Luận văn Nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử

ược phóng đại lớn hơn nhiều lần tùy vào khoảng cách đặt vật cũng như độ dài tiêu cự vật kính. Thấu kính được sử dụng có độ dày đủ mỏng để độ dài đường đi của ánh sáng qua vật kính là không đáng kể. Ảnh thật được tạo qua vật kính gọi là ảnh trung gian. Để quan sát được ảnh này người ta phải dùng một thấu kính thứ hai đặt gần ảnh trung gian để tạo ra ảnh ảo trên võng mạc của mắt, thấu kính thứ hai này còn được gọi là thị kính. Do đó khi quan sát vật qua kính hiển vi ta luôn thấy được ảnh của nó nằm cùng chiều và lớn hơn nhiều lần so với mẫu vật [8] Đặt khoảng cách từ vật tới tâm của vật kính (vật kính trong trường hợp này là một thấu kính đơn) là a theo hình1.2, khoảng cách từ tâm của vật kính tới ảnh là b, tiêu cự của vật kính là f.Theo tính chất thấu kính lồi dùng làm vật kính ta có công thức sau: 1 1 1 a b f + = Suy ra .a f b a f = − 1. 2 h b h a = (2.1) Độ phóng đại của ảnh được xác định bởi: b f M a a f = = − (2.2) Như vậy khi vật đặt rất gần tiêu cự của thấu kính thì độ phóng đại càng lớn. Khi độ lớn của vật mẫu là h1 và h2 là độ lớn của ảnh thì: ℎ2 = 𝑀. ℎ1 (2.3) Xác định được độ lớn của ảnh trung gian thì ta sẽ tính được độ lớn của ảnh khi quan sát thị kính, lúc này ảnh trung gian lại đóng vai trò là vật cần quan sát. a) Cấu hình quang học Có hai loại cấu hình quang học của kính hiển vi: kính hiển vi có chiều dài ống giới hạn và kính hiển vi hiệu chỉnh tia sáng vô cùng. Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 10 Hình 1.5. Sơ đồ kính hiển vi giới hạn chiều dài ống Theo hình 1.2, một vật có chiều cao h1 đặt cách tâm vật kính một khoảng là a cố định, ảnh trung gian được tạo ra bởi vật kính sẽ phụ thuộc vào tiêu cự và khoảng cách a, giả sử khoảng cách từ ảnh trung gian tới tâm vật kính là b thì độ cao của ảnh h2 được xác định là 1. 2 h b h a = Theo công thức (2.1) thì .a f b a f = − .a f b a f = − ,a và f cố định nên khoảng cách b là cố định, dẫn đến chiều cao h2 của ảnh phụ thuộc vào khoảng cách a và độ dài tiêu cự f của thấu kính. Mô hình kính hiển vi chiều dài ống ống giới hạn sẽ cho độ phóng đại ảnh không đổi. Hình 1.6. Cấu hình tia truyền trong kính hiển vi hiệu chỉnh vô cùng Mô hình kính hiển vi hiệu chỉnh tia sáng vô cùng được thiết kế thêm thấu kính đặt sau vật kính nhằm tạo tia sáng song song. Ảnh trung gian thu được lúc này phụ thuộc vào vị trí đặt thấu kính phụ, khi thay đổi vị trí của thấu kính phụ ta sẽ lấy được các vị trí khác nhau của ảnh trung gian. Ảnh của vật quan sát ngoài phụ thuộc vào vật kính còn phụ thuộc vào khoảng cách từ ảnh trung gian tới thị kính, khi khoáng cách Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 11 từ ảnh trung gian tới tâm thị kính càng ngắn thì ảnh ảo quan sát được càng lớn nên kính hiển vi hiệu chỉnh vô cùng của cấu hình kính hiển vi này cho người dùng có thể điều chỉnh độ lớn của ảnh quan sát. Cấu hình kính hiển vi hiệu chỉnh tia sáng vô cùng thường được ứng dụng trong hệ kính hiển vi hiện