Luận văn Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận - Decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men yarrowia lipolytica

ày có tiết ra một chất nhũ hóa làm ổn định trạng thái nhũ tương của môi trường [1]. Có lẽ chính vì thế mà thời gian lắc có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp g- decalactone của nấm men này. 1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất g- decalactone trong và ngoài nước a. Trong nước Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất chất thơm bằng con đường sinh học như sinh tổng hợp hoặc sinh chuyển hóa còn rất ít. Năm 1995-2000, dựa vào phản ứng ozon hóa từ dầu thầu dầu. Bùi Quang Thuật đã tổng hợp được các chất có giá trị cao như [R] g-decalactone, [R] d-undecalactone, diacetate [R]-1,4-decanodiol và khoảng 20 hợp chất thơm khác có hoạt tính quang học và sinh học, có thể sử dụng tốt trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm [4]. Năm 2003, trong khuôn khổ nhiệm vụ “Bảo tồn và lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm”, Viện Công nghiệp Thực phẩm lần đầu tiên đã tiến hành phân lập và khảo sát sơ bộ một số chủng nấm men có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm. Từ các kết quả phân lập mới và khảo sát các chủng có sẵn trong sưu tập giống, nhóm đề tài đã tuyển chọn được 3 chủng nấm men có khả năng chuyển hóa axit ricinoleic từ dầu thầu dầu để tạo chất thơm trong quá trình nuôi cấy. Chất thơm đã được sơ bộ xác định thành phần bằng phương pháp sắc ký khí (GC), g-decalactone tạo ra đã được sơ bộ định lượng và tách chiết. Hiệu suất tổng hợp g-decalactone bằng các chủng nấm men của Viện Công nghiệp Thực phẩm đạt cao nhất là 0,24% (240 mg/L môi trường nuôi cấy) đối với chủng KFP 346 [3]. Năm 2003, Lại Thị Ngọc Hà, đã công bố kết quả nghiên cứu về một số yếu tố có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp g-decalactone của chủng nấm men Yarrowia lipolytica W29. Ở điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm với cơ chất dầu thầu dầu 20 g/L, pH=7,0, tốc độ lắc 200 vòng/phút, chủng nấm men này tổng hợp được 621mg g-decalactone/lít môi trường [1]. b. Ngoài nước Nhu cầu về chất thơm sử dụng trong các lĩnh vực chế biến thực phẩm, đồ uống, mỹ phẩm, dược phẩm và chất tẩy rửa đạt khoảng 16-20 tỷ đô la Mỹ hàng năm nhưng vẫn chủ yếu là các chất thơm được tổng hợp hóa học và chỉ rất ít trong chúng được sản xuất bằng con đường tách chiết từ thực vật hoặc qua sự trao đổi chất của vi sinh vật. g- lactone và d-lactone là thành phần chủ yếu tạo nên hương thơm của các nguồn hương tự nhiên như các loại quả và một số sản phẩm lên men. Hương thơm của các lactone là do cấu trúc vòng lactone quyết định, độ dài của mạch cacbon và cấu trúc đồng phân quang học. g- decalactone, chất hương có giá trị lớn trong nhiều ngành công nghiệp và cho đến nay là chất thơm chính được tổng hợp bằng con đường sinh học. Sản lượng g-decalactone càng ngày càng tăng, dẫn đến giá thành giảm dần. Năm 1997, sản lượng g-decalactone đạt 10 tấn làm giảm giá thành đáng kể từ trên 12.000 đô la Mỹ/kg (năm 1986) xuống còn 500 đô la Mỹ/kg năm 1998 và 300 đô la Mỹ/kg năm 