Luận văn Nghiên cứu hóa thực vật cây Vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr Fabaceae

ẫu lá (EL): Chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan, điclometan và etyl axetat. Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 , cất loại dung môi dưới áp suất giảm và thu được các phần chiết tương ứng EL1 (hiệu suất 2% so với lượng nguyên liệu khô), EL2 (hiệu suất 0,57% so với lượng nguyên liệu khô) và EL3 (hiệu suất 0,25% so với lượng nguyên liệu khô). Mẫu vỏ thân (EB): Chiết lần lượt bằng 2 dung môi là n-hexan và etyl axetat. Các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm và thu được các phần chiết tương ứng EB1 (hiệu suất 1,3% so với lượng nguyên liệu khô) và EB2 (hiệu suất 2% so với lượng nguyên liệu khô) Mẫu gỗ (EW): Chiết bằng dung môi etyl axetat. Dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm và thu được phần chiết tương ứng EOC (hiệu suất 1,3% so với lượng nguyên liệu khô). Hiệu suất thu nhận các phần chiết từ 3 mẫu lá (EL), vỏ thân (EB) và gỗ (EW) được nêu trong Bảng 10, Mục 4.3, Chương 4. Quy trình chiết được tóm tắt ở Sơ đồ 1. Dịch nước Chiết với n-hexan Chiết với điclometan Chiết với etyl axetat Dịch chiết điclometan Dịch chiết Etyl axetat Dịch chiết n-hexan Phần chiết điclometan Phần chiết etyl axetat Phần chiết n-hexan 1. Làm khô bằng Na2SO4 2. Cất loại kiệt dung môi Phần chiết MeOH – trong nước Hòa nước cất 1. Ngâm chiết với MeOH (3 lần, 3 ngày/lần) 2. Lọc bỏ bã 3. Cất loại kiệt MeOH Nguyên liệu Phần chiết MeOH Sơ đồ 1: Quy trình chiết các hợp chất từ cây Vông nem PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC) Phân tích TLC các phần chiết được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck). Quá trình phân tích sắc ký được thực hiện với các hệ dung môi với độ phân cực khác nhau nhằm mục đích tìm hệ cho sự phân giải tốt nhất. Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được sấy khô, hiện màu với thuốc hiện 1% vanilin/ H2SO4 đặc , hơ nóng ở 120oC và đánh dấu các vệt chất màu xuất hiện trên bản mỏng. Phân tích phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi như n-hexan-axeton và n-hexan-EtOAc với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy các hệ n-hexan-axeton 10:1, 6:1 và 3:1 (v/v) cho sự phân giải tốt đối với phần chiết n-hexan. Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (EL1) Hệ dung môi n-hexan-axeton Rf Dạng vệt Hiện màu 10 : 1 0,97 tròn hồng 0,92 tròn tím 0,39 tròn nâu 0,37 tròn tím 0,26 tròn nâu 0,17 tròn hồng 0,13 tròn nâu 0,1 tròn nâu 6 : 1 0,92 tròn hồng 0,82 tròn tím 0,5 tròn nâu 0,42 tròn tím 0,36 tròn nâu 0,26 tròn hồng 0,21 tròn nâu 0,16 tròn nâu 3 : 1 0,95 tròn hồng 0,6 tròn tím 0,54 tròn nâu 0,5 tròn tím 0,42 tròn nâu 0,37 tròn hồng 0,3 tròn nâu Kết luận: Như vậy, phần chiết n-hexan có nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thể hiện ở Rf phân tán. Các tỷ lệ dung môi n-hexan-axeton (10:1, 6:1, 3:1) có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải tốt. Phân tích phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi như điclometan-EtOAc, điclometan-axeton, n-hexan-axeton và n-hexan-EtOAc với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy các hệ n-hexan-axeton với 20:1, 10:1 và 6:1 (v/v) cho khả năng tách tốt đối với phần chiết điclometan. Kết quả phân tích TLC được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2: Phân tích TLC phần chiết điclometan (EL2) Hệ dung môi n-hexan-axeton Rf Dạng vệt Hiện màu 20 : 1 0,66 Tròn hồng 0,17 Tròn nâu 0,13 Tròn hồng 0,11 Tròn nâu 10 : 1 0,71 Tròn hồng 0,26 Tròn nâu 0,17 Tròn hồng 0,13 Tròn nâu 6 : 1 0,76 Tròn hồng 0,36 Tròn nâu 0,26 Tròn hồng 0,21 Tròn nâu Kết luận: Như vậy, phần chiết điclometan có nhiều chất với độ phân cực liền nhau, thể hiện ở Rf rất phân tán. Tuy vậy, tỷ lệ dung môi n-hexan-axeton với tỷ lệ 6:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt. Phân tích phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy hệ 3 dung môi n-hexan-etyl axetat-axit fomic với tỷ lệ 20:20:1 (v/v/v) cho khả năng phân giải tốt đối với phần chiết etyl axetat. Kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 3. Bảng 3: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (EL3) STT Rf Dạng vệt Hiện màu 1 0,86 tròn Xanh 2 0,56 tròn Tím 3 0,45 tròn Xanh Kết luận: Như vậy, trong phần chiết etyl axetat có chứa ít chất với độ phân cực khác nhau, thể hiện ở Rf rất phân tán. Hệ dung môi n-hexan-etyl axetat-axit formic với tỷ lệ 20:20:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt. Phân tích TLC phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy hệ điclometan-etyl axetat 49:1, 19:1 và 10:1 (v/v) cho khả năng phân giải tốt nhất đối với phần chiết n-hexan. Kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 4. Bảng 4: Phân tích TLC phần chiết n-hexan (EB1) Hệ dung môi điclometan-etyl axetat Rf Dạng vệt Hiện màu 49 : 1 0,94 tròn Hồng 0,90 tròn Tím 0,84 tròn Nâu 0,78 tròn Tím 0,63 tròn tím 0,42 tròn tím 0,19 tròn vàng 0,1 tròn tím đậm 19: 1 0,96 tròn Hồng 0,90 tròn tím 0,77 tròn tím 0,65 tròn tím 0,52 tròn vàng 0,51 tròn Hồng 0,26 tròn xanh 0,2 tròn tím đậm 10 : 1 0,97 tròn Hồng 0,90 tròn tím 0,77 tròn tím 0,70 tròn tím 0,61 tròn vàng 0,55 tròn Hồng 0,32 tròn xanh 0,26 tròn tím đậm Kết luận: Như vậy, phần chiết n-hexan có rất nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thể hiện ở Rf phân tán. Các tỷ lệ dung môi điclometan - etyl axetat với tỷ lệ khác nhau 49:1, 19:1 và 10:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt. Phân tích phần chiết etyl axetat vỏ thân cây Vông nem (EB2) Tiến hành khảo sát TLC so sánh phần chiết etyl axetat vỏ thân cây Vông nem (EB2) song song với phần chiết n-hexan từ vỏ thân (EB1) cho các kết quả định tính tương tự. Phần chiết etyl axetat (EB2) do đó đã không được tiếp tục phân tách sắc ký cột. Kết quả cụ thể được trình bày trong Bảng 5. Bảng 5: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat (EB2) Hệ dung môi n-hexan-axeton Rf Dạng vệt Hiện màu 49 : 1 0,94 tròn hồng 0,90 tròn tím 0,84 tròn nâu 0,78 tròn tím 0,63 tròn tím 0,42 tròn tím 0,19 