Luận văn Nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ.ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang

h rễ của chồi Sâm Núi Dành. - Bố trí thí nghiệm: gồm 10 công thức sau: CT1: ĐC1 + 0,5 mg/l IBA CT6: ĐC2 + 0,5 mg/l IBA CT2: ĐC1 + 1 mg/l IBA CT7: ĐC2 + 1 mg/l IBA CT3: ĐC1+ 1,5 mg/l IBA CT8: ĐC2+ 1,5 mg/l IBA CT4: ĐC1+ 2 mg/l IBA CT9: ĐC2+ 2 mg/l IBA CT5: ĐC1+ 2,5 mg/l IBA CT10: ĐC2+ 2,5 mg/l IBA + Thí nghiệm 4.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến chất lượng rễ. Môi trường ra rễ tối ưu nhất từ kết quả của thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 được bổ sung thêm than hoạt tính với các nồng độ: 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 mg/l. Các thí nghiệm được theo dõi tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình trên mỗi mẫu, chiều dài trung bình của rễ và chỉ số ra rễ sau 90 ngày nuôi cấy. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm. Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh được đưa ra vườn trên các loại giá thể khác nhau. Cây in vitro hoàn chỉnh có 2-4 rễ, thân dài 10-15cm, có 3-4 nhánh thân được huấn luyện và trồng trong bầu tại vườn ươm - Bố trí thí nghiệm: gồm 4 công thức giá thể sau: - GT 1: Đất tầng B - GT 2: 50% đât tầng B + 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa - GT 3: 30% đất tầng B+ 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa - GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa Giá thể được xử lý thuốc chống nấm (Benkona) trước khi sử dụng cho thí nghiệm. Giá thể được đóng trong túi bầu có kích thước 10x10. Mật độ giâm 80 bầu/m2. 25 Bầu được đặt trong nhà lưới có che phủ bằng nylon và 1 lớp lưới đen. Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong tháng đầu tiên và 2 lần/ngày từ tháng thứ 2. Theo dõi tỷ lệ cây sống, cây chết, sinh trưởng và phát triển của cây. 2.3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn (Complete Randomized Design -CRD) với 20 bình, mỗi bình 4 mẫu, lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu theo dõi Số mẫu sạch bệnh  Tỷ lệ mẫu sạch bệnh = x 100% Tổng số mẫu Số mẫu nảy chồi  Tỷ lệ mẫu nảy chồi = x 100% Tổng số mẫu Số mẫu ra chồi (rễ)  Tỷ lệ ra chồi (rễ) = x 100% Tổng số mẫu (rễ)  Số lượng chồi trung bình, số rễ trung bình và chiều dài trung bình chồi trên mỗi mẫu được tính theo công thức: 1 n X = ∑ Xi n i-n Tổng số chồi (rễ)  Hệ số nhân chồi (rễ) = Tổng số mẫu  Chỉ số ra rễ = Số rễ TB/mẫu x Chiều dài rễ TB/mẫu Điều kiện môi trường và phòng nuôi cấy Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 25 phút. Điều kiện nuôi cấy in vitro: 14h sáng, cường độ ánh sáng 2000 - 2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C. 2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel 2013 và IRRISTAT 5.0. 26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM THU THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG. 3.1.1. Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang + Sâm Đắng ở chân núi Yên Tử, huyện Sơn Động - Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông nâu. Lá kép lông chim lẻ, 11-15 lá chét, lá chét dài thon nhọn, mặt phủ lông tơ màu nâu. Hoa màu nâu, có lông tơ màu nâu phủ bên ngoài. Quả đậu, có lông nâu phủ, có 2-3 hạt hình trứng. + Sâm Ngọt (người dân còn gọi là Sâm Nam) thu tại huyện Lạng Giang - Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông bạc. Lá kép lông chim lẻ, 7-11 lá chét, lá chét dài thon nhọn. Hoa màu trắng ngà, có phủ lông nhung trắng. Quả đậu, có phủ lông nâu, có 5-6 hạt hình trứng. + Sâm Núi Dành thu tại xã Việt Lập và xã Liên Chung huyện Tân Yên - Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông bạc. Lá kép lông chim lẻ, 3-7 lá chét, lá chét hình bầu dục, mặt phủ long tơ trắng. Hoa trắng ngà, có phủ lông nhung trắng. Quả đậu, có lông nâu phủ dầy, có 2-3 hạt hình trứng. a) b) Hình 3.1. a) Cây Sâm Núi Dành , b) Cây Sâm Đắng 27 Hình 3.2. Củ Sâm Núi Dành và củ Sâm Ngọt (Sâm Nam) Hình 3.3. Các dạng lá Sâm thu tại tỉnh Bắc Giang a) b) Hình 3.4. a) Quả Sâm Núi Dành b) Quả Sâm Đắng 28 3.1.2. Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành. Sử dụng 04 mẫu Sâm đã thu thập được làm nguồn vật liệu để tiến hành nghiên cứu cho thí nghiệm này, từ đó xác định được chính xác loài Sâm Núi Dành làm nguồn vật liệu chuẩn cho những nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.1. Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm STT Ký hiệu DNA Tên giống Sâm Nơi thu mẫu 1 S1 Sâm Núi Dành khu vực chân Núi Dành, xã Việt Lập, Tân Yên, Bắc Giang 2 S2 Sâm Núi Dành khu vực chân Núi Dành, xã Liên Chung, Tân Yên, Bắc Giang 3 S3 Sâm Đắng Thu thập tại địa bàn huyện Sơn Động 4 S4 Sâm Ngọt Thu thập tại địa bàn huyện Lạng Giang 3.1.2.1. Phân tích các sản phẩm khuếch đại Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi ITS1/ITS4 và được điện di trên gel agarose 1,5% cho băng đơn hình với kích thước khoảng 700 bp. Kết quả khuếch đại sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành thôi gel, sử dụng cột Sigma GenElute TM Agarose Spin column (USA), nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu. 3.1.2.2. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của các mẫu Sâm - Kích thước đoạn trình tự của các mẫu Sâm nghiên cứu Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 sau khi tinh sạch được phân tích trực tiếp trên máy giải trình tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biotech) của công ty Macrogen (Hàn Quốc) và phần mềm MEGA v5.1, kết quả cho ra giản đồ có các đỉnh (peak) với bốn màu sắc khác nhau tương ứng với bốn loại nucleotide và biểu thị dãy trình tự các nucleotide. Kết 29 quả đã thu được 04 đoạn trình tự ITS của 04 mẫu giống Sâm với số nucleotide khác nhau trên từng mẫu giống: Trình tự mẫu S1 (1-640) ATCCCGACCTGAACTGAGGTCTCGTCGTGAGCGTTCGAGGACGCCCGTGGG TCACGGAGGCCGGGTTCGGCAGGGGTCGCGCACGACTGGTCTCGAGCGTC ACTCAACCACCGTCTGTCGTGGCGCGCACCCCGCCGCGGACTCGATTTTCA GCCAACCGAGAGGCACCGGTGCTCACGGGAAGCCACCATCCACCCTGCAC AATTAGAGCACCTATCGCTAGGCAATTGGGCATCGGGCAACGGTCTGTGAC GCCCAGGCAAACGTGCCCTCAACCTAATGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTC AAAGACTCGATGGTTCCCGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCGCATTT CGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCTAGATATCTGTTGCCGAGAGTCA TTCTGTATAGCGTGTCAAGGCGCCGCCCGCCGGACCACCGTCTCCGGGCCG ACGGGGGCGCGCTGAACCAGTTTCAGTTCCTTGGGGCATTTGGCGCCCGGG TTTGTGTTTGGCTCGGCGGGGAACACACTGCGTGGCCCCCCTCCGAGCCCG AGGGAGAGGATGCGGCGCTGAGCACCGCAAGCCAACCCTACCGAGTGGTC AGACAGATTGCCGGTGACTGCTGGCCAGGGC Trình tự mẫu S2 (1-633) CTCCGATCTGAGTCTCGTCGTGAGCGTTCGAGCACGCCCGTGGGTCACG GAGGCCGGGTTCGGCAGGGGTCGCGCACGACTGGTCTCGAGCGTCACT CAACCACCGTCTGTCGTGGCGCGCACCCCGCCGCGGACTCGATTTTCAG CCAACCGAGAGGCACCGGTGCTCACGGGAAGCCACCATCCACCCTGCA CAATTAGAGCACCTATCGCTAGGCAATTGGGCATCGGGCAACGGTCTGT GACGCCCAGGCAAACGTGCCCTCAACCTAATGGCTTCGGGCGCAACTTG CGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTAT CGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCTAAATATCCGTTGCC GAAAGTCATTCCGTATCGCGTGTCAAGGCGCCGCCCGCCGGACCACCGT CTCCGGGCCAACGGGGGCGCGCTGAACCAGTTTCAGTTCCTTGGCGCAT TCGGCGCCCGGGTTCGTGTTTGGCTCGGCGGGAAACACACTGCGTGGCC CCCCTCCAAGCCCGAGGGAGAGGATGCGGCGCTGAGCACCGCAAGCCA ACCCTACCGAGTGGTCAAACAGATCGCCGGTGGACTGCTGCAGGCCG. Trình tự mẫu S3 (1-490) GGTGATCGAGCTTTCAGCAGTCCACCGGTCGATCTGTTTGACCACTCGG TAGGGTTGGCTTGCGGTGCTCAGCGCCGCATCCTCTCCCTCGGGCTCGG AGGGGGGCCACGCAGTGTGTTCCCCGCCGAGCCAAACACGAACCCGGG CGCCAAATGCGCCAAGGAACTGAAACTGGTTCAGCGCGCCCCCGTCGG 30 CCCGGAGACGGTGGTCCGGCGGGCGGCGCCTTGACACGCGATACGGAA TGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAG CGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGT CTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGTTGAGGGCACGTCTGCC TGGGCGTCACAGACCGTTGCCCGATGCCCAATTGCCTACGATAGGTGCT CTAATTGGCGGGGGATGGGGCTTCCCGGAAGCCGGGCCTCCGGTTGGTG AAA Trình tự mẫu S4 (1-544) GGTGATCGAGCTTTGCAGCAGTCCACCGGCGATCTGTTTGACCACTCGG TAGGGTTGGCTTGCGGTGCTCAGCGCCGCATCCTCTCCCTCGGGCTCGG AGGGGGGCCACGCAGTGTGTTCCCCGCCGAGCCAAACACGAACCCGGG CGCCGAATGCGCCAAGGAACTGAAACTGGTTCAGCGCGCCCCCGTCGG CCCGGAGACGGTGGTCCGGCGGGCGGCGCCTTGACACGCGATACAGAA TGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAG CGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGT CTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTTAGGTTGAGGGCACGTCTGC CTGGGCGTCACAGACCGTTGCCCGATGCCCAATTGCCTACGATAGGTGC TCTAATTGTGCAGGGTGGATGGTGGCTTCCCGTGAGCACCGGTGCCTCT CGGTTGGTGAAAATCAATCCGCGGCGGGGTGCCCCCACAAAAGGGGTT GATGACCTC. Kết quả phân tích vùng ITS cho thấy trình tự các nucleotide giữa 4 mẫu Sâm có sự khác biệt nhau. Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, các mẫu nghiên cứu có tỷ lệ Guanin và Cytosine cao hơn tỷ lệ Adenine và Thymine hay nói một cách khác là đều có thành phần GC cao hơn thành phần AT. Tỉ lệ thành phần GC trung bình của 4 mẫu Sâm nghiên cứu là 61,7% và tỉ lệ thành phần AT trung bình 38,3%. Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu Sâm nghiên cứu Mẫu giống Tỉ lệ (%) T(U) C A G GC AT S1 19,1 31,7 18,4 30,8 62,5 37,5 S2 19,7 28,9 19,2 32,2 61,2 38,8 S3 20,0 28,9 19,1 32,0 60,8 39,2 S4 18,5 32,9 19,1 29,5 62,4 37,6 Trung bình 19,4 30,6 18,9 31,1 61,7 38,3 31 * Kết quả so sánh các mẫu nghiên cứu trên Blast Theo kết quả Blast (Basic Local Alignmet Search Tool) trong NCBI (National Center for Biotechnology Information), sự tương đồng của trình tự các nucleotid vùng ITS ở