỂM HÌNH THÁI CÁC GIAI OẠN PHÁT TRIỂN CỦA GIUN LƯƠN NGOÀI MÔI TRƯỜNG Ấu trùng giai đoạn đầu L1 Sau nu i cấy 12h, ấu trùng L1 (h nh 3.1) có dạng rha ditiform c thể nh h nh kim rộng h n về ph a trước v có u i h nh nón. C thể có k ch thước 240-260 x 14-16 µm (trung nh 243 6 x 14 7). Miệng mở ra bằng nang h nh c c n ng. Thực quản rõ chiếm 1/3 ph a trước c thể. Thực quản chia l m 3 phần: phần ầu h nh ng, phần giữa hẹp h n phần cu i h nh củ h nh. K ch thước 3 phần tư ng ứng l 32-42 x 8 µm; 16-20 x 4 µm v 12-16 x 8-10 µm. Ruột kéo d i ến phần cu i c thể. V ng thần kinh c ch m t ầu 50-60 µm. Lỗ hậu m n c ch u i 56-60 µm. a b H nh 3.1. Ấu trùng giai oạn L1 a. H nh dạng chung, b. Phần ầu nh n rõ thực quản 32 Ấu trùng giai đoạn 2 L2 Sau nu i cấy 24h, ấu trùng L2 (h nh 2) dạng rhabditiform, có cấu tr c tư ng tự nhưng lớn h n về k ch thước so với ấu trùng giai oạn L1. C thể có k ch thước 40-440 x 20-24 µm (trung nh 414 7 x 23,2). Miệng mở ra bằng nang h nh c c n ng. Thực quản rõ chiếm 1/3 ph a trước c thể. Thực quản chia l m 3 phần: phần ầu h nh ng, phần giữa hẹp h n phần cu i h nh củ h nh. K ch thước 3 phần tư ng ứng l 46-50 x 10-12 µm; 26-30 x 6 µm v 18-20 x 12-14 µm. Ruột kéo d i ến phần cu i c thể. V ng thần kinh c ch m t ầu 65-76 µm. Lỗ hậu m n c ch u i 78-80 µm. a b H nh 3.2. Ấu trùng giai oạn L2 a. H nh dạng chung, b. Phần ầu nh n rõ thực quản 33 Ấu trùng cảm nhiễm giai đoạn ba Sau 3 ng y ấu trùng L3 (h nh 3) dạng filariform d i v mảnh, với biểu mịn. K ch thước c thể 690-720 x 21-24 µm (trung nh 710 0 x 23 6). Thực quản h nh trụ kéo d i 280-340 µm chiếm khoảng 40% chiều d i ấu trùng kh ng có phần h nh ph a sau v n i với ruột thẳng d i. V ng thần kinh c ch m t ầu c thể 80-100 µm (trung nh 86 7 µm) ao quanh ở khoảng ¼ chiều d i thực quản. Bộ phận sinh dục nằm ở khoảng giữa của ruột k ch thước 28-32 µm (trung nh 30 7 µm). Hậu m n c ch m t u i 60-80 µm. a b c H nh 3.3. Ấu trùng giai oạn L3 a. H nh dạng chung, b. Phần ầu với thực quản d i c. Phần u i 34 Giun đực trưởng th nh sống tự do Con ực (h nh 4) có h nh chữ J u i nhọn, u n cong về ph a trước. K ch thước c thể 720-800 x 38-50 µm (trung nh 769 3 x 43 3). Thực quản chia 3 phần: phần ầu h nh ng oạn giữa hẹp h n v cu i ph nh củ h nh. K ch thước 3 phần tư ng ứng l 76-80 x 18-20 µm; 36-40 x 10-12 µm v 30- 36 x 20-24 µm. Ruột kéo d i ến phần cu i c thể. V ng thần kinh c ch m t ầu 104-120 µm. Lỗ hậu m n c ch u i 50-56 µm. Hai gai sinh dục d i 34-36 µm. a b c H nh 3.4. Con ực s ng tự do a. H nh dạng chung, b. Phần ầu với thực quản rõ, c. Phần u i với gai sinh dục 35 Bảng 3 1: Kích thƣớc các gi i đo n phát triển củ giun lƣơn K ch thước (µm) Ấu trùng L1 Ấu trùng L2 Ấu trùng L3 Con ực C thể 240-260 x 14-16 (243,6 x 14,7) 400-440 x 20-24 (414,7 x 23,2) 690-720 x 21-24 (710,0 x 23,6) 720-800 x 38-50 (769,3 x 43,3) Thực quản 280-340 (304,7) Phần 1 32-42 x 8 (35,9 x 8) 46-50 x 10-12 (47,6 x 10,8) 76-80 x 18-20 (77,9 x 18,9) Phần 2 16-20 x 4 (17,3 x 4) 26-30 x 6 (27,6 x 6) 36-40 x 10-12 (37,9 x 10,9) Phần 3 12-16 x 8-10 (13,9 x 8,9) 18-20 x 12-14 (18,8 x 12,8) 30-36 x 20-24 (32,8 x 21,9) V ng thần kinh c ch ầu 50-60 (53,6) 65-76 (70,6) 80-100 (86,7) 104-120 (115,7) Hậu m n c ch u i 50-60 (57,9) 78-80 (78,8) 60-80 (73,3) 50-60 (52,8) Tuyến sinh dục 28-32 (30,7) Gai sinh dục 34-36 (34,9) 36 H nh 3.5. H nh vẽ các gi i đo n phát triển củ giun lƣơn a. Ấu trùng L1; . Phần ầu L1; c. Ấu trùng L2; d. Phần ầu L2; e. Ấu trùng L3; f. Phần ầu