tròn vàng 0,1 tròn tím đậm 19: 1 0,96 tròn hồng 0,90 tròn tím 0,77 tròn tím 0,65 tròn tím 0,52 tròn vàng 0,51 tròn hồng 0,26 tròn xanh 0,2 tròn tím đậm 10 : 1 0,97 tròn hồng 0,90 tròn tím 0,77 tròn tím 0,70 tròn tím 0,61 tròn vàng 0,55 tròn hồng 0,32 tròn xanh 0,26 tròn tím đậm Kết luận: Kết quả này cho thấy, trong vỏ thân Vông nem có chứa một hàm lượng lớn các chất chính. Các chất này xuất hiện trong cả hai phần chiết. Chúng tôi đi đến quyết định tập trung phân tách các chất từ phần chiết EB1. Phân tích phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) Sau khi sử dụng một số hệ dung môi với các tỷ lệ khác nhau chúng tôi nhận thấy hệ điclometan-etyl axetat 19:1 (v/v) cho khả năng phân giải tốt đối với phần chiết etyl axetat. Kết quả cụ thể được trình bày trong các Bảng 6. Bảng 6: Phân tích TLC phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) STT Rf Dạng vệt Hiện màu 1 0,94 Tròn hồng 2 0,84 Tròn tím 3 0,69 Tròn tím 4 0,62 Tròn tím 5 0,56 Tròn vàng 6 0,4 Tròn xanh 7 0,37 Tròn tím 8 0,2 Tròn tím đậm Kết luận: Như vậy, phần chiết n-hexan có rất nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thể hiện ở Rf phân tán. Các tỷ lệ dung môi điclometan-etyl axetat với tỷ lệ khác nhau 49:1, 19:1 và 10:1 có thể được sử dụng để triển khai sắc ký cột bởi sự phân giải khá tốt. PHÂN TÁCH CÁC PHẦN CHIẾT TỪ CÂY VÔNG NEM Phân tách phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) Các kết quả phân tích TLC phần chiết n-hexan cho hệ dung môi phân giải tốt nhất trên chất hấp phụ silica gel là n-hexan-axeton. Các hệ dung môi n-hexan-axeton với các tỷ lệ 95:5, 10:1, 6:1 và 3:1 đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải gradient cho sắc ký cột (CC). Phân tách sắc ký gradient (CC) phần chiết n-hexan trên chất hấp phụ silica gel cho 8 nhóm phân đoạn từ EL1.1 đến EL1.8. Nhóm phân đoạn EL1.4 được rửa bằng n-hexan cho 1-octacosanol (M). Nhóm phân đoạn EL1.5 được rửa bằng n-hexan cho chất β-sitosterol (C). EL1 (15 g) EL1.1 - EL1.3 1-7 (0,5 g) M (15 mg) EL1.4 7-9 (3,2 g) EL1.5 10-13 (0,7 g) rửa bằng n-hexan rửa bằng n-hexan C (0,3 g) EL1.6 -EL1.8 14-30 (1,9 g) Dội cột (2 g) CC, gradient, silica gel n-hexan; n-hexan-axeton 95:5, 10:1, 6:1 và 3:1; MeOH Quá trình phân tách phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) được trình bày trong Sơ đồ 2. Sơ đồ 2 : Phân tách phần chiết n-hexan lá cây Vông nem (EL1) Phân tách phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) Các kết quả phân tích TLC phần chiết điclometan cho hệ dung môi phân giải tốt nhất trên chất hấp phụ silica gel là n-hexan-axeton. Các hệ dung môi n-hexan-axeton với các tỷ lệ 20:1, 10:1 và 6:1 đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải gradient cho sắc ký cột (CC). Từ phần chiết điclometan (EL2) đã phân lập được apigenin A dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Quá trình phân tách phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) được trình bày trong Sơ đồ 3. EL2 (11 g) EL2.1 -EL2.3 1-11 (1,8 g) EL2.4 -EL2.8 12-19 (0,9 g) EL2.9 -EL2.10 20-27 (0,8 g) EL2.11 28-31 (0,5 g) EL2.12 -EL2.13 32-34 (0,2 g) CC, gradient, silica gel n-hexan; n-hexan-axeton 20:1, 10:1, 6:1; MeOH EL2.11.1 1-9 (0,1 g) EL2.11.2 10-17 (0,07 g) EL2.11.4 24-34 (0,1 g) EL2.11.3 18-23 (0,05 g) CC, silica gel n-hexan-etyl axetat 4:1 A (20 mg) Kết tinh lại Sơ đồ 3 : Phân tách phần chiết điclometan lá cây Vông nem (EL2) Phân tách phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) Từ phần chiết etyl axetat (EL3) một chất bột màu vàng trong EtOAc đã được kết tinh. Chất này được rửa với các dung môi n-hexan và điclometan thu được chất R tinh khiết (vitexin). Các kết quả phân tích TLC phần chiết etyl axetat cho hệ dung môi phân giải tốt nhất trên chất hấp phụ silica gel là n-hexan-etyl axetat-axit formic với tỷ lệ 20:20:1. Hệ dung môi n-hexan-etyl axetat-axit formic với tỷ lệ 20:20:1 đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột (CC). Phân tách sắc ký gradient (CC) phần chiết etyl axetat trên chất hấp phụ silica gel cho 4 nhóm phân đoạn từ EL3.1 đến EL3.4. Do hàm lượng chất trong các nhóm phân đoạn này rất thấp nên việc phân lập các chất trong phần chiết này không được tiếp tục thực hiện. Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) được trình bày trong Sơ đồ 4. EL3 (5 g) EL3.1 1-4 (<0,1 g) EL3.2 5-7 (< 0,1 g) EL3.3 8-11 (< 0,1 g) EL3.4 12-18 (< 0,1 g) CC, silica gel n-hexan–etyl axetat–axit formic 20:20:1 EL3 (4,8 g) R (0,2 g) Dội cột (2 g) rửa n-hexan, điclometan Sơ đồ 4: Phân tách phần chiết etyl axetat lá cây Vông nem (EL3) Phân tách phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) Từ dịch chiết n-hexan (EB1) kết tủa được một chất bột màu trắng. Bột này được rửa với các dung môi n-hexan và điclometan thu được S là hỗn hợp phức tạp của các tecpen glycosid (phổ 1H-NMR). Các kết quả phân tích TLC với các hệ dung môi khác nhau cho thấy phần chiết n-hexan (EB1) được phân tách tốt trên chất hấp phụ silica gel bằng các hệ dung môi điclometan-EtOAc với các tỷ lệ lần lượt là 49:1, 20:1 và 10:1. Các hệ dung môi này đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải gradient cho sắc ký cột (CC). Phân tách sắc ký phần chiết n-hexan trên chất hấp phụ silica gel cho 8 nhóm phân đoạn từ EB1.1 đến EB1.8. Nhóm phân đoạn EB1.3 được phân tách bằng sắc ký cột thường với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 9:1 cho 1-octacosanol (M), chất này đã nhận được từ phần chiết n-hexan của lá cây Vông nem (EL1) (phân tích TLC và co-TLC). Nhóm phân đoạn EB1.4 và EB1.5 được rửa bằng n-hexan cho chất C (β-sitosterol, phân tích TLC và co-TLC). Các nhóm phân đoạn EB1.6 được phân tách hai lần bằng sắc ký cột thường với các hệ dung môi n-hexan-EtOAc 6:1 cho 5 nhóm phân đoạn EB1.6.1 - EB1.6.5 và n-hexan-EtOAc (8:1) để phân tách nhóm phân đoạn EB1.6.2 cho các chất scandenon (T) và 6,8-điprenylgenistein (X). Nhóm phân đoạn EB1.8 được rửa bằng n-hexan cho soyasapogenol (H). Quá trình phân tách phần chiết n-hexan gỗ cây Vông nem (EB1) được trình bày trong Sơ đồ 5. EB1 (14 g) EB1.1 -EB1.2 1-2 (15 mg) EB1.3 