mẫu S1 với các nghiên cứu khác trong cùng chi Callerya vào khoảng 88-99%, trong đó tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%, cao nhất trong chi Callerya (Bảng 3.3 – Phụ lục 2). Khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS của mẫu S2 với các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ 87-99%, trong đó tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%, cao nhất trong chi Callerya (Bảng 3.4 – Phụ lục 2). Mẫu S3, khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS với các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ 88-93%, tương đồng với loài Callerya speciosa là 88% (Bảng 3.5- Phụ lục 2). Mẫu S6, khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS với các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ 88-91%, tương đồng với loài Callerya speciosa là 88% (Bảng 3.6- Phụ lục 2). * Kết quả so sánh trình tự gen ITS giữa các mẫu Sâm nghiên cứu Kết quả so sánh sự sai khác giữa 04 mẫu sâm nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.7. Từ bảng kết quả cho thấy, mức tương đồng di truyền của 04 mẫu Sâm dao động trong khoảng 43,4% đến 98,7%. Hai mẫu (S1-S3) có mức sai khác di truyền lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền nhỏ nhất là 0.43). Hai mẫu Sâm S1 và S2 có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất trong 4 mẫu nghiên cứu (có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,975). Mẫu sâm S1 có hệ số tương đồng với mẫu S3 và S4 là 0,434 và 0,43 Bảng 3. 3. Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu S1 S2 S3 S4 S1 S2 0.975 S3 0.434 0.43 S4 0.43 0.432 0.857 32 Như vậy, Hai mẫu S1 và S2 có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất trong 4 mẫu nghiên cứu (có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,975) và đều tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%. Như vậy có thể khẳng định chính xác tên loài Sâm Núi Dành là Callerya speciosa (Champ. ex Benth) Schot.) 3.2. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG CỦ SÂM NÚI DÀNH Sau khi đã xác định được mẫu Sâm Núi Dành chuẩn, thu các mẫu củ tiến hành phân tích định tính một số nhóm chất quan trọng đặc trưng của Sâm. Từ đó khẳng định được chất lượng và giá trị của Sâm Núi Dành. Các mẫu Sâm được thu và được ký hiệu như sau: STT Ký hiệu Lượng mẫu Chú thích 1 M2 1kg Sâm Núi Dành <3 năm tuổi 2 M3 1kg Sâm Núi Dành 3-4 năm tuổi 3 M4 0,4kg Sâm Núi Dành 4-5 năm tuổi 4 M5 1 kg Sâm Núi Dành >5 năm tuổi Đối với phương pháp định tính do lượng mẫu Sâm M4 ít nên đã tiến hành gộp vào mẫu M3. Kết quả được trình bày tại các bảng sau: Bảng 3.4 . Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành dưới 3 năm tuổi TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét 1 Saponin - Tạo bọt (++) Có saponin 2 Flavonoid - Phản ứng với kiềm - Phản ứng Cyanidin - - Phản ứng với FeCl3 -Phản ứng với H2SO4 đậm đặc (++) (+) (++) (+) Có flavonoid 3 Coumarin - Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm - Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung (-) (-) Không có 33 dịch kiềm coumarin 4 Acid hữu cơ - Phản ứng với Na2CO3 (+++) Có acid hữu cơ 5 Acid amin - Phản ứng với ninhydrin (++) Có acid amin 6 Alkaloid - Hiện bằng thuốc thử Dragendorff (-) Không có alkaloid 7 Saccharid -Sắc ký bản mỏng có so sánh với chất chuẩn (++) Có saccharid Bảng 3.5. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành từ 3-5 năm tuổi TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét 1 Saponin - Tạo bọt (+++) Có saponin 2 Flavonoid - Phản ứng với kiềm - Phản ứng Cyanidin - - Phản ứng với FeCl3 -Phản ứng với H2SO4 đậm đặc (++) (+) (++) (+) Có flavonoid 3 Coumarin - Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm - Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (-) (-) Không có coumarin 4 Acid hữu cơ - Phản ứng với Na2CO3 (+++) Có acid hữu cơ 5 Acid amin - Phản ứng với ninhydrin (++) Có acid amin 6 Alkaloid - Hiện bằng thuốc thử Dragendorff (-) Không có alkaloid 7 Saccharid Sắc ký bản mỏng có so sánh với chất chuẩn (++) Có saccharid Bảng 3.6. Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành trên 5 năm tuổi TT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét 1 Saponin - Tạo bọt (+++) Có saponin 2 Flavonoid - Phản ứng với kiềm - Phản ứng Cyanidin - - Phản ứng với FeCl3 -Phản ứng với H2SO4 đậm đặc (+++) (++) (+++) (++) Có flavonoid 34 3 Coumarin - Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm - Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (-) (-) Không có coumarin 4 Acid hữu cơ - Phản ứng với Na2CO3 (+++) Có acid hữu cơ 5 Acid amin - Phản ứng với ninhydrin (+++) Có acid amin 6 Alkaloid - Hiện bằng thuốc thử Dragendorff (-) Không có alkaloid 7 Saccharid -Sắc ký bản mỏng có so sánh với chất chuẩn (++) Có saccharid Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính; (+): Phản ứng dương tính; (++): Phản ứng rõ; (+++): Phản ứng rất rõ Bảng 3.7. Một số hình ảnh của phản ứng định tính một số nhóm chất Các chất định tính Cá phản ứng thực hiện Hình ảnh Chú thích Định tính saponin: Phản ứng tạo bọt Định tính flavonoid: Phản ứng với NaOH 10% 1 2 1: Dịch chiết mẫu ban đầu 2: Dịch chiết mẫu sau phản ứng Phản ứng với dung dịch FeCl3 1: Dịch chiết mẫu ban đầu 2: Dịch chiết mẫu sau phản ứng 35 1 2 Định tính acid amin: Phản ứng với dung dịch ninhydrin 1 2 1: Dịch chiết mẫu ban đầu 2: Dịch chiết mẫu sau phản ứng Định tính saccharid: Hệ dung môi: CH2Cl2 : MeOH : H2O = 3 : 2: 0.15 1 2 3 1: Chất chuẩn (đường glucose) 2: Dịch chiết mẫu 3: Hỗn hợp chất chuẩn và dịch chiết mẫu Định tính alkaloid: Phản ứng với thuốc thử Dragendorff Từ các kết quả nghiên cứu đã thu được có thể thấy được Sâm Núi Dành là một loài Sâm quý bởi củ của nó có chứa các nhóm chất đặc trưng của các loại Sâm quý như: saponin, flavonoid, acid hữu cơ, acid amin, saccharid. - Sau khi đã xác định được chính xác loài Sâm Núi Dành (Callerya speciosa (Champ. Ex Benth) Schot.) và bước đầu đánh giá được chất lượng thông qua việc định tính được một số thành phần hoạt chất quan trọng có trong củ sâm, tiến hành thu mẫu để phục vụ cho nghiên cứu nhân giống vô tính. 36 3.3. NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÂM HOM VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO 3.3.1. Phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom  Ảnh hưởng của nồng độ IBA tới khả năng hình thành rễ và nảy chồi của các hom Sâm Núi Dành. Kết quả giâm hom theo dõi sau 60 ngày thực hiện được trình bày tại bảng sau: Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ hom giâm TT Công thức Tỷ lệ hom ra rễ (%) Số rễ TB/hom (rễ) Chiều dài rễ TB (cm) Chỉ số ra rễ 1 ĐC 0 0 0 0 2 CT1 0 0 0 0 3 CT2 9,3 1,8b 4,6a 8,3 4 CT3 29,0 2,8a 4,7a 13,2 5 CT4 15,6 1,5b 4,3a 6,5 CV(%) 8,8 6,4 LSD0,05 0,3 0,4 Chú thích : + ĐC: Nhúng qua nước cất + CT 1: Dung dịch IBA nồng độ 500ppm, nhúng nhanh trong 5 giây + CT 2: Dung dịch IBA nồng độ 1.000 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây + CT 3: Dung dịch IBA nồng độ 1.500 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây + CT 4: Dung dịch IBA nồng độ 2.000 ppm, nhứng nhanh trong 5 giây Từ bảng số liệu trên ta thấy khi xử lý hom qua nước cất và dung dịch IBA có nộng độ 500ppm thì hom không hình thành được rễ. Khi nồng độ IBA tăng lên từ 1000ppm – 2000ppm thì hom có sự hình thành rễ. Công thức CT3 với nồng độ IBA là 1.500ppm cho tỷ lệ cao nhất đạt 29,0% sai khác có ý nghĩa với các công thức còn lại ở mức độ tin cậy 95%. Các công thức còn lại là CT4 có nồng độ IBA cao hơn (2.000ppm) và CT2 có nồng độ IBA thấp hơn (1.000ppm) đều thu được kết quả thấp hơn CT3 (15,6% và 9,3%). 37 Như vậy là IBA có ảnh hưởng đến sự ra rễ của hom, số rễ trung bình/hom. Nồng độ TBA thấp hay cao sẽ thu được một tỷ lệ hom ra rễ nhất định. Khi sử dụng ở nồng độ thích hợp sẽ kích thích hom Sâm Núi Dành có phản ứng hình thành rễ tốt và chất lượng rễ cũng tốt hơn. (hình 3.7) Kết quả giâm hom Sâm Núi Dành lựa chọn được công thức tốt nhất là khi xử lý hom qua dung dịch có chứa IBA nồng độ 1.500ppm, cho tỷ lệ hom ra rễ là 29%. Hình 3. 5. Hom Sâm Núi Dành được xử lý qua các công thức thí nghiệm  Xác định giá thể ra cây phù hợp cho cây hom. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây hom Sâm Núi Dành STT Công thức Số cây sống trung bình Tỷ lệ cây sống (%) Số chồi TB/hom Số lá TB/hom 1 GT1 19,2c 32 1,4 2,6 2 GT2 30,6b 51 1,6 3,7 3 GT3 46,8a 78 1,8 4,1 4 GT4 35,4b 59 1,7 3,9 CV(%) 9,6 - - - LSD0,05 2,6 - - - Chú thích: + GT 1: Tầng đất B + GT 2: 50% đất tầng B+ 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa + GT 3: 30% đất tầng B + 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa + GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa 38 Kết quả thí nghiệm cho cây hom Sâm Núi Dành tại thí nghiệm 2 trên 04 giá thể cho thấy: Số cây sống ở công thức GT3 sai khác có nghĩa so với công thức giá thể GT1. Số cây sống trung bình tại các công thức giá thể dao động từ 19,2 – 46,8 cây. Trong đó giá thể GT3: 30% đất + 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa có tỷ lệ cây sống đạt cao nhất đạt 78% tiếp theo là công thức GT4 với 59%; GT2 là 51% và công thức giá thể GT1 có tỷ lệ ra cây sống thấp nhất 32%. Hình 3.6. Động thái tăng trưởng số chồi/hom Chú thích: SCTH.15: Số chồi hình thành sau 15 ngày SCTH.30: Số chồi hình thành sau 30 ngày SCTH.15: Số chồi hình thành sau 45 ngày SCTH.15: Số chồi hình thành sau 60 ngày SCTH.15: Số chồi hình thành sau 75 ngày SCTH.15: Số chồi hình thành sau 90 ngày Khi hom giâm sau 90 ngày được hình thành rễ đã tiến hành đóng các cành hom giâm vào các túi bầu chứa các giá thể khác nhau và cứ 15 ngày tiến hành theo dõi động thái tăng trưởng. Hình 3.8 kết quả theo dõi số chồi hình thành trên hom giâm. Ta thấy trước 60 ngày trồng vào giá thể ra cây thì tại các hom giâm không có sự thay đổi về số chồi/hom. Sau 60 ngày thì các công thức giá thể mới có sự thay đổi sau 90 ngày theo dõi giá thể GT3 cho số chồi cao nhất tiếp theo là giá thể GT4. Tương tự chỉ tiêu số chồi/hom thì chiều dài chồi cũng được theo dõi 15 ngày 1 lần, kết quả cho thấy các công thức không có sự chênh lệch nhiều về sinh trưởng chiều dài chồi. Giá thể GT3 sau 90 ngày chuyển thì có chiều dài 39 chồi lớn nhất 38,2 cm, tiếp theo là giá thể GT4 với 34,6cm tại GT2 là 35,4 cm và thấp nhất tại giá thể GT1 với 33,4 cm. Hình 3.7. Động thái tăng trưởng chiều dài của chồi hom giâm Chú thích: CDC: Chiều dài chồi GT1: Giá thể 1 GT2: Giá thể 2 GT3: Giá thể 3 GT4: Giá thể 4 Hình 3.8. Động thái tăng trưởng số lá/chồi Chú thích: SL.15 : Số lá sau 15 ngày SL.30: Số lá sau 30 ngày SL.45: Số lá sau 45 ngày SL.60: Số lá sau 60 ngày SL.75: Số lá sau 75 ngày SL.90: Số lá sau 90 ngày Qua hình 3.10 ta thấy các giá thể ra cây không ảnh hưởng nhiều tới khả năng sinh trưởng phát triển lá mới trên chồi giâm. Sau 60 ngày chuyển vào giá thể ra cây thì cành giâm mới bắt đầu ổn định và phát triển. 40 Tổng hợp các kết quả thu được từ các thí nghiệm nhân giống cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom: Hom có tỷ lệ ra rễ tốt nhất khi được xử lý qua dung dịch IBA nồng độ 1.500ppm đạt 29% và ra cây trên giá thể có chứa: 30% đất tầng B + 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa cho tỷ lệ cây sống cao nhất (78%). 3.3.2. Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro 3.3.2.1.Nghiên cứu xác định biện pháp khử trùng tạo mẫu sạch. Thí nghiệm sử dụng Javen 6% trong các khoảng thời gian (10, 12, 14 và 16 phút) và HgCl2 0,1% khử trùng trong (3, 5, 7 và 9 phút). Mẫu sau khi khử trùng được nuôi cấy trên trường MS. Sau thời gian theo dõi 20 ngày, kết quả khử trùng tạo mẫu sạch được thể hiện tại bảng 3.10. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch bệnh Loại hóa chất Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ sạch bệnh (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) Đặc điểm mẫu ĐC 0 0 0 Mẫu bị nấm, khuẩn Javen 6% 10 23,3 56,7 Mẫu xanh 12 34,2 48,3 Mẫu hơi ngả vàng 14 54,2 25,8 Mẫu hơi ngả vàng 16 61,7 10,7 Mẫu hơi ngả vàng HgCl2 0,1% 3 66,7 26,7 Mẫu xanh 5 95,7 65,8 Mẫu xanh 7 97,8 21,6 Mẫu hơi ngả vàng 9 99,2 8,3 Mẫu ngả vàng Phân tích kết quả từ bảng 3.10 cho thấy:  Với chất khử trùng là Javen 6%: Khi khử trùng mẫu bằng Javen 6% có tác dụng diệt khuẩn nhưng nó cũng gây phá hủy thành tế bào cellulose 41 của tế bào thực vật nên khi thời gian khử trùng dài tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao đồng thời tỷ lệ mẫu sống cũng giảm đi. Từ bảng số liệu trên ta thấy, thời gian khử trùng với Javen 6% trong 10 phút cho kết quả mẫu sống cao nhất là 56,7% nhưng tỷ lệ mẫu sạch bệnh lại thấp 23.3%. Khi tăng thời gian khử trùng lên 12 -14 phút thì tỷ lệ mẫu sạch bệnh tăng là 34,2% và 54,2% nhưng tỷ lệ mẫu sống giảm 48,3% và 25,8%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 16 phút thì tỷ lệ mẫu sạch bệnh tiếp tục tăng nhưng tỷ lệ mẫu sống giảm xuống còn 10,7%.  