2003. Các nhà sản xuất chất thơm rất quan tâm đến việc hạ giá thành sản xuất và điều này đã dẫn tới sự thay đổi trong định hướng nghiên cứu ở lĩnh vực này [20]. Một số kết quả nghiên cứu khoa học về chuyển hóa cơ chất tạo thành chất thơm dạng lactone nhờ sử dụng vi sinh vật đã được thống kê như sau: Farbood và Willis (1985) sử dụng các chủng nấm men Yarrowia lipolytica, Aspergillus oryzae, Geotrichum klebahnii và Candida sp. Để tổng hợp g-decalactone từ các cơ chất chính là dầu thầu dầu, dầu thầu dầu cùng với enzyme lipase, dầu thầu dầu thủy phân ở quy mô phòng thí nghiệm trong các bình tam giác có khuấy. Tuy nhiên, hiệu suất thu được còn thấp, chỉ đạt 0,69g/L môi trường sau 1 tuần nuôi cấy [17]. Trong một nghiên cứu gần đây, Alchihab M và cộng sự (2010) đã sử dụng các chủng nấm men Rhodotorula aurantiaca phân lập từ Nam Cực để lên men dầu thầu dầu tạo g-decalactone. Nồng độ γ-decalactone cao nhất đạt 5,8g/L trên môi trường chứa 20g/L dầu thầu dầu [8]. Nồng độ γ-decalactone tích tụ trong canh trường cao nhất hiện nay (12,3 g/L) được ghi nhận bởi nhóm tác giả Đức thực hiện trên Yarrowia lipolytica HR 145 (DSM 12397), môi trường chứa 0,5% ure, khoáng chất, vitamin, 0,07% Tween 80, và 5% dầu thầu dầu, sau khi đã tối ưu hóa điều kiện lên men. Kỹ thuật này đã được đăng ký bản quyền công nghệ bởi công ty Haarmann & Reimer GmbH [33]. Groguenin và cộng sự năm 2004, sau khi xác định được các đặc tính của một số enzyme của con đường β - oxy hóa trong nấm men Yarrowia lipolytica, đã nghiên cứu loại bỏ một số enzime hoạt động trong quá trình chuyển hóa chuỗi ngắn. Khi loại bỏ được các enzyme này, đã nâng cao được hiệu suất chuyển hóa và tích lũy các hợp chất hương thơm lớn hơn 4 lần [24]. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trường nghiên cứu 2.1.1. Vi sinh vật Trong nghiên cứu này, chủng nấm men Yarrowia lipolytica VTP-5 được dùng để chuyển hóa dầu thầu dầu thành g- decalactone. Đây là chủng nấm men chuyển hóa chất béo (oleaginous yeast), trước đây được phân lập từ nem chua, hiện đang được lưu giữ tại Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein - Viện Công nghiệp Thực phẩm. 2.1.2. Hóa chất Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng. Hóa chất Nguồn gốc Hóa chất Nguồn gốc HCl bão hòa 20% Meck-Đức Albumin Sigma-Mỹ Yeast extract Wako-Nhật NAOH 6M Meck-Đức Tryptone Wako-Nhật Dầu phá bọt Sigma-Mỹ Agar Wako-Nhật Etanol Meck-Đức D- Glucose Wako-Nhật g-decalacton chuẩn Meck-Đức Etyl axetat Wako-Nhật Dietyl Ether Meck-Đức Butanol Meck-Đức Tween 80 Sigma-Mỹ Malt extract Wako-Nhật Castor oil Việt Nam KCL Meck-Đức Peptone Wako-Nhật 2.1.3. Thiết bị Các thiết bị phụ vụ cho quá trình nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm bao gồm các loại thiết bị và nguồn gốc như sau: Bảng 2.2 Thiết bị trong nghiên cứu STT Thiết bị Nguồn gốc STT Thiết bị Nguồn gốc 1 Máy đo pH Ohaus Thụy Điển 15 Máy ly tâm Đức 2 Cân phân tích Ohaus Thụy Điển 16 Tủ lạnh sâu -200C Nhật 3 Máy khuấy từ Nhật 17 Máy khuấy trộn Vontex RotoLab OSI 4 Tủ nuôi cấy Nhật Bản 18 Tủ cấy vô trùng Nhật 5 Lò vi song Sanyo EM Nhật 19 Tủ Hốt Mỹ 6 Máy lắc ổn nhiệt Đức 20 Thiết bị cô