3-4 (1 g) EB1.4 -EB1.5 5-7 (0,8 g) EB1.7 11-20 (0,5 g) EB1.8 20-25 (0,5 g) CC, gradient, silica gel điclometan, điclometan-EtOAc 49:1, 20:1, 10:1; EtOAc C (0,1 g) EB1.6 8-10 (1,5 g) rửa bằng n-hexan M (15 mg) CC, silica gel n-hexan-EtOAc 6:1 EB1.6.2 1-6 (0,01 g) EB1.6.2 7-17 (0,15 g) EB1.6.2 19-23 (0,03 g) T (130 mg) X (20 mg) H (0,1 g) rửa bằng n-hexan EB1.6.1 1-25 (0,1 g) EB1.6.2 26-42 (0,3 g) EB1.6.3-5 43-65 (0,6 g) CC, silica gel n-hexan-EtOAc 8:1 rửa bằng n-hexan rửa bằng n-hexan, kết tinh lại trong điclometan CC, silica gel n-hexan-EtOAc 9:1 EB1.3.6 21-32 (0,05 g) EB1.3.1-5 1-20 (0,2 g) EB1.3.7-9 33-65 (0,3 g) rửa bằng n-hexan, kết tinh lại trong điclometan Sơ đồ 5: Phân tách phần chiết n-hexan vỏ thân cây Vông nem (EB1) Phân tách phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) Các kết quả phân tích TLC với các hệ dung môi khác nhau cho thấy phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) được phân tách tốt trên chất hấp phụ silica gel bằng các hệ dung môi điclometan -EtOAc với các tỷ lệ lần lượt là 49:1, 20:1 và 10:1. Các hệ dung môi này đã được chọn làm hệ dung môi rửa giải gradient cho sắc ký cột (CC). Phân tách sắc ký phần chiết n-hexan trên chất hấp phụ silica gel cho 5 nhóm phân đoạn từ 5 nhóm phân đoạn từ EW1.1 đến EW1.5. Nhóm phân đoạn EW1.2 được phân rửa bằng n-hexan cho 1-octacosanol (M) nhận được từ phần chiết n-hexan của lá cây Vông nem. Nhóm phân đoạn EW1.3 được rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (C). Nhóm phân đoạn EW1.4 được rửa bằng n-hexan cho soyasapogenol (H). EW1 (4 g) EW1.1 1 (0,3 g) EW1.2 2-3 (0,45 g) EW1.3 4-5 (0,1 g) EW1.5 10-11 (0,1 g) Dội cột (0,8 g) CC, gradient, silica gel điclometan; điclometan-EtOAc 49:1, 20:1, 10:1; EtOAc C (50 mg) EW1.4 6-9 (0,5 g) H (40 mg) rửa bằng n-hexan M (10 mg) rửa bằng n-hexan rửa bằng n-hexan Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) được trình bày trong Sơ đồ 6. Sơ đồ 6: Phân tách phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP Từ các phần chiết lá cây Vông nem các hợp chất 1-octacosanol (M) và β-sitosterol (C) (EL1), apigenin (A) (EL2) và vitexin (R) (EL3) đã được phân lập. Từ các phần chiết vỏ thân cây Vông nem (EB1) các hợp chất 1-octacosanol (M), β-sitosterol (C), soyasapogenol B (H), scandenon (T) và 6,8-điprenylgenistein (X) đã được phân lập. Từ phần chiết etyl axetat gỗ cây Vông nem (EW1) các hợp chất 1-octacosanol (M), β-sitosterol (C) và soyasapogenol B (H) đã được phân lập. 1-Octacosanol (M) Hợp chất M được phân lập bằng sắc ký cột dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,57 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 5:1). Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất (M) cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton ở δH 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz) của một nhóm metyl liên kết với một nhóm metylen, tín hiệu dải rộng của các nhóm metylen của một mạch ankyl ở δH 1,18-1,36 và một nhóm –CH2-CH2-OH liên kết với mạch ankyl [δH 1,55 (1H, quintet, J = 7,0 Hz, H2-2) và 3,63 (2H, dt, J = 5,5 Hz, 6,5 Hz, H2-1)]. Chiều dài của mạch ankyl đã được xác định là 25 nhóm metylen dựa trên tỷ lệ các đường cong tích phân trên phổ 1H-NMR. Trên cơ sở phổ 1H-NMR, chất M đã được xác định là 1-octacosanol (CH3-(CH2)26-CH2-OH). 