đại. b) Kiểu chiếu sáng Kohler Cách chiếu sáng của kính hiển vi đặc biệt quan trọng trong việc hình thành chất lượng hình ảnh. Để nâng cao hiệu suất chiếu sáng, năm 1893 Kohler (làm việc tại tập đoàn Carl Zeiss) đã giới thiệu cấu hình chiếu sáng để tối ưu hóa nguồn sáng chiếu tới mẫu (Hình 1.5). Trong hình này, kính hiển vi được thiết kế với các diaphragma đặt trên đường đi của ánh sáng nguồn và ánh sáng đi qua vật kính. Bằng cách đóng mở các diaphragma này, người ta điều khiển được độ đóng mở của chùm sáng kích thích (diaphragma 1) cũng như trường nhìn của thị kính (diaphragma 4) để nâng cao chất lượng chiếu sáng mẫu cũng như chất lượng của ảnh thu được. Hệ kính hiển vi hiện đại được thiết kế gồm tập hợp thấu kính và thành phần quang học khác để điều khiển chùm tia sáng. Bộ dẫn chùm tia (condenser) trong kính sẽ điều khiển đóng mở góc tia sáng chiếu tới mẫu theo những góc phương vị khác nhau. Độ mở của bộ dẫn chùm tia kết hợp với độ mở của vật kính sẽ cho giá trị của khẩu độ số của cả hệ thống kính hiển vi. Khi bộ dẫn chùm tia mở thì khẩu độ số của kính hiển vi tăng lênnên dẫn đến hiệu suất phân giải ảnh sẽ cao hơn. Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 12 Hình 1.7. Sơ đồ của kiểu chiếu sáng Kohler 1.3.3.2.Khẩu độ số Khẩu độ số của vật kính là đại lượng đặc trưng cho khả năng thu thập ánh sáng và phân tích chi tiết mẫu. Khẩu độ số NA ảnh hưởng trực tiếp tới độ rõ nét của ảnh, Rayleigh đã đưa ra công thức phụ thuộc giữa giá trị này với khoảng cách giữa hai điểm gần nhất có thể quan sát được trên ảnh nhiễu xạ: d = 1.22 (/2NA) (2.4) Hình 1.8. Khẩu độ số của vật kính  là bước sóng ánh sáng tới Độ lớn của khẩu độ số NA được tính theo công thức sau: Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 13 NA= n.sin (2.5) Với n là chiết suất môi trường nằm giữa mẫu vật và vật kính  - là ½ góc của chùm sáng hình nón mà vật kính thu được Khẩu độ số phụ thuộc vào tiêu cự của kính vật, tiêu cự càng nhỏ thì góc  càng lớn, do đó khẩu độ số càng lớn. Nhưng  lớn nhất max=900, với môi trường là không khí thì giới hạn của NA trong trường hợp này sẽ là 1. Trong thực tế của NA thường là <0,95. Nếu tăng chiết suất n thì giá trị của NA sẽ tăng. Người ta chế tạo các kính vật “ngâm trong dầu” (“immersion oil”) với n=1,51 cho NA=1,4, hoặc kính vật “ngâm trong nước” với n=1,3 cho NA=1,2 để tăng độ phân giải của ảnh, vấn đề này được đề cập ở phần sau Hình 1.9. Khẩu độ số phụ thuộc tiêu cự của vật kính 1.4.2.3. Độ phóng đại Độ phóng đại là sự phóng ảnh của mẫu vật bằng hệ thống quang học của kính hiển vi. Độ phóng đại là bội của độ phóng đại của vật kính (M1) và thị kính (M2): M=M1 .M2 Độ phóng đại của kính hiển vi quang học thường là vài trăm lần. Tổng độ phân giải của vật kính và thị kính phụ thuộc vào khẩu độ số của cả hệ thống kính. Độ phóng đại nhỏ nhất cần thiết cho việc phân giải ảnh được tính xấp xỉ bằng 500 x NA, còn độ phóng đại tối đa bằng 1000 x NA, nếu độ phóng đại vượt quá giới hạn hữu ích này thì ảnh thu được không được mịn