Luận văn Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - PCR

MỤC LỤC

Trang tựa . ii

Cảm tạ . iii

Tóm tắt . iv

Danh sách các chữ viết tắt . vi

Mục lục . vii

Danh sách các bảng . xi

Danh sách các đồ thị . xi

Danh sách các hình . xii

Danh sách các sơ đồ . xii

Phần I. Mở Đầu . 1

1.1 Đặt vấn đề . 1

1.2 Mục Đích - Yêu cầu . 1

1.2.1 Mục đích nghiên cứu . 1

1.2.2 Yêu cầu . 1

Phần II. Tổng Quan Tài Liệu . 2

2.1 Giới thiệu về cây ớt . 2

2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt . 2

2.1.2 Nguồn gốc cây ớt . 2

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt . 2

2.1.3.1 Thân . 2

2.1.3.2 Rễ . 2

2.1.3.3 Lá . 2

2.1.3.4 Hoa . 3

2.1.3.5 Quả . 3

2.1.3.6 Hạt . 3

2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt . 3

2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt . 4

2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác . 4

2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt . 9

viii

2.3.1 Nhiệt độ. 9

2.3.2 Ánh sáng . 9

2.3.3 Ẩm độ . 9

2.3.4 Đất và dinh dƣỡng . 9

2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) . 10

2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV . 10

2.4.2 Cấu trúc TSWV . 10

2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh . 13

2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV . 14

2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt . 14

2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học . 15

2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển . 16

2.10 Khống chế bệnh TSWV . 16

2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV . 18

2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị . 18

2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận . 18

2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống . 18

2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử. 19

2.12 ELISA . 19

2.12.1 Khái niệm về ELISA . 19

2.12.2 Phân loại ELISA . 20

2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) . 20

2.12.2.2 ELISA gián tiếp . 21

2.12.2.3 Sandwich ELISA . 21

2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh . 22

2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA . 23

2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA . 23

2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR . 23

2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR . 23

2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR . 25

2.13.3 Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR . 30

2.13.4 Các vấn đề thƣờng gặp trong phản ứng PCR và hƣớng giải quyết . 31

ix

2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thƣớc dài hơn . 31

2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thƣớc ngắn hơn . 32

2.13.4.3 Không thu đƣợc bất kỳ sản phẩm nào. 32

2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu . 33

2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau . 33

2.14 Phƣơng pháp RT-PCR . 33

2.14.1 Phân loại RT – PCR . 33

2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc . 33

2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc . 34

2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA . 34

2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV . 35

2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam . 35

2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới . 35

Phần III. Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu . 36

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 36

3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu . 36

3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu . 36

3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV . 37

3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA . 37

3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA . 37

3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện . 37

3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR . 39

3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad . 39

3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di . 40

3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR . 40

3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR . 41

3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di . 43

Phần IV. Kết quả Thảo luận . 45

4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA . 45

4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra . 45

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt . 46

4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng . 47

x

4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi . 50

4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR . 51

4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA . 51

4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer . 52

4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR. 53

4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR . 54

Phần V. Kết luận và đề nghị . 60

5.1 Kết luận. 60

5.2 Đề nghị . 60

Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 61

PHẦN VII. PHỤ LỤC . 64

pdf85 trang | Chia sẻ: lethao | Lượt xem: 2889 | Lượt tải: 6download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - PCR, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể Quý Thầy Cô trong Bộ môn đã tận tình dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này. TS. Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài này. KS. Phạm Đức Toàn đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này. Các anh, chị đang công tác tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Cô Lê Thị Thu Hà công tác tại trạm Bảo vệ Thực vật huyện Củ Chi đã giúp tôi trong quá trình tìm hiểu tình hình canh tác nông nghiệp trong huyện. Các cô, chú bác nông dân đã tận tình giúp đỡ trong quá trình điều tra thu thập mẫu. Cùng các bạn bè chung lớp đã giúp đỡ tôi. Thành kính ghi ơn Ông bà đã dạy bảo cho con thành người có ích. Cha mẹ đã sinh con, nuôi dạy cho con ăn học để con đạt được kết quả như ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đình Trường iv TÓM TẮT NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG RT – PCR”. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN Đề tài đƣợc tiến hành tại các xã trong huyện Củ Chi, Trảng Bàng, Châu Thành  Điều tra mức độ nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt, tại các xã trong huyện  Tiến hành lấy mẫu bệnh TSWV tại vùng điều tra và chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA và RT – PCR tại Trung tâm phân tích Thí Nghiệm, Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Nội dung thực hiện:  Điều tra, đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV ngoài đồng bằng sự đánh giá về hình thái.  