quay chân không Buchi RE 111 Thụy sỹ 7 Tủ sấy Việt Nam 21 Hệ thống GC Thermo Finigan Mỹ 8 Máy ảnh Canon Isus 1200 Nhật 22 Thiết bị đông khô Christ Đức 9 Máy đo OD Mỹ 23 Tủ cấy Box Đức 10 Máy lắc Gyrmax Mỹ 24 Tủ nuôi cấy Sanio Nhật 11 Tủ sấy Memmert Trung Quốc 25 Kính hiển vi Olympus Nhật 12 Nồi khử trùng Study Nga 26 Thiết bị lên men 5L New Brunswick Mỹ 13 Thiết bị lên men 50L Marubishi Nhật 27 Máy ly tâm CeFa – Z41, 60 lít/giờ Đức 14 Thiết bị chưng cất Clevenger Đức 2.1.4. Môi trường (g/L) * Môi trường giữ giống (YMA) Yeast extract 3 Malt extract 3 Peptone 5 Glucose 10 Agar 20 * Môi trường hoạt hóa giống: Môi trường YM dịch thể Yeast extract 3 Malt extract 3 Peptone 5 Glucose 10 * Môi trường nhân giống Peptone 20 Yeast extrac 10 Glucose 20 * Môi trường lên men Dầu thầu dầu (castor oil) 100 Pepton 20 Tween 80 1 2.2. Phương pháp 2.2.1. Nhân giống và lên men trên máy lắc * Nhân giống Cấy 10 vòng que cấy giống từ ống thạch nghiêng vào bình tam giác chứa 50mL môi trường nhân giống, nuôi lắc 200 v/p, trong 9h ở 27ºC để đạt mật độ tế bào cao nhất (6,5.106/mL). Huyền dịch thu được này được coi là giống cấp 1 để tiếp giống cấy vào các môi trường lên men. * Lên men trên máy lắc Việc lên men trên máy lắc, được diễn ra sau tiếp giống cấp 1 vào các bình chứa 100 mL môi trường lên men trong thời gian 4 ngày, ở nhiệt độ 27ºC, tốc độ lắc 200 v/p. Các khảo sát sau đây đã được tiến hành đối với lên men lắc: a) Khảo sát tốc độ lắc Các tốc độ lắc 140, 200, 250, 300 v/p đã được khảo sát đối với 4 bình tam giác mỗi bình chứa 100 mL môi trường lên men. b) Khảo sát pH môi trường ban đầu: pH= 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 Các pH ban đầu khác nhau (4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7), đã được khảo sát đối với 7 bình tam giác 500 mL, mỗi bình chứa 100 mL môi trường lên men. Tiếp giống cấp 1 vào môi trường lên men, tiến hành lên men trong 4 ngày ở nhiệt độ 27ºC, tốc độ lắc 200 v/p. c) Khảo sát tỉ lệ tiếp giống (tỉ lệ cấy) Khảo sát các tỉ lệ tiếp giống 5%, 10%, 15%, 20%, thể tích môi trường lên men. Nuôi giống trong 9h, Sau đó tiếp giống vào các bình lên men đã được chuẩn bị trước với các tỉ lệ giống như trên. Lên men trong thời gian 4 ngày, ở nhiệt độ 27ºC, tốc độ lắc 200 v/p. d) Khảo sát thời gian lên men Thời gian lên men được khảo sát là 3, 4, 5, 6 ngày, tất cả được tiếp giống cấp 1 với tỉ lệ 10% (6,5.106 tế bào/mL), có pH ban đầu là 5,4 ở 27oC, lắc 200 v/p. 2.2.2. Lên men theo mẻ trên nồi 5L Các thông số lên men: Nồi lên men có thể tích làm việc 3 L; tỉ lệ tiếp giống 10% (v/v), nhiệt độ 270C, khuấy 200 v/p, cấp khí 0,7 L/L môi trường/phút; tần suất lấy mẫu phân tích: 8 giờ một lần; thời điểm kết thúc lên men: 64h. 2.2.3. Lên men theo mẻ - có tiếp dần cơ chất, trên nồi 5L Khác với lên men theo mẻ đã được trình bày ở mục 2.2.2, nồng độ cơ chất (dầu thầu dầu) ban đầu trong môi trường lên men chỉ là 40% nồng độ tổng, tức 120g/3L. Phần còn lại, 60% tức 180g/3L được tiếp dần vào nồi lên men ở thời điểm 16h lên men, với tốc độ 2mL/phút. Tần suất lấy mẫu như ở lên men theo mẻ. 2.2.4. Lên men theo mẻ trên nồi 50L Các thông số lên men như sau: Thể tích làm việc của nồi 30L Lên men ở điều kiện khuấy 200 vòng/phút, nuôi 270C, cấp khí 0,7L/L Tần suất lấy mẫu 4h một lần, kết thúc lên men tại thời điểm 64h 2.2.5. Lên men theo mẻ có - tiếp dần cơ chất, trên nồi 50L Khác với ở mục 2.2.4 ở đây nồng độ dầu thầu dầu sử dụng ban đầu là 40% nồng độ tổng, tức 1200g/30L, phần còn lại, 60% tức 1800g/30L được tiếp dần vào nồi lên men ở thời điểm 16h với tốc độ 20mL/phút, tần suất lấy mẫu 4h một lần, kết thúc lên men tại thời điểm 64h. 2.2.6. Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu Dụng cụ: buồng đếm hồng cầu Thomas. Buồng đếm này có 16 khối lập phương, mỗi khối lớn được chia thành 16 khối nhỏ. Kích thước khối như sau: Chiều sâu các khối: 1/10mm Chiều dài cạnh khối nhỏ: 1/20mm Diện tích đáy khối nhỏ: (1/20)2 = 1/400mm2 Thể tích một khối nhỏ: (1/20)3 = 1/4000mm3 Thể tích một khối lớn: 16x 1/4000mm3 = 1/250mm3 Thể tích buồng đếm: 16x 1/250mm3= 0,064 mm3 Tiến hành: Pha loãng mẫu (đảm bảo mỗi ô lớn có từ 5 đến 10 tế bào). Dùng pipet hút nhanh 1 giọt mẫu nhỏ lên buồng đếm, phủ lá kính. Soi đếm trên kính hiển vi. Đếm số lượng tế bào trong 5 khối lớn. Tính kết quả theo công thức: N= n/v.f Trong đó: N: số tế bào/1mL dịch mẫu n: số tế bào trung bình trong 1 khối lớn v: thể tích khối lớn = 1/250mm3 f: hệ số pha loãng mẫu Để xác định số tế bào sống/tổng số tế bào trong mẫu: Tiến hành nhuộm mẫu bằng xanh Metylen (1 giọt mẫu: 1 giọt xanh metylen), các tế bào chết sẽ bắt màu xanh. 2.2.7. Lactone hóa dịch sau lên men 2.2.7.1. Lactone hóa có gia nhiệt Dịch sau lên men đã loại bỏ sinh khối được hạ pH về 2 bằng HCl 6 N (để cho axit 4-hydro decanoic đóng vòng thành γ-decalctone), thủ tục này được thực hiện bằng lắc đều rồi đun nóng đến 85°C - 90°C trong thời gian 10-30 phút. Sau thủ tục này sẽ thu được dịch lactone hóa 1 (có gia nhiệt) chứa γ-decalctone, dịch này được dùng để tách chiết γ-decalctone bằng dung môi. 2.2.7.2. Lactone hóa không gia nhiệt Dịch sau lên men đã loại bỏ sinh khối được chia làm 3 mẫu: mẫu 1 giữ nguyên không chỉnh pH; mẫu 2 chỉnh pH về 1,5; mẫu 3 chỉnh pH về 2, sau thủ tục này sẽ thu được dịch lactone hóa 2 (không gia nhiệt) chứa g-decalactone, dịch này để dùng tách chiết g-decalactone (mục 2.2.9), hoặc chưng cất thành dịch ngưng tụ chứa g-decalactone (mục 2.2.8) cũng dùng để tách chiết. 2.2.8. Chưng cất dịch lên men đã được lactone hóa Dịch lactone hóa ở pH 2 như trên, được chưng cất bằng thiết bị Clevenger ở nhiệt độ 100ºC để thu nhận dịch ngưng tụ chứa các cấu tử hương thơm. 2.2.9. Tách chiết g-decalactone bằng dung môi Dịch lactone hóa 1 và 2 cũng như dịch ngưng tụ, ở các mục 2.2.7-2.2.8, được dùng làm nguồn để thu nhận γ-decalactone bằng cách chiết rút bằng dung môi: 1,5 ml mỗi dung dịch đó được bổ xung 1,5 ml dung môi diethyl ether, lắc nhẹ 1,5 phút, để yên và dùng pipet hút lấy phần dịch phía trên chính là dịch chiết chứa g-decalactone. 