và khó thấy được rõ chi tiết cần quan sát. Bảng 2.1.Liệt kê sự kết hợp độ phóng đại và khẩu độ số của vật kính và thị kính cho độ phóng đại nằm khoảng giới hạn cho phép. Vật kính(NA) Thị kính NA 10x 12.5x 15x 20x 25x 2.5x(0.08) --- --- --- x x 4x(0.12) --- --- x x x Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 14 10x(0.35) x x x x x 25x(0.55) x x x x --- 40x(0.70) x x x --- --- 60x(0.95) x x x --- --- 100x(1.40) x x --- --- --- Bên cạnh đó, độ phóng đại còn phụ thuộc vào khoảng cách giữa mặt phẳng tiêu sau của vật kính và mặt phẳng ảnh trung gian hay còn gọi là chiều dài của của ống kính hiển vi (được xác định là khoảng cách từ mâm gắn vật kính đến điểm đầu của thị kính). Hầu hết tiêu chuẩn chiều dài ống của vật kính thường là 160, 170, 200, hoặc 210 millimet với 160 millimet là phổ biến nhất. 1.3.3.4.Độ phân giải Độ phân giải xác định cấu trúc nhỏ nhất quan sát được hay là khoảng cách tối thiểu giữa hai chi tiết có thể phân biệt được trên hình ảnh. Giới hạn cơ bản của độ phân giải (được Abbe lập ra vào năm 1873) phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng được sử dụng và khẩu độ số NA. Như đã nêu trong phần 2.2, khoảng cách tối thiểu giữa 2 điểm có thể phân biệt được là: NA d .61,0 = (- bước sóng ánh sử dụng) (2.6) Đối với kính vật có NA cao xấp xỉ hoặc lớn hơn 1, thì độ phân giải gần đúng là /2. Như vậy, trong thực tế, giới hạn độ phân giải của kính hiển vi quang học sẽ là 150nm (khi  350nm, NA  1,4). Khẩu độ số càng cao thì độ phân giải ảnh càng tốt vì lúc đó khoảng cách d càng nhỏ. Mặt khác, độ phân giải còn bị giới hạn bởi nhiễu xạ (diffraction limit). Khi một nguồn sáng điểm được hiện ảnh bằng một thấu kính thì ảnh nhận được là một đốm sáng mờ với các vân giao thoa hay là ảnh nhiễu xạ - ảnh này được gọi là quầng sáng Airy (Airy pattern). Đốm sáng trung tâm của ảnh nhiễu xạ được gọi là đĩa Airy. Giới hạn của độ phân giải được định nghĩa là khoảng cách d (tâm tới tâm) bằng bán kính của đĩa Airy (hình dưới). Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 15 Hình 1.10. Giới hạn phân giải a) Quầng sáng Airy, đĩa Airy là điểm sáng trung tâm b) d> rAiry c) d= rAiry Trong dải ánh sáng từ đỏ đến tím, kích thước của đĩa Airy giảm dần. Ánh sáng màu đỏ (tương đương với  = 700nm) có kích thước lớn nhất và ánh sáng màu tím ( = 400nm) có kích thước đĩa bé nhất. Kích thước của đĩa Airy phụ thuộc vào khẩu độ số, với giá trị khẩu độ số bé thì kích thước của đĩa Airy lớn (Hình a), và ngược lại (Hình b & Hình c). Hình 1.11Sự phụ thuộc của đĩa Airy vào khẩu độ số Do đó, với những loại vật kính có khẩu độ số khác nhau thì ở mỗi một giá trị phóng đại sẽ cho độ phân giải khác nhau. Bảng 2.2. Sự liên quan giữa độ phân giải với khẩu độ số và độ phóng đại Độ phóng đại Khẩu độ số (NA) d(µm) 4x 0.10 2.75 10x 0.25 1.10 20x 0.40 0.69 40x 0.65 0.42 60x 0.75 0.37 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 16 100x 1.25 0.22 1.3.4. Một số loại kính hiển vi quang học 1.3.4.1. Kính hiển vi tương phản pha (Phase Contrast