L3; g. Phần u i L3; h. Con ực; i. Phần ầu con ực; k. Phần u i con ực 37 Sự ph t triển v k ch thước c c giai oạn ph t triển của mẫu giun nghi n cứu phù hợp với ặc iểm của giun [83]. C c ặc iểm ph n iệt rõ r ng với giun móc l : xoang miệng ngắn, tuyến sinh dục của ấu trùng lớn v ph t triển th nh giai oạn hữu t nh s ng tự do. Tuy nhi n trong nghi n cứu n y ch ng t i kh ng quan s t thấy con c i s ng tự do. Vấn ề n y có thể ược giải th ch l do sự ph t triển th nh con c i v ấu trùng cảm nhiễm của giun lư n phụ thuộc v o yếu t m i trường ặc biệt l nhiệt ộ [85]. Trứng sẽ ph t triển th nh con c i s ng tự do có thể thay ổi ph t triển th nh ấu trùng cảm nhiễm [86],[87],[88]. Nghi n cứu của Ahizono (1976), thấy rằng trứng của S. planiceps ph t triển th nh nhiều con c i s ng tự do h n so với ấu trùng cảm nhiễm trong m i trường nu i cấy mật ộ thấp v ủ nguồn cung cấp dinh dư ng. Ngược lại trong iều kiện bất lợi con c i trở n n t về s lượng v nhiều ấu trùng cảm nhiễm ược h nh th nh. Sự ph t triển của S. stercoralis cũng tư ng tự [85]. Ảnh hưởng của nhiệt ộ ến sự ph t triển của giun lư n rất rõ rệt. Nhiệt ộ t i ưu ể ph t triển th nh con c i s ng tự do của lo i S. stercoralis l 20- 30°C S. planiceps l 28-36°C v S. papillosus l 35°C; trong khi nhiệt ộ t i ưu ể ph t triển ấu trùng cảm nhiễm từ 35-40°C ở S. stercoralis, 12-16°C ở S. planiceps v 20°C ở S. papillosus. Nguy n nh n về sự kh c iệt giữa 3 lo i Strongyloides chưa ược biết. Tuy nhi n dường như nhiệt ộ 20-30°C tư ng ứng với nhiệt ộ trung nh ở vùng nhiệt ới v cận nhiệt ới, rất phù hợp ể tạo ra nhiều thế hệ của S. stercoralis bởi sự ph t triển gi n tiếp của thế hệ s ng tự do. Những con ực s ng tự do ược x c ịnh c ịnh ở giai oạn trứng tr i lại trứng nở th nh ấu trùng rha ditiform biệt hóa th nh con c i s ng tự do hoặc th nh ấu trùng cảm nhiễm filariaform tùy thuộc v o c c yếu t m i trường [88],[89]. Premvati (1958), cho rằng sự ph t triển th nh con c i s ng tự do hoặc ấu trùng cảm nhiễm filariform ược quyết ịnh ở giai oạn ấu trùng rha ditiform L1 trước khi lột x c lần ầu ti n [86]. Trong nghi n cứu n y ch ng t i nu i cấy ấu trùng thu từ 2 bệnh nh n ều v o mùa hè nhiệt ộ trong ph ng th nghiệm tr n 35°C n n phù hợp ể ph t triển th nh con ực v ấu trùng cảm nhiễm L3 v vậy kh ng thu ược con c i s ng tự do. ể m tả ầy ủ c c giai oạn ph t triển của giun lư n ở 38 Việt Nam, cần tiếp tục nghi n cứu ở c c iều kiện nhiệt ộ v m i trường kh c nhau. 3.2. ỊNH DANH ẤU TRÙNG GIUN LƯƠN DỰA TRÊN DỮ LIỆU PHÂN TỬ Tr nh tự vùng iến ổi HVR-I gen 18S của mẫu ấu trùng giun lư n thu từ 2 bệnh nh n có ộ d i 823 p ho n to n tư ng ồng (100%) với nhau v tư ng ồng với tr nh tự của lo i S. stercoralis từ Nhật Bản v Thụy Sĩ sai kh c 0 1-0,3% so với lo i n y của Myanmar v 2 tr nh tự kh ng rõ nguồn g c (AF279916 v AJ417023). Tr nh tự vùng HVR-I gen 18S của S. stercoralis kh c iệt c c lo i kh c cùng gi ng từ 1,1-3,3%, trừ khoảng c ch di truyền rất thấp (0,0-0,3%) so với lo i S. procyonis (bảng 3.2). C y ph t sinh lo i (h nh 3.2) cho thấy lo i S. stercoralis l m một nhóm ri ng iệt với gi trị ootrap 91% c c tr nh tự của Việt Nam cùng nh nh với tr nh tự của Nhật Bản v Thụy Sĩ. Tr nh tự lo i S. procyonis nằm cùng nh nh với S. stercoralis của Myanmar v 2 tr nh tự kh ng rõ nguồn g c (AF279916 v AJ417023). iều n y có thể giải th ch l lo i S. procyonis ký sinh ở gấu mèo (Procyon lotor) vùng Bắc Mỹ rất gi ng với lo i S. stercoralis cả về h nh th i v ph n tử hai lo i