2.2.10. Loại bỏ dung môi khỏi dịch chiết Dịch chiết thu được ở mục 2.2.9 được loại bỏ dung môi bằng cột crudemar hoặc bằng thiết bị cô quay chân không buchi RE, nguyên lý hoạt động của hai thiết bị này như sau: dịch chiết được hút vào bình cầu crudema hoặc bình cầu cô quay của thiết bị ở nhiệt độ 45ºC, tới khi diethyl ether bay hết. Dùng pipet hút lượng dịch cô còn lại (chứa γ-decalactone) được phân tích bằng GC. 2.2.11 Làm sạch dịch chiết cô đặc 2.2.11.1 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng cách rửa kiềm Dịch chiết cô đặc chứa (γ-decalactone) được làm sạch bằng cách rửa bằng kiềm (NaOH pH 11-12), sau đó chiết lại bằng diethyl ether, rồi loại bỏ dung môi bằng thiết bị cô quay chân không, đến khi dung môi bay hơi hết. Dịch thu được sau thủ tục này được gọi là dịch chiết sạch 1 (rửa bằng kiềm) sẽ được định lượng γ-decalactone bằng GC hoặc dùng cho thủ tục cuối cùng: đánh giá cảm quan. 2.2.11.2 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng Na2SO4 khan Dịch sau cô đặc được pha vào cồn tuyệt đối (tỷ lệ 20 ml dịch cồn/50 ml dịch cô đặc) rồi loại bỏ dung môi nhờ thiết bị cô quay chân không tới khi cồn và diethyl ether còn sót lại bay hơi hết, dịch thu được tiếp tục được làm sạch bằng Na2SO4 khan. Dịch thu được sau thủ tục này được gọi là dịch chiết sạch 2 (bằng Na2SO4) . 2.2.12. Đánh giá cảm quan Đánh giá sự sinh trưởng nấm men thông qua khối lượng sinh khối. Đánh giá màu sắc dịch sau lên men thông qua sự đồng đều của màu sắc trong các bình sau lên men. 2.2.13. Phân tích định lượng g-decalactone bằng sắc ký khí Sử dụng phương pháp sắc ký khí (Gas Chromatography-GC) được thực hiện tại Trung tâm phân tích, Viện Khoa học hình sự, Bộ Công An Nguyên lý: Mẫu được phân tích GC bơm vào trong cột và theo dòng khí mang (thường là nitơ) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra và được ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận được, máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ. Hàm lượng mỗi chất được xác định nhờ thời lượng lưu trên sắc ký đồ. Thực hiện: Dùng pipet sạch hút chính xác 100 μl mẫu phân tích GC sau đó bổ xung dung dịch chuẩn: γ-decalactone (mg/mL), cho vào ống Eppendort sạch đã thanh trùng có đánh số kí hiệu mẫu phân tích GC. Thông số thiết bị sắc kí: + Thiết bị GC Aligent 6890 A/ USA + Thể tích mẫu tiêm: 2 μl + Khí mang: N2 + Detector ion hóa ngọn lửa (FID), khí đốt của FID: H2 + O2 + Cột HP1: 30μm, nhiệt độ từ 80OC- 250OC trong 10 phút, kích thước cột 30μm x 250μm x 0.25 μm. Sơ đồ quá trình lên men thu nhận g-decalactone: Chủng nấm men nghiên cứu Kết quả: lượng γ-decalactone Hoạt hóa Tinh sạch, sau đó phân tích GC Dịch môi trường YM chứa nấm men Dịch chiết cô đặc (chứa γ-decalactone) Nhân giống Dịch môi trường nhân giống chứa nấm men Loại bỏ dung môi Lên men Dịch chiết (chứa γ-decalactone) Huyền dịch sau lên men Chiết bằng dung môi Ly tâm (10000 v/p) loại sinh khối Dịch chưng cất Chiết bằng dung môi Dịch sau lên men (đã loại sinh khối) Chưng cất Lactone hóa bằng HCl pH 1,5-2 Dịch lactone hóa CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Lựa chọn điều kiện lên men trên máy lắc 3.1.1. Lựa chọn tốc độ lắc Yarrowia lipolytica là nấm men hiếu khí bắt buộc, vì vậy chế độ thông khí sẽ ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và tích tụ γ-decalactone trong môi trường lên men. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1. Cho thấy tốc độ lắc thích hợp cho chủng Y. lipolytica VTP5 là 200 vòng/phút, lượng γ-decalactone tích tụ đạt 2,164 g/L. Kết quả củng cho thấy theo sự thay đổi tốc độ lắc, thì sự tăng hay giảm lượng sinh khối và lượng γ-decalactone diễn ra cùng chiều. Điều đó chỉ mới gợi ý rằng lượng sản phẩm tối đa đạt được ở tốc độ 200 v/p như ở đây có thể là do tốc độ lắc ấy sự sinh trưởng của nấm men là tốt nhất. Còn khả năng tạo sản phẩm của mỗi tế bào có là cao nhất ở tốc độ lắc ấy không thì vẫn là câu hỏi để ngỏ, cần có các nghiên cứu chính xác hơn, trước hết là tính lượng sản phẩm trên đơn vị sinh khối khô. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hiệu suất lên men Tốc độ lắc (vòng/phút) Lượng sinh khối ướt (g/L) Lượng g-decalactone (g/L) 140 38,0 1,892 ± 0,016 200 41,0 2,164 ± 0.025 250 37,5 1,791 ± 0.033 300 35,0 1,477 ± 0,027 3.1.2. Lựa chọn pH môi trường lên men Số liệu được trình bày trong bảng 3.2 cho thấy: pH 6,0 là thích hợp nhất cho Y- lipolytica VTP5 sinh trưởng và chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm γ-decalactone, với lượng sinh khối ướt và γ-decalactone đạt giá trị cao nhất, tương ứng là 48,5 g/L và 2,286 g/L sau 4 ngày nuôi cấy. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu suất lên men pH môi trường pH khi kết thúc lên men Sinh khối ướt (g/L) Lượng g-decalactone (g/L) 4,0 3,80 31,0 1,158 ± 0,018 4,5 4,12 35,0 1,732 ± 0,027 5,0 4,32 41,0 2,184 ± 0,038 5,5 4,50 45,0 2,212 ± 0,035 6,0 4,65 48,5 2,286 ± 0,032 6,5 4,70 43,0 1,836 ± 0,026 7,0 4,85 35,5 1,432 ± 0,014 Mỗi chủng nấm men đều có pH môi trường thích hợp riêng cho sự tổng hợp γ-decalactone. Có thể ở điều kiện pH này, tế bào nấm men sản sinh ra một chất nhũ tương hóa giúp lipit hòa tan tốt trong canh trường. Điều này đã được Pagot cùng cộng sự đã đề cập. Theo họ, khi hạt lipit đạt kích thước nhỏ nhất, diện tích tiếp xúc riêng của chúng là lớn nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc với tế bào nấm men, giúp cho sự trao đổi chất tạo sản phẩm thứ cấp trong tế bào diễn ra nhanh hơn, mạnh hơn [31]. 3.1.3. Lựa chọn thời gian nhân giống Trong quá trình nhân giống cấp 1, ở điều kiện lắc 200 v/p, nhiệt độ 27oC thì đạt mật độ cao nhất sau 9 giờ tuổi, ở mức 6,5 x 106 tế bào/mL (bảng 3.3) từ thời điểm 12 giờ trở đi, hầu hết tế bào ở dạng khuẩn ty, vì thế chúng tôi không thể xác định được mật độ tế bào theo phương pháp đếm trong buồng đếm hồng cầu trong luận văn này. Tuy nhiên, việc nhân giống cấp 1, với thời gian lâu hơn 9 giờ để có thể có được mật độ tế bào cao hơn 6,5 x 106 tế bào/mL là không kinh tế vì tiêu tốn thêm thời gian và năng lượng. Bảng 3.3. Sự biến đổi mật độ tế bào theo thời gian nhân giống Tuổi giống (giờ) Mật độ tế bào (106/mL) Hình thái tế bào 0 1,0 Hình trứng, trứng dài 6 3,0 Hình trứng, trứng dài 9 6,5 Hình trứng, trứng dài, một số tạo khuẩn ty 12 - Hầu hết tạo khuẩn ty 18 - Hầu hết tạo khuẩn ty Ghi chú: - Không đếm được vì tế bào hầu hết tạo thành khuẩn ty 3.1.4. Lựa chọn tỷ lệ cấy giống Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hiệu suất lên men trên máy lắc Tỷ lệ giống (%, v/v) Sinh khối ướt (g/L) Lượng g-decalactone (g/L) 