Microscopy[9] a. Nguyên lý Với những vật trong suốt và sự khác biệt về chiết suất so với môi trường là không đáng kể thì rất khó phân biệt chúng với môi trường kể cả chụp ảnh hiển vi truyền qua. Kính hiển vi tương phản pha hiện ảnh của sự khác biệt pha của sóng ánh sáng đi qua môi trường và đi qua mẫu, vì vậy ta có thể quan sát được ảnh của mẫu vật. Hình 1.12.Cấu hình quang học của kính hiển vi tương phản pha Kính hiển vi tương phản pha là kỹ thuật tạo ảnh sử dụng sự khác biệt về pha để tạo nên sự biến đổi về cường độ ánh sáng trên thị kính hoặc phim chụp. b. Cấu tạo Ánh sáng từ nguồn (1) được phân cực rồi đi qua một tấm chắn sáng vành khuyên (2) để tạo góc chiếu tới mẫu (4) lớn (chiếu từ góc ngoài), do đó tạo độ dịch pha lớn. Phần ánh sáng không đi qua mẫu (dịch pha bằng 0) và đi qua mẫu đều được vật kính thu nhận và truyền qua một tấm bản pha (7) thường là tấm λ/2. Ánh sáng không đi qua mẫu sẽ được truyền qua tấm bản pha gần như 100%. Ánh sáng đi qua mẫu sẽ bị lệch pha so với ánh sáng không qua mẫu và mất đi một phần cường độ khi qua tấm bản pha. Tùy vào cấu trúc của mẫu mà độ lệch pha sẽ là lớn hay nhỏ và do đó phần cường độ mất mát khi đi qua tấm bản pha sẽ là nhiều hay ít. Các ánh sáng này sẽ tạo nên ảnh của vật trên mặt phẳng trung gian (8) với cường độ sáng tối khác Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 17 nhau tùy thuộc vào cấu trúc của vật và được đưa vào trường nhìn của thị kính (9) hoặc vào camera. Hình 1.13. Ảnh qua kính hiển vi trường sáng (trái) và tương phản pha (phải)[7 ] c. Ứng dụng Kính hiển vi tương phản xa ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu tế bào, vi khuẩn y sinh...hoặc ứng dụng khi nghiên cứu những mẫu vật không thể quan sát được bởi sự trong suốt của mẫu với môi trường. 1.3.4.2. Kính hiển vi huỳnh quang(Fluorescence microcope[10] a. Nguyên lý Ngoài loại kính hiển vi truyền qua thông thường, người ta chế ra loại kính hiển vi huỳnh quang cho phép quan sát ảnh phóng đại của vật thể nhờ ánh sáng tự phát quang của chúng hoặc nhờ bức xạ huỳnh quang thứ cấp do gắn vật thể được quan sát với các chất đánh dấu phát quang. Kính hiển vi quang thông thường sử dụng ánh sáng chiếu vào mẫu vật và tạo hình ảnh phóng to của vật đó. Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng ánh sáng với cường độ lớn hơn rất nhiều để chiếu vào mẫu vật. Ánh sáng này sẽ kích thích huỳnh quang mẫu vật có bước sóng dài hơn. Kính hiển vi huỳnh quang cũng tạo ra hình ảnh phóng to của vật, nhưng hình ảnh này được tạo trên cơ sở nguồn sáng thứ cấp - ánh sáng huỳnh quang. Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 18 b. Cấu tạo Hình 1.14. Đường đi ánh sáng kính thích và phát xạ qua kính lọc lập phương trong kính hiển vi huỳnh quang Trong kính hiển vi huỳnh quang, gương lưỡng chiết (dichroic mirror) được sử dụng để phân tách đường đi của ánh sáng kích thích và ánh sáng phát xạ. Gương lưỡng chiết có tính chất phản xạ đặc biệt cho phép phân tách đường đi của hai chùm ánh sáng. Mỗi gương lưỡng chiết có một giá trị bước sóng giới hạn, gọi là giá trị bước sóng chuyển pha, mà ở bước sóng đó 50% ánh sáng truyền qua. Gương sẽ phản xạ những ánh sáng có bước sóng nhỏ hơn giá trị bước sóng chuyển pha và truyền qua ánh sáng có bước sóng lớn hơn giá trị này. Chính vì tính chất này mà gương có tên gọi là lưỡng sắc hay 2 màu (dichroic, two color). Trong điều kiện lý tưởng, bước sóng chuyển pha của gương lưỡng sắc được chọn ở giữa bước sóng kích thích và phát xạ. Ánh sáng kích thích có bước sóng nhỏ hơn giá trị bước sóng chuyển pha nên sẽ phản xạ trên bề mặt gương lưỡng sắc và tới vật kính. Ánh sáng huỳnh quang có bước sóng lớn hơn giá trị bước sóng chuyển pha nên sẽ truyền qua gương lưỡng sắc và đi tới thị kính hoặc hệ thống đầu thu (hình 1.13). Trong kính hiển vi huỳnh quang có hai kính lọc (filter) được sử dụng cùng với gương lưỡng sắc là: kính lọc kích thích và phát xạ. Kính lọc kích thích (excitation filter): dùng để chọn lọc bước sóng kích thích, kính lọc kích thích được đặt trên đường đi của ánh sáng kích thích và trước gương lưỡng sắc . Kính lọc phát xạ: dùng để lọc ánh sáng phát xạ từ mẫu vật và loại bỏ dấu vết của ánh sáng kích thích, kính lọc phát xạ được đặt ở dưới gương lưỡng. Ở vị trí này, filter thực hiện cả hai chức năng là lọc ánh sáng phát xạ và loại bỏ bất kỳ dấu vết của ánh sáng sử dụng để kích thích. Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 19 Gương lưỡng sắc được gắn lên trên kính lọc lập phương (filter cube). Những kính lọc kích thích và phát xạ cũng thường được gắn với kính lọc lập phương . Kính lọc lập phương này tạo điều kiện thuận lợi cho sự thay đổi của gương lưỡng chiết trong sự định hướng với các kính lọc. Hình 1.15. Cấu tạo của kính hiển vi huỳnh quang[7] c. Ứng dụng Kính hiển vi huỳnh quang thường được sử dụng rộng rãi trong các thực hành và nghiên cứu y-sinh bởi sự đa dạng của các chất đánh dấu phát quang và do đó là sự đa dạng của các tính năng của chúng. Kính hiển vi huỳnh quang còn có ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc vật liệu, có thể cho ta thấy ảnh rõ nét của những cấu trúc siêu nhỏ. Hình 1.16.Ảnh tế bào qua kính hiển vi huỳnh quang Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 20 1.3.4.3. Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần (total internal reflection microcope - TIRM ) a. Nguyên lý Hình 1.16.1.Nguyên lý phản xạ nội toàn phần Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần sử dụng sóng biến dần ( evanescent wave ) (được tạo ra do phản xạ nội toàn phần của ánh sáng ở hai môi trường có chiết suất khác nhau) để kích thích các phân tử nằm gần bề mặt phân cách giữa hai môi trường. b) Cấu tạo Hình 1.16.1. Cấu hình của kính hiển vi phản xạ nội toàn phần Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần có vật kính được chế tạo đặc biệt với khẩu độ số lớn và độ phóng đại cao để dẫn chùm tia kích thích (cấu hình epi) và thu ánh sáng phát ra từ mẫu (hình 4.7.2.1 phải) khẩu độ số của vật kính dùng cho TIRFM Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 21 thường phải là ≥ 1,4 (ngâm trong dầu). Ngoài ra TIRFM còn có cấu hình sử dụng một lăng kính đặt trên mẫu để tạo phản xạ toàn phần . Ánh sáng biến dần sẽ kích thích các phân tử bề mặt phân cách phát quang, kính vật đặt dưới mẫu sẽ thu ánh sáng huỳnh quang. Kính hiển vi TIRFM tạo ảnh có độ phân giải < 200 nm do khẩu độ số của vật kính > 1.4 và độ sâu của trường biến dần < 200nm. Hình 1.16. 2. Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần c. Ứng dụng Kính hiển vi phản xạ nội toàn phần ứng dụng rộng rãi trong y sinh để nghiên cứu cấu tạo bề mặt của tế bào, nghiên cứu cấu trúc bề mặt của vật liệu cứng. Hình 1.17. Hình ảnh bề mặt tế bào dưới kính hiển vi phản xạ nội toàn phần Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 22 CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu động học của các hạt đơn phân tử P- glycoprotein (PGP) trong tế bào MDCKII. Do đó, trong phần thực nghiệm này, chúng tôi sẽ trình bày các vấn đề liên quan đến việc chuẩn bị mẫu, như: nuôi cấy tế bào ung thư MDCKII, tổng hợp các protein trong màng tế bào, đo đạc và quan sát các phân tử protein trong màng tế bào,Các thông số động học mà chúng tôi quan tâm đó là: hệ số khuếch tán dịch chuyển, quãng đường dịch chuyển và vận tốc dịch chuyển của các phân tử P-glycoprotein. 2.1. Chuẩn bị mẫu Hình 2.1. Ảnh chụp một số đĩa thủy tinh dung để nuôi cấy tế bào Trong phần này sẽ trình bày quá trình chuẩn bị mẫu để quan sát dưới kính hiển vi quang học ở các chế độ khác nhau. Các mẫu được chuẩn bị từ việc lựa chọn dòng dòng tế bào, nuôi cái tế bào,..Trong đề tài này, các tế bào được nghiên cứu từ dòng Madin Darby Canine Kidney (MDCK II)[11]. Dòng này có nguồn gốc từ tế bào ung thư thận của chó Cocker Spaniel và được phát hiện vào năm 1958 bởi S. H. Madin và N.B. Dòng này thường được sử dụng như một mô hình của các tế bào biểu mô. Chúng được nuôi trong đĩa petri (petri dish) có đáy là thủy tinh (hình 2.1). 2.1.1. Nuôi cấy tế bào P-glycoprotein Để nuôi cấy được tế bào in vitro phát triển bình thường thì môi trường nuôi dưỡng là rất quan trọng. Trong thí nghiệm của tôi, hợp chất nuôi dưỡng tế bào gồm: Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 23 89% minimum essential media (MEM), 1% pentrep, 10% serum de veau foetal (SVF), và cuối cùng them geneticien nồng độ 3mg/ml. Trong các hợp chất này, SVF đóng vai trò rất quan trọng. Nó là nhân tố kích thích quá trình tăng trưởng và tăng sinh tế bào, kích thích tố, protein, các yếu tố gắn kết.Cũng giống như fibronectine, nó còn góp phần tế bào bám dính tốt, điều này cần thiết cho sự phân chia tế bào và đóng vai trò bảo vệ. Tất cả thao tác thí nghiệm đều trong điều kiện vô trùng. Các tế bào tăng trưởng trong lò ấp ở 37° C và được bổ sung 5% khí CO2 trong quá trình tăng trưởng. 