Lấy mẫu, tiến hành chẩn đoán bằng phƣơng pháp ELISA và RT - PCR, từ đó rút ra kết luận về triệu chứng điển hình của TSWV trên cây ớt. Kết quả đạt đƣợc:  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra - Nhuận Đức: 12,1% - Phƣớc Thạnh: 12,5% - Lộc Hƣng: 0%  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng - Lá khảm vàng xanh, cong, héo rũ: 37,5% - Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn: 57% - Lá khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ:53% v - Khảm vàng nhạt trên lá và cả rìa lá: 25%  Tỷ lệ nhiễm trên trái - Trái nhiễm: 33% - Không nhiễm: 67% vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus dDAS-ELISA: direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay RT-PCR: Reverse Transciptase-Polymerase Chain Reaction Genome L: Genome long Genome M: Genome medium Genome S: Genome short N: Nucleocapside cRNA: Complementary RNA vRNA: Virion RNA Tm: Melting temperature Ta: Annealing temperature GSP: Gen Special Primer cDNA: Complementary DNA p-NPP: p-Nitrophenyl phosphate RNAbc: RNA binding column PVP: Polyvinylpyrolydol vii MỤC LỤC Trang Trang tựa .......................................................................................................................... ii Cảm tạ ............................................................................................................................ iii Tóm tắt ............................................................................................................................ iv Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi Mục lục .......................................................................................................................... vii Danh sách các bảng ........................................................................................................ xi Danh sách các đồ thị ....................................................................................................... xi Danh sách các hình ........................................................................................................ xii Danh sách các sơ đồ ...................................................................................................... xii Phần I. Mở Đầu .............................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2 Mục Đích - Yêu cầu .................................................................................................. 1 1.2.1 Mục đích nghiên cứu ........................................................................................... 1 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................................ 1 Phần II. Tổng Quan Tài Liệu ....................................................................................... 2 2.1 Giới thiệu về cây ớt ................................................................................................... 2 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt ................................................................................................. 2 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt ................................................................................................. 2 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt ........................................................................ 2 2.1.3.1 Thân ............................................................................................................... 2 2.1.3.2 Rễ ................................................................................................................... 2 2.1.3.3 Lá ................................................................................................................... 2 2.1.3.4 Hoa ................................................................................................................. 3 2.1.3.5 Quả ................................................................................................................. 3 2.1.3.6 Hạt .................................................................................................................. 3 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt .................................................................................. 3 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt ..................................................................................... 4 2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác .................................................... 4 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt .................................................................. 9 viii 2.3.1 Nhiệt độ................................................................................................................ 9 2.3.2 Ánh sáng .............................................................................................................. 9 2.3.3 Ẩm độ .................................................................................................................. 9 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng ............................................................................................... 9 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) ............................................... 10 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV ................................................................................. 10 2.4.2 Cấu trúc TSWV ................................................................................................. 10 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh .............................................................................. 13 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV ................................... 14 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt ................................................................................. 14 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học ......................................................................... 15 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển ................................................................................. 16 2.10 Khống chế bệnh TSWV ......................................................................................... 16 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV ......................................................................................... 18 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị .................................................................................. 18 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận .................................................................................... 18 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống ................................................................................... 18 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.......................................... 19 2.12 ELISA .................................................................................................................... 19 2.12.1 Khái niệm về ELISA ....................................................................................... 19 2.12.2 Phân loại ELISA .............................................................................................. 20 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) ................................................................ 20 2.12.2.2 ELISA gián tiếp ......................................................................................... 21 2.12.2.3 Sandwich ELISA ....................................................................................... 21 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh ...................................................................... 