n y kh ng ph n iệt ược bởi gen 18S [90]. V thế, S. procyonis từng ược coi l một biến thể của lo i S. stercoralis. Tuy nhi n ph n t ch s u h n về h nh th i v ph n tử gần y cho rằng S. procyonis l lo i ộc lập v S. stercoralis ược cho l có nguồn g c tiến hóa từ lo i S. procyonis dựa tr n ph n t ch dữ liệu gen 28S v CO1 [91]. Tr nh tự gen của c c lo i giun lư n thuộc gi ng Strongyloides hiện có tr n GenBank chủ yếu từ Nhật Bản. V vậy, s liệu ph n tử của nhóm giun tr n n y từ c c qu c gia kh c tr n thế giới rất cần thiết cho nghi n cứu m i quan hệ tiến hóa ph n tử của c c lo i thuộc gi ng n y 41 Bảng 3 2 Khoảng cách di truyền giữ các loài trong giống Strongyloides dự trên tr nh tự HVR-I gen 18S. TT Tr nh tự c c lo i 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 S. stercoralis VNM1 2 S. stercoralis VNM2 0.000 3 AB453315 S. stercoralis JPN 0.000 0.000 4 AB453316 S. stercoralis JPN 0.000 0.000 0.000 5 AB453314 S. stercoralis JPN 0.000 0.000 0.000 0.000 6 MH932099 S. stercoralis CHE 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 7 MH932098 S. stercoralis CHE 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 8 MH932100 S. stercoralis CHE 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 9 AB923888 S. stercoralis MMR 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 10 AF279916 S. stercoralis 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.000 11 AJ417023 S. stercoralis 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.000 0.000 12 AB205054 S. procyois JPN 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.000 0.000 0.000 13 AB272234 S. procyois JPN 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.001 0.001 0.001 0.001 14 AB272236 S. cebus JPN 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.013 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 15 AB453313 S. myopotami JPN 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.018 0.017 0.017 0.017 0.017 0.015 0.013 16 AB923889 S. ratti JPN 0.020 0.020 0.020 0.020 0.020 0.020 0.020 0.020 0.018 0.018 0.018 0.018 0.020 0.015 0.015 17 AB272230 S. callosciureus JPN 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.021 0.021 0.021 0.021 0.021 0.013 0.017 0.017 18 AB272235 S. fuellebori JPN 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.021 0.021 0.021 0.021 0.021 0.015 0.023 0.023 0.014 19 AB272232 S. robustus USA 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.021 0.021 0.021 0.021 0.023 0.015 0.018 0.017 0.006 0.020 20 AB272233 S. robustus USA 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.021 0.021 0.021 0.021 0.023 0.015 0.018 0.017 0.006 0.020 0.000 21 AB272231 S. callosciureus MYS 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.023 0.023 0.023 0.023 0.024 0.017 0.017 0.015 0.007 0.021 0.004 0.004 22 AB272229 S. callosciureus JPN 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.023 0.023 0.023 0.023 0.024 0.017 0.017 0.015 0.007 0.021 0.004 0.004 0.000 23 LC324903 S. ransomi VNM 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.023 0.023 0.023 0.023 0.024 0.017 0.017 0.013 0.013 0.020 0.015 0.015 0.014 0.014 24 LC324902 S. ransomi VNM 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.023 0.023 0.023 0.023 0.024 0.017 0.017 0.013 0.013 0.020 0.015 0.015 0.014 0.014 0.000 25 AB821045 S. fuellebori GAB 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.024 0.023 0.023 0.023 0.023 0.023 0.017 0.024 0.024 0.015 0.001 0.021 0.0