Với chất khử trùng là HgCl2 0,1%: HgCl2 có khả năng diệt khuẩn diệt nấm mạnh nhưng chúng cũng ngấm qua thành tế bào thực vật gây ngộ độc cho tế bào nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm giảm nhưng tỷ lệ sống cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.14 cho thấy, thời gian lắc khử trùng với HgCl2 0,1% trong 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất là 65,8% và tỷ lệ mẫu sạch bệnh là 95,7%. Khi tăng thời gian khử trùng lên 7 phút và 9 phút thì tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao hơn là 97,8% và 99,2% nhưng tỷ lệ mẫu sống cũng giảm đi còn 21,6 % và 8,3 %. Như vậy, thời gian khử trùng và chất khử trùng có ảnh hưởng tới tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ sống của mẫu cấy. Lựa chọn chất khử trùng là HgCl2 0,1% , thời gian khử trùng là 5 phút làm phương pháp khử trùng tốt nhất, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh và tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống của mẫu cao. 3.3.2.2. Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi Sâm Núi Dành Sau 30 ngày nuôi cấy, kết quả đánh giá thí nghiệm được thể hiện tại bảng 3.11. 42 Bảng 3. 11. Ảnh hưởng của Ki đến khả năng tái sinh chồi Công thức thí nghiệm Tỷ lệ nảy chồi (%) Chiều dài TB chồi (cm) Đặc điểm của chồi ĐC 68,5 7,83d Chồi sinh trưởng chậm CT1 90,8 10,27b Chồi sinh trưởng tốt, chồi xanh, mập CT2 97,5 10,53a Chồi sinh trưởng tốt, chồi xanh, mập CT3 100 10,7a Chồi sinh trưởng tốt, chồi xanh, mập CT4 96,7 10,2b Chồi sinh trưởng tốt, chồi xanh, mập CT5 90 9,63c Chồi sinh trưởng chậm hơn, xuất hiện callus ở gốc. CV% 0,8 LSD0,05 0,14 Chú thích: ĐC: MS + 30 g/l Sucrose + 6,5 g/l Agar CT1: ĐC + 0,2 mg/l Ki CT2: ĐC + 0,4 mg/l Ki CT3: ĐC + 0,6 mg/l Ki CT4: ĐC + 0,8 mg/l Ki CT5: ĐC + 1 mg/l Ki Hình 3. 9. Mẫu Sâm Núi Dành sau 2 tuần trên môi trường tái sinh a) Môi trường có bổ sung 0,6mg/l Ki b) Môi trường có bổ sung 1 mg/l Ki Sau 1 tuần thì Sâm Núi Dành bắt đầu phản ứng tái sinh chồi trên môi trường có bổ sung Ki. Ở môi trường đối chứng, sau 2 tuần Sâm Núi Dành mới 43 có phản ứng tái sinh chồi, chồi sinh trưởng chậm hơn so với các môi trường có bổ sung Ki. Từ bảng 3.11 cho thấy Ki có ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi của Sâm Núi Dành. Số chồi tái sinh cao nhất (100%), chồi sinh trưởng tốt, chồi xanh và mập ở công thức môi trường có bổ sung 0,6 mg/l Ki. Khi bổ sung nồng độ Ki cao (1mg/l) chồi sinh trưởng chậm hơn và xuất hiện callus ở gốc. Như vậy môi trường MS + 30g/l sucrose + 6,5g/l agar + 0,6 mg/l Ki được chọn là môi trường tái sinh chồi Sâm Núi Dành tốt nhất. 3.3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và IBA đến hệ số nhân chồi Sâm Núi Dành Kết quả th