2.1.2. Tổng hợp P-glycoprotein trong màng tế bào Để quan sát được các P-glycoprotein, cách tốt nhất là cần đánh dấu chúng với phân tử protein phát quang xanh lá (green fluorescent protein-GFP). Dưới kính hiển vi huỳnh quang dễ dàng quan sát và hiện ảnh được các phân tử PGP nhờ sự phát huỳnh quang của GFP. Chính vì lý do đó, chúng tôi cần tổng hợp các protein này. Số lượng tế bào được tính toán cẩn thận trong một thể tích đĩa nuôi cấy. Sau làm thử nghiệm và hiệu chỉnh tối ưu, trong 1ml chứa 5000 tế bào/cm2 được chọn để làm thí nghiệm tổng hợp. Để tổng hợp protein trong màng tế bào, sodium butyrate (BS- Na(C3H7COO)) được bổ sung. Đó là muối natri của axit butyric. Nó có tác dụng khác nhau đối với tế bào động vật có vú trong nuôi cấy, bao gồm sự ức chế sinh sôi nảy nở, cảm ứng sự khác biệt và cảm ứng hoặc ức chế biểu hiện gen. Để có chất lượng tốt trong tổng hợp protein cần tối ưu hóa lượng BS được sử dụng.Trong thí nghiệm này, tôi đã khảo sát hai thông số quan trọng là thời gian kích thích(thời gian tính từ lúc thêm BS vào tế bào đến khi quan sát chúng dưới kính hiển vi) và nồng độ BS. Các nồng độ BS được thêm vào lượng tế bào trên lần lượt là 0.1 mM, 0.5 mM, 1mM và 2 mM tương ứng với các thời gian kích thích lần lượt cho từng nồng độ 1h, 12h, 18h, và 23h40 (bảng 2.1). Sau các khoảng thời gian. Các đĩa tế bào sau khi được tổng hợp với các thời gian trên đều được quan sát dưới kính hiển vi tương phản pha và kính hiển vi huỳnh quang để kiểm tra hình thái màng và sự phát huỳnh quang của nó. Tuy nhiên, để có thể quan sát tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang thì môi trường tế bào được thay bằng môi trường không phát quang. Đây là môi trường gồm 94%DMEMgfp-2 (20mg/l), 6% SVF và 0,5 ml (10mM) hepes trong điều kiện vô trùng. Bảng 2.1: Thời gian kích thích và nồng độ BS dung trong tổng hợp protein Thời gian 1h 12h 18h 23h40 Nồng độ 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 0,1; 0,5; 1,0; 2,0 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 24 BS (mM) Các kết quả về hiện ảnh dưới kính hiển vi tương phản pha, kính hiển vi huỳnh quang và cường độ phát quang của tế bào sẽ được thảo luận chi tiết trong chương 3. 2.2. Cấu hình quang học kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần max arcsin lamkinh NA n    =     (2.1) Đốivới 1,45NA = và 1,58lamkinhn = ta tìmđược ma 72,78 o x = Hình 2.2. Cấu hình quang học của kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần[10]. Một gương M di động và thấu kính L1 cho phép hội tụ laser kích thích tại mặt phẳng tiêu điểm củavật kính (BFP-back focal plane) để tạo ra chùm sáng song song đi vào vật kính chiếu đến mẫu với góc chiếu θ. Bằng cách điều chỉnh góc quay α của gương M sẽ thay đổi được góc θ phù hợp đến giá trị tới hạn mà cho hiện tượng phản xạ nội toàn phần ở mặt phân cách thủy tinh/nước. 2.3. Phương pháp theo dõi đơn phân tử P-glycoprotein trong tế bào MDCKII Để quan sát rõ thấy sự chuyển động của các PGP trong màng tế bào MDCK II, kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần là ứng viên sáng giá nhất. Bằng cách Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 25 quan sát dưới kính hiển vi này, các video được ghi lại, tiếp