22 2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA ............................... 23 2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA ...................................................... 23 2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR .................................................................................... 23 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR .......................................................................... 23 2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR .................................................. 25 2.13.3 Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR .................................................................. 30 2.13.4 Các vấn đề thƣờng gặp trong phản ứng PCR và hƣớng giải quyết ................. 31 ix 2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thƣớc dài hơn .................. 31 2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thƣớc ngắn hơn ................... 32 2.13.4.3 Không thu đƣợc bất kỳ sản phẩm nào........................................................ 32 2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu ...................................................................................... 33 2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau ....................................................... 33 2.14 Phƣơng pháp RT-PCR ........................................................................................... 33 2.14.1 Phân loại RT – PCR ......................................................................................... 33 2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc .................................................................. 33 2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc .................................................................... 34 2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA ................ 34 2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV .... 35 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam ...................................................................... 35 2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 35 Phần III. Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu .................................................... 36 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 36 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu ............................................................................ 36 3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................................. 36 3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV ....................................................................... 37 3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA ....................................................................... 37 3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA ................. 37 3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện ...................................................................................... 37 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR ................................................................... 39 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad ................................... 39 3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di .............................................. 40 3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR .......................................................... 40 3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR ......................................................................... 41 3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di ............................................................ 43 Phần IV. Kết quả Thảo luận ....................................................................................... 45 4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA ... 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra ................................................. 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt ............................................................. 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng ........................................................ 47 x 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi ............................................................... 50 4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR ................................................................................... 51 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA ....................................................................................... 51 4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer ..................................................................................... 52 4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR.............................................................................. 53 4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR ........................................... 54 Phần V. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 60 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 60 5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 60 Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 61 PHẦN VII. PHỤ LỤC ................................................................................................. 64 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh ............................................................ 4 Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV ............................................... 13 Bảng 3.1: Các địa bàn đƣợc lấy mẫu ớt ......................................................................... 36 Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng .... 45 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng ............................................................. 49 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.45 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng ......................................................................... 49 Đồ thị 4.3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên trái ớt ................................................................... 50 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV .................................................................................... 11 Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV ................................................... 12 Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV ......................................................... 14 Hình 2.4: Ớt bị nhiễm TSWV ........................................................................................ 15 Hình 2.5: Các loài bọ trĩ ................................................................................................ 16 Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR ............................................................................ 24 Hình 2.7: Tiến trình thực hiện RT – PCR một bƣớc ..................................................... 