Luận văn Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo - TS. Vi Thị Đoan Chính - người đã định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS. Trịnh Ngọc Hoàng, CN. Đỗ Thị Tuyến cùng toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài này. Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, cùng toàn thể các bạn lớp Công nghệ sinh K6 đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này. Thái Nguyên, ngày 23 tháng 8 năm 2011 Sinh viên Lương Thị Hương Giang MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn 3 1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 5 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 6 1.2. Đại cương về chất kháng sinh 7 1.2.1. Chất kháng sinh (Antibiotic) 7 1.2.2. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh 8 1.2.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 10 1.2.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 10 1.3. Ứng dụng của chất kháng sinh 12 1.3.1. Ứng dụng trong y học 12 1.3.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y 13 1.4. Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật 15 1.4.1. Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme 15 1.4.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzyme cao từ tự nhiên 17 1.4.3. Một số enzyme phổ biến có nguồn gốc từ vi sinh vật 17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Vật liệu nghiên cứu 19 2.2. Đối tượng nghiên cứu 19 2.2.1. Xạ khuẩn 19 2.2.2. Vi sinh vật kiểm định 19 2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 20 2.3.1. Hóa chất 20 2.3.2. Dụng cụ và thiết bị 20 2.3.3. Môi trường nghiên cứu 20 2.4. Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu đất 21 2.4.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 21 2.4.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 21 2.4.2.2. Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch 22 2.4.3. Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống 23 2.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 23 2.4.5. Phương pháp lên men xạ khuẩn 24 2.4.6. Xác định hoạt tính enzyme của xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch 24 2.4.7. Phương pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme 25 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu 25 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn 26 3.1.1. Phân bố của xạ khuẩn ở trong đất 26 3.1.2. Phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 27 3.2. Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn phân lập 29 3.2.1. Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn phân bố theo nhóm màu 29 3.2.2. Phổ kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập 30 3.2.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKS cao 32 3.3. Tuyển chọn xạ khuẩn có hoạt tính