đến là sử dụng phương pháp theo dõi đơn phân tử để theo dõi và xác định vị trí các phân tử đơn nhất[12- 13].Từ đó dùng phần mềm mở ImageJ và matlab để xử lý số liệu đo đạc và tính toán các thông số động học. 2.3.1. Cách tiến cận Cách tiếp cận được dựa trên chuyển động dịch chuyển Brownian như đã trình bày trong chương 1. Các phân tử PGP được coi như những vật rắn nhỏ chuyển động trong môi trường phức hợp (hệ số nhớt η(T)) của màng tế bào. Các phân tử protein này có dạng hình cầu nên chúng ta quan tâm đến chuyển động dịch chuyển ngẫu nhiên là chủ yếu. Theo lý thuyết, bình phương trung bình dịch chuyển trong không gian 2 chiều được xác định từ công thức (1.14) ở chương 1 〈𝑟2(𝑡)〉 = 4𝐷𝜏 (2.1) Trong thực nghiệm, chúng ta dễ dàng đo được giá trị 〈𝑟2(𝑡)〉 theo 〈𝑟2(𝑡)〉 = 〈𝑥2(𝑡)〉 + 〈𝑦2(𝑡)〉 (2.2) ở nhiệt độ phòng nhờ vào thuật toán miễn phí của nhóm MOSAIC[12]. Trong đó vàlà bình phương trung bình dịch chuyển theo phương x và phương y theo thời gian. 2.3.2. Quy trình theo dõi một phân tử trong chất lỏng Theo dõi một phân tử duy nhất là một công nghệ theo dõi sự chuyển động của từng phân tử phát quang dựa trên một hệ ghi ảnh nhanh. Chúng ta lưu lại các quỹ đạo của từng hạt đã được đánh dấu, điều này cho phép nhận được tín hiệu/nhiễu rất tốt và do đó xác định được vị trí của hạt cần theo dõi. Đây là một phương pháp rất mới đang được phát triển để hiện ảnh các quỹ đạo từng phân tử huỳnh quang riêng lẻ có kích thước rất bé (do đó khuếch tán rất nhanh) hoặc là hiện ảnh quỹ đạo các phân tử có nồng độ lớn [14]. Công nghệ này được đánh giá rất cao trong lĩnh vực nghiên cứu động học các phân tử protein trong màng tế bào sinh học. Như đã trình bày trong phần trên, kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần là ứng viên sáng giá nhất cho hiển ảnh protein trong màng tế bào với tín hiệu/nhiễu cao. Để thuận lợi, chúng tôi ghi một video gồm 100 ảnh nhờ một camera rất nhanh và nhạy EM-CCD. Khoảng thời gian giữa 2 ảnh là 0,05s. Quy trình của công nghệ theo dõi đơn phân tử thông thường bao gồm 4 bước (hình 2.2): Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 26 Hình 2.3.Sơ đồ minh họa quy trình theo dõi đơn phân tử a) Ghi các video chuyển động của các PGP dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần b) Xác định vị trí của các protein c) Theo dõi sự di chuyển của protein d) Phân tích số liệu Dưới đây sẽ trình bày chi tiết từng bước của phương pháp theo dõi đơn phân tử 2.3.2.1. Ghi một video dưới kính hiển huỳnh quang phản xạ nội toàn phần (TIRFM) Hình 2.4.Video gồm 100 ảnh của 1 tế bào MDCKII dưới kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần. Các PGP là các đốm sáng trong ảnh Như phần trên đã trình bày, để quan sát các PGP thì chính là quan sát các phân tử GFP đã được liên kết với PGP. Chúng ta biết rằng, các phân tử GFP cho tín hiệu nhấp nháy và bị dập tắt huỳnh quang rất nhanh (trong vài giây).. do đó trong các phép thí nghiệm tôi đã làm với các thời gian thu (acquisition time) của camera 0,01s; 0,03s và 0,05s.