33 Hình 2.8: Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bƣớc ...................................... 34 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA ........................................................................ 39 Hình 4.1: Ớt Ba tri bị nhiễm TSWV.............................................................................. 46 Hình 4.2: Ớt hiểm Bungari bị nhiễm TSWV ................................................................. 46 Hình 4.3: Ớt có triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong .................................................. 47 Hình 4.4: Ớt có triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn ............. 47 Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ .......................................... 48 Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ .................................... 48 Hình 4.7: Kết quả điện di RNA ..................................................................................... 51 Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dƣơng ..................................................................... 53 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp ........................................... 20 Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp ........................................... 21 Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp .......................................... 21 Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp .......................... 22 Sơ đồ 2.5: Tổng hợp cDNA ........................................................................................... 34 1 Phần I Mở Đầu 1.1 Đặt vấn đề Cây ớt (Capsicum annum L.) là cây trồng quan trọng thứ hai (sau cây cà chua) trong các loại cây vừa nhƣ một loại rau, vừa nhƣ một loại gia vị. Ngoài ra trong quả ớt chứa nhiều vitamin nhƣ: A, B, C, D, Caroten và một số chất khoáng khác. Trồng ớt mang lại hiệu quả kinh tế cao gấp 3-4 lần so với cây lúa nên những năm gần đây, ở nƣớc ta cây ớt đƣợc trồng với diện tích và sản lƣợng ngày càng tăng, đáp ứng nhu cầu trong nƣớc và xuất khẩu. Ớt là mặt hàng xuất khẩu đứng vị trí số 1 trong các loại gia vị. (Trích dẫn luận văn tốt nghiệp Nguyễn Hữu Trúc) Ngoại thành TP.Hồ Chí Minh có điều kiện tự nhiên và xã hội thuận lợi cho việc phát triển nhiều chủng loại rau, trong đó cây ớt luôn đƣợc chú trọng và đƣợc trồng với diện tích ngày càng tăng. Tuy nhiên, việc phát triển ớt chuyên canh lại là điều kiện cho nhiều loại mầm bệnh gây hại phát triển mạnh, trong đó bệnh gây ra bởi virus mà gây hại mạnh nhất là virút gây bệnh đốm héo rũ trên cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV) gây khó khăn cho những vùng chuyên sản xuất ớt hiện nay, ảnh hƣởng đến kinh tế rất lớn. Chính vì lý do đó mà đề tài “Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - PCR” đƣợc thực hiện nhằm xác định sớm mầm bệnh, từ đó có biện pháp ngăn chặn kịp thời và giảm bớt mức thiệt hại do mầm bệnh này gây ra. 1.2 Mục Đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu Thực tập, ứng dụng và bƣớc đầu xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán bệnh TSWV trên đối tƣợng cây ớt ở mức độ phân tử, từ đó có thể đánh giá đƣợc hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt tại các địa bàn điều tra. 1.2.2 Yêu cầu + Phải đi thực tế tại các địa bàn để điều tra, lấy mẫu ớt. + Nắm vững lý thuyết về hai phƣơng pháp dDAS-ELISA cũng nhƣ RT – PCR, rồi từ đó mới tiến hành các phƣơng pháp chẩn đoán. 2 Phần II Tổng Quan Tài Liệu 2.1 Giới thiệu về cây ớt 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt Cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae), có khoảng 30 loài nhƣng chỉ có 5 loài đƣợc trồng là: C.pendulum, C. pubescens, C. annum, C. frutescens, và C. chinensis, trong đó hai loài C. pendulum và C. pubescens đƣợc trồng hạn chế ở Trung và Nam Mỹ, loài C. chinensis đƣợc trồng ở khu vực Amazon và Châu Phi, hai loài C. annum và C. frutescens đƣợc trồng khắp nơi trên thế giới. 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt Theo các nhà nghiên cứu phân loại thực vật học thì cây ớt có nguồn gốc từ Mehico và nguồn gốc thứ hai là ở Guatemala. Theo Vavilop, nguồn gốc thứ hai không phải ở Guatemala mà ở Evraz. Hiện nay ớt đƣợc trồng phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới và á nhiệt đới. 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt 2.1.3.1 Thân Ớt là cây bụi, hai lá mầm, thân thƣờng mọc thẳng, đôi khi có thể gặp các dạng có thân bò, nhiều cành, chiều cao trung bình từ 0,5-1,5m, có thể là cây hàng năm hoặc lâu năm nhƣng thƣờng đƣợc gieo trồng nhƣ cây hàng năm. 2.1.3.2 Rễ Ớt có rễ cọc phát triển mạnh với nhiều rễ phụ. Tuy nhiên do việc cấy chuyển, rễ cọc thƣờng bị đứt và cho một hệ rễ chùm phát triển, vì vậy nhiều ngƣời lầm tƣởng ớt có hệ rễ chùm. 2.1.3.3 Lá Thƣờng ớt có lá đơn mọc xoắn trên thân chính. Lá có nhiều dạng khác nhau, nhƣng thƣờng gặp nhất là loại lá mác, mép lá ít răng cƣa. Lông trên lá tùy thuộc vào các loại khác nhau, một số có mùi thơm, lá thƣờng mỏng có kích thƣớc trung bình 1,5- 12cm×0,5-7,5cm. 3 2.1.3.4 Hoa Các hoa hoàn thiện và quả thƣờng đƣợc sinh đơn độc trên từng nách lá. Hoa có thể mọc thẳng đứng hoặc buông thòng. Trên cuống hoa thƣờng không có li tầng, hoa thƣờng có màu trắng, một số giống có màu sữa, xanh lam, màu tím. Hoa có 5-7 cánh hoa, cuống dài khoảng 1,5cm, đài ngắn có dạng chuông, nhụy có màu trắng hoặc tím, đầu nhụy có dạng hình đầu, hoa có 5-7 nhị đực với ống phấn màu xanh da trời hoặc tía. 2.1.3.5 Quả Thuộc loại quả mọng có nhiều hạt và chia làm nhiều ngăn. Các giống khác nhau có kích thƣớc quả, hình dạng, màu sắc, độ cay và độ mềm của thịt quả rất khác nhau. Quả chƣa chín có thể có màu xanh hoặc tím, quả chín có màu đỏ, da cam, vàng, màu kem hoặc hơi tím. 2.1.3.6 Hạt Hạt ớt nhỏ dẹp có dạng thận, màu vàng rơm, hạt có chiều dài khoảng 3-5mm, 1gram ớt cay khoảng 220 hạt. (Lƣơng Nguyễn Thu Tâm, 1996-2001) 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt Ớt đƣợc trồng khắp nơi để làm gia vị và làm thuốc, ớt có loại ngọt và loại cay. Ở Việt Nam, phổ biến nhất là loại ớt cay. Quả ớt có vị cay, tính nóng, có tác dụng tiêu đờm, ổn trung, tán hàn, giải biểu, kiện vị, tiêu thực gây sung huyết, kích thích chung, thông kinh lạc, giảm đau, sát trùng. Rễ ớt có tác dụng làm hoạt huyết, tán thũng. Lá ớt có vị đắng, tính mát có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu. Công dụng: ớt ngọt đƣợc dùng làm rau ăn, ớt cay làm gia vị và là vị thuốc. Quả ớt trị tỳ vị hƣ lạnh, tiêu chảy, hắc loạn, nôn mửa, dạ dày ruột đầy trƣớng, mất trƣơng lực, tích trệ, ăn không tiêu, đau nhức nửa đầu, đau lƣng, đau khớp, thống phong, đau dây thần kinh, viêm thanh quản, viêm họng. (Theo SK&ĐS, 2005) 4 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh (trong 100g phần ăn đƣợc) Thành phần chủ yếu của vỏ quả là chất cay, không màu, kết tinh, có tên gọi là Capsaicin (C18H27NO3), hàm lƣợng của nó phụ thuộc vào giống. Quả còn chứa một loại dầu có màu đỏ, không cay, năng suất chiết xuất 20-25% dịch chiết alkaloid. Quả ớt xanh chứa nhiều rutin là một chất

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfNghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - PCR.pdf