5 38,5 1,918 ± 0,018 10 49,5 2,679 ± 0,042 15 51,5 1,734 ± 0,019 20 45,0 1,527 ± 0,032 Với giống cấp 1 đã đạt mật độ 6,5 x 106 tế bào/mL trong các điều kiện lắc như ở các mục 3.1.3, khi tỷ lệ cấy giống thay đổi từ 5 đến 20% (v/v) thì lượng sinh khối và lượng sản phẩm thay đổi như trong bảng 3.4. Theo đó lượng sản phẩm đạt mức cao nhất 2,679 g/L ứng với tỷ lệ cấy giống 10% (v/v) . Cũng theo trong bảng 3.4, ở tỷ lệ giống 15% thì lượng sản phẩm giảm xuống, còn lượng sinh khối thì tăng lên so với tỷ lệ giống 10%, lượng sản phẩm tiếp tục giảm khi tỷ lệ giống tăng lên 20%, còn sinh khối cũng giảm. Những hiện tượng này có thể được giải thích rằng, so với tỉ lệ giống 10% thì tỷ lệ giống 5% chưa đủ tạo ra lượng sinh khối cần thiết để tạo nhiều sản phẩm; tỷ lệ giống 15% tạo ra quá nhiều sinh khối khiến chúng phân hủy (tiêu dùng) một phần sản phẩm đã tạo ra; và với tỷ lệ giống 20% thì lượng sinh khối sinh ra phải giảm xuống vì cơ chất không đủ cho chúng, mặc dù chúng đã tiêu thụ một phần sản phẩm. 3.1.5. Lựa chọn thời gian lên men Kết quả trình bày trong bảng 3.5 cho thấy, với các điều kiện lên men đã lựa chọn trong mục 3.1.1- 3.1.4, chủng Y. lipolytica VTP5 có khả năng tổng hợp lượng γ-decalactone ở mức cao nhất là 2,835 g/L sau 4 ngày lên men. Tới ngày thứ 5, lượng sản phẩm giảm xuống, có thể là do bị tiêu dùng một phần bởi các tế bào. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone của chủng Y. lipolytica VTP5 Thời gian lên men (ngày) Lượng g-decalactone (g/L) 3 1,753 ± 0,028 4 2,835 ± 0,043 5 2,451 ± 0,037 3.1.6. Ứng dụng phương pháp lên men tiếp dần cơ chất (fed-culture) Theo một số nghiên cứu đã được công bố, để giảm bớt ảnh hưởng kìm hãm của ricinoleic acid/methyl ricinoleate trong dầu thầu dầu đến sự sinh trưởng của nấm men chuyển hóa dầu này thành γ-decalactone, các tác giả đã sử dụng phương pháp lên men 2 pha [39][41], hoặc phương pháp lên men tiếp dần cơ chất (fed – batch) [34]. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu sử dụng phương pháp thứ hai này, theo đó có 3 công thức thí nghiệm: môi trường ban đầu chứa 20, 40, 60 g dầu thầu dầu/L, sau 24 giờ lên men, được tiếp thêm lượng dầu thầu dầu còn lại. Ở công thức đối chứng, môi trường chứa 100 g dầu thầu dầu/ L ngay từ ban đầu. Kết quả trong bảng 3.6 cho thấy phương thức lên men tiếp dần cơ chất đã nâng cao hiệu suất lên men của Y. lipolytica VTP5; ở cả 3 công thức thí nghiệm lượng sinh khối và lượng sản phẩm đều tăng so với ở công thức đối chứng riêng ở công thức “40+60” cả lượng sinh khối và lượng sản phẩm đều đạt mức cực đại so với các công thức khác. Kết quả nghiên cứu chứng tỏ dầu thầu dầu có ảnh hưởng ức chế đến sự sinh trưởng của nấm men, thông qua đó làm giảm lượng γ-decalactone thu được nhờ lên men. Phương pháp fed-batch có hiệu quả tốt ở quy mô máy lắc như vừa trình bày, sẽ được ứng dụng ở quy mô nồi lên men 5L và 50L trong các phần tiếp theo. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng dầu thầu dầu sử dụng ban đầu đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone của chủng Y. lipolytica VTP5 Công thức Sinh khối ướt (g/L) g-decalactone (g/L) ĐC: 100 g/L dầu thầu dầu 48,5 2,835 ± 0,039 MT ban đầu: 20 g/L dầu thầu dầu; sau 24 giờ tiếp thêm 80 g/L (20+80) 50,5 3,386 ± 0,047 MT ban đầu: 40 g/L dầu thầu dầu; sau 24 giờ tiếp thêm 60 g/L (40+60) 53,5 3,643 ± 0,042 MT ban đầu: 60 g/L dầu thầu dầu; sau 24 giờ tiếp thêm 40 g/L (60+40) 51,0 3,094 ± 0,034 3.1.7. Tóm tắt kết quả lựa chọn điều kiện lên men trên máy lắc Trong Bảng 3.7 có nêu lên các thông số đã được lựa chọn một cách riêng lẻ (trong khi cố định các thông số khác) để đạt được lượng sản phẩm cao nhất. Các thông số đã được lựa chọn này sẽ được áp dụng tiếp tục cho lên men ở quy mô 5L và 50L. Bảng 3.7. Tổng hợp kết quả lựa chọn điều kiện lên men sinh γ-decalactone nhờ Y. lipolytica VTP5 ở quy mô máy lắc Điều kiện lên men Thông số thích hợp (riêng lẻ) Lượng g-decalactone (g/L) Tốc độ lắc 200 vòng/phút 2,164 ± 0,025 pH môi trường 6 2,286 ± 0,032 Tỷ lệ giống cấp 1 10% ( nuôi 27oC, 200 v/p, 9h) 2,679 ± 0,042 Thời gian lên men 4 ngày 2,835 ± 0,043 Lên men có tiếp dần cơ chất 40 g/L dầu thầu dầu ban đầu, sau 24 giờ bổ sung 60 g/L 3,643 ± 0,042 Năng suất chuyển hóa (mg γ-decalactone /giờ) = (số mg γ-decalactone tại thời điểm cực đại) / (9 giờ nhân giống + thời gian để đạt sản phẩm cực đại) 3643=37,95x(9+88) 37,95 3.2. Nghiên cứu các phương thức lên men ở quy mô 5L và 50L 3.2.1. Lên men ở quy mô 5L 3.2.1.1. Lên men theo phương thức (batch culture) không khống chế pH và DO Các điều kiện lên men cơ bản gồm: nồi lên men có dung tích 5L (dung tích làm việc 3L), môi trường chứa 100 g/L (10%) dầu thầu dầu, tỷ lệ giống cấp 1 là 10%, tốc độ khuấy 200 vòng/phút, cấp khí 0,7 L/L môi trường/phút, nhiệt độ 27oC. Với phương thức lên men “không khống chế pH và DO”, kết quả (Hình 3.1) cho thấy: - Môi trường lên men sau khi thanh trùng có pH 5,42. Trong 8 giờ đầu pH giảm nhẹ xuống 5,02; sau đó tăng nhanh, đạt giá trị cao nhất là 7,0 ở 24 giờ lên men, rồi giảm dần đến 4,53 khi kết thúc lên men ở 96 giờ. - Hàm lượng ôxy hòa tan trong môi trường đạt 75,3% khi bắt đầu lên men, giảm nhanh xuống 5% sau 16 giờ, sau đó giảm nhẹ dần và giữ ở 0,2% từ 64 giờ cho đến khi kết thúc lên men ở 96 giờ. Điều này cho thấy nấm men Y. lipolytica VTP5 sinh trưởng và tiêu thụ ôxy với mức độ cao. - Sinh khối nấm men tăng nhanh, đạt giá trị cao nhất là 5,31 gam sinh khối ướt/100 mL (53,1 g/L) ở 48 giờ, sau đó giảm nhẹ còn 4,85 g/100 mL khi kết thúc lên men. - γ-decalactone bắt đầu được tích tụ trong môi trường lên men sau 24 giờ, tăng dần và đạt giá trị cao nhất là 4,264 g/L sau 88 giờ lên men, sau đó giảm còn 3,920 g/L khi kết thúc lên men ở 96 giờ. Không có hiện tượng tế bào nấm men bị chết khi nồng độ γ-decalactone trong môi trường nuôi cấy tăng dần. Như vậy, khi lên men theo mẻ ở nồi lên men dung tích 5L, theo phương thức “không khống chế pH và DO”, hiệu suất chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu thành γ-decalactone tăng 50% (đạt 4,264 g/L) so với lên men trên máy lắc (2,835 g/L). Sinh khối tế bào nấm men tăng không nhiều so với khi nuôi cấy trên máy lắc. Tuy nhiên, thời gian lên men vẫn kéo dài. Lượng sản phẩm tăng lên như trên, so với lên men trên máy lắc có thể liên quan đến tác dụng