1-Octacosanol là thành phần của sáp lá thực vật như của Triticum aestirum (Gramineae) và Beta vulgaris (Chenopodiaceae). Apigenin (A) Hợp chất A được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, Rf = 0,88 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 10:1). A Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của chất A cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton của một vòng benzen thế 1,4 [δH 6,92 (2H, d, J = 9,0 Hz) và 7,91 (2H, d, J = 9,0 Hz)], các proton ở vị trí meta so với nhau của một vòng benzen thế 4 lần [δH 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 6,47 (1H, d, J = 2,0 Hz)]. Các dữ kiện phổ này cùng với sự xuất hiện của một tín hiệu singlet ở δH 12,95 của một nhóm hiđroxi liên kết hiđro, có thể là với một nhóm cacbonyl ở C-4 đã cho giả thiết về một cấu trúc flavonoit cho chất A. Sự xuất hiện của tín hiệu proton đặc trưng ở H-3 của một flavon [δH 6,76 (s)] đã xác định A là apigenin (4',5,7-trihiđroxiflavon) [6]. Apigenin là một tác nhân kháng khuẩn, chống viêm và chất ức chế nhiều enzyme. Apigenin cũng là aglycon của nhiều hợp chất glycosid từ thực vật. β-Sitosterol (C) Hợp chất C được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 135-136oC, Rf = 0,3 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 10:1). C Hợp chất này được nhận dạng là β-sitosterol trên cơ sở so sánh TLC và co-TLC với chất chuẩn β-sitosterol. Vitexin (R) Hợp chất R được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt. Hợp chất R đã được xác định là một flavon C-glucosid dựa trên các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của hợp chất R cho các tín hiệu proton của 2 doublet tương tác octo với nhau [δH 6,89 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz)]; các tín hiệu này được gán tương ứng cho các vị trí H-3'/H-5' và H-2'/H-6' của vòng B, một singlet của H-3 [δH 6,77 (1H, s)], một singlet của một proton duy nhất của vòng A [δH 6,28 (1H, s)] và các tín hiệu ở trường thấp của nhóm 5-OH tạo liên kết hiđro với nhóm cacbonyl ở C-4 và một proton anomeric của một gốc đường [δH 4,69 (1H, d, J = 10,0 Hz)]. So sánh các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 của chất R với của apigenin đã xác định được chất R là một apigenin C-glucosid [29]. Các sự thay đổi độ chuyển dịch hóa học quan sát được chủ yếu ở C-7 (∆δC -1,6), C-8 (∆δC +10,0) và C-9 (∆δC -1,4). Gốc đường đã được xác định là một nhóm glucopyranosyl dựa trên các phổ 13C-NMR và DEPT [δC 61,3 (t), 70,5 (d), 70,8 (d), 73,4 (d), 78,6 (d) và 81,8 (d)]. Các giá trị δC đã hoàn toàn xác định khả năng liên kết của nhóm glucopyranosyl vào C-8 của vòng A của apigenin [6], gây ra sự chuyển dịch δC ở các vị trí C-7, C-8 và C-9. Trên cơ sở các dữ kiện phổ hợp chất R đã được xác định là apigenin 8-C-β-D-glucopyranosid (vitexin) [5]. Cấu hình β của proton anomeric đã được xác định từ hằng số J = 10,0 Hz. Phổ ESI-MS của chất R cho pic ion ở m/z 433,67 ([M + H]+) phù hợp với khối lượng phân tử của vitexin (C21H20O10). R Soyasapogenol B (H) Hợp chất H được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 257-258oC, Rf = 0,16 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 4:1). H Trên phổ 1H-NMR (CDCl3 và CD3OD) xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng từ proton của 7 nhóm metyl bậc ba (7s) [δH 0,85; 0,91; 0,92; 0,95; 1,03; 1,11 và 1,23], 2 nhóm oximetin [δH 3,39 và 3,41 (mỗi tín hiệu 1H, dd)], một nhóm hiđroximetylen dưới dạng 2 doublet AB [δH 3,32 và 4,19 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 11,0 Hz)] và một nối đôi thế ba lần [δH 5,3 (1H, t, J = 3,5 Hz)]. Phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3 và CD3OD) của H cũng khẳng định các dữ kiện phổ 1H-NMR về 7 nhóm metyl bậc ba (7q) [δC 16,0; 16,8; 19,6; 22,3; 24,9; 28,2 và 32,2], 2 nhóm oximetin [δC 76,2 (d) và 80,3 (d)], một nhóm hiđroximetylen [δC 64,3 (t)] và một nối đôi thế ba lần [δC 122,3 (d) và 143,7 (s)]. Các tín hiệu cộng hưởng từ cacbon 13 còn lại trong số 30 tín hiệu được quan sát là 9 nhóm metylen (9t) [δC 18,3; 23,6; 25,7; 27,2; 28,4; 33,1; 38,3; 42,0 và 46,0], 3 nhóm metin (3d) [δC 44,9, 47,7 và 55,8] và 6 cacbon bậc 4 (6s) [δC 30,3; 36,6; 37,3; 39,5; 41,1 và 42,3]. Các dữ kiện phổ NMR đã giả thuyết cho một cấu trúc tritecpenoit olean-12-en của chất H. Sau đó, sự so sánh các giá trị độ chuyển dịch hóa học δH và δC của chất H với của mẫu chuẩn β-amyrin đã khẳng định cho cấu trúc này. Hơn nữa, một nhóm oximetin [δH 3,39 (1H, dd, J = 12 Hz, 4,5 Hz); δC 80,3 (d)] đã được xác định ở C-3 phù hợp với sự đóng vòng tritecpenoit đi từ oxidosqualen. Hóa lập thể của nhóm 3-OH đã được xác định là β (equatorial) dựa trên hằng số tương tác Jax-ax = 12,0 Hz và δC 80,3. Nhóm hiđroximetin đã được xác định ở C-24 trên cơ sở so sánh các dữ kiện phổ 13C-NMR của H với các cấu trúc olean-12-en tương tự ở vòng A [27]. Việc xác định nhóm oximetin còn lại [δH 3,41 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 3,5 Hz); δC 76,2 (d)] dựa trên sự so sánh các độ chuyển dịch hóa học δC ở các vòng D/E và nhóm 28-CH3. Trong trường hợp nhóm hiđroxi được liên kết vào vị trí C-16 các giá trị δC tương ứng là khoảng 65,9 (C-16), 36,8 (C-17), 30,5 (C-22) và 21,3 (C-28) [9]. Các giá trị δC nhận được rõ ràng là được xác định cho nhóm hiđroximetin ở C-22, cụ thể là δC 76,2 (C-22), 37,3 (C-17), 28,4 (C-16) và 28,2 (C-28). Hóa lập thể của nhóm 22-OH đã được xác định là β (equatorial) dựa trên độ chuyển dịch hóa học δC 76,2 và các hằng số tương tác của H-22 (δH 3,41; J = 8,0 Hz, 3,5 Hz) (xem Hình 4). Hình 4: Hóa lập thể của nhóm 22-OH Các dữ kiện phổ NMR của H hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của soyasapogenol B [13]. Cuối cùng, các phổ 2 chiều (2D-NMR) bao gồm 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã được đo để khẳng định lại cấu trúc của hợp chất này. Trên phổ 1H-1H COSY với sự tham khảo phổ HSQC, các tương tác H-3 ↔ H2-1 ↔ H2-2, H5 ↔H2-6↔ H2-7, H-9 ↔ H2-11 ↔ H2-12, H2-15 ↔ H2-16, H2-18 ↔ H2-19 và H2-21↔ H2-22 đã được thiết lập. Vị trí của nhóm 3-OH cũng được xác định qua các tương tác HMBC giữa H-3 (δH 3,39) với C-3 (δC 80,3), giữa H3-23 (δH 1,23) và H2-24 (δH 3,32 và 4,19) với C-3. Vị trí của nhóm hiđroxi thứ hai đã được khẳng định nhờ phổ HMBC ở C-22 qua các tương tác quan trọng giữa H-22 (δH 3,41) và C-20 (δC 30,3), giữa H-30 (δH 0,85) và C-22 (δC 76,2) và giữa H-22 và C-28 (δC 28,2). Các tương tác 1H-1H COSY và HMBC quan trọng được biểu diễn trên Hình 5. Hình 5: Các tương tác 1H-1H COSY () và HMBC (→) quan trọng của chất H Phổ ESI-MS của chất H cho pic ion ở m/z 459,09 ([M + H]+) phù hợp với khối lượng phân tử của soyasapogenol B (C30H50O3). Scandenon (T) Hợp chất T được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng lục, đ.n.c. 162-164oC, Rf = 0,44 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton 5:1). T Phổ 1H-NMR (CDCl3), 13C-NMR và DEPT của chất T cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton và cacbon 13 của một dẫn xuất isoflavon của genistein khi được so sánh với phổ 1H-NMR của 6,8-điprenylgenistein (X). Các tín hiệu này bao gồm H-2/C-2 của khung isoflavon [δH 7,88 (1H, s); δC 152,7 (d)], nhóm 5-OH liên kết hiđro nội phân tử [δH 13,0 (1H, s)] với nhóm cacbonyl ở C-4 [δC 181,5 (s)] và vòng B thế 1,4 [δH 6,81(2H, d, J = 8,5 Hz) và 7,33 (2H, d, J = 8,5 Hz)]. Isoflavon này có thể được dẫn xuất từ 6,8-điprenylgenistein (X) với một nhóm prenyl đã được đóng vòng loại hiđro và được liên kết với vòng A của isoflavon ở C-6/C-7 hoặc C-7/C-8 [δH 1,47 (6H, s), 5,62 (1H, d, J = 10,0 Hz) và 6,73 (1H, d, J = 10,0 Hz); δC 28,2 (q), 77,8 (s), 122,9 (s) và 128,1 (d)]; nhóm isoprenyl còn lại xuất hiện ở δH 1,68 (s), 1,81 (s), 3,39 (2H, d, J = 7,5 Hz) và 5,18 (1H, t, J = 7,5 Hz). Vị trí của vòng pyran ở C-7/C-8 hoặc C-6/C-7 có thể được phân biệt dựa trên độ chuyển dịch hoá học cacbon 13 của nhóm metin olefinic (C-1") của hệ vòng pyran. Giá trị δC 115,9 (d) của C-1" của chất T đã xác định chất này là một 7,8-pyranoisoflavon (scandenon); trong trường hợp một 6,7-pyranoisoflavon (osajin) giá trị này là ở khoảng δC 121,3. Trên cơ sở các dữ kiện phổ NMR, cấu trúc của chất T đã được xác định là scandenon [15]. Phổ ESI-MS của chất T cho pic ion ở m/z 405,23 ([M + H]+) khẳng định cho công thức phân tử của scandenon (C25H24O5). 6,8-Điprenylgenistein (X) Hợp chất X được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,37 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-axeton, 5:1). X Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất X cho các tín hiệu cộng hưởng từ proton của các cặp proton đối xứng ở vị trí octo, một vòng benzen thế hai lần 1,4 [δH 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz)] và 2 nhóm γ,γ-đimetylallyl (isoprenyl) bao gồm các proton của hai nhóm isoprenyl metylen ở δH 3,47 (4H, brt, J = 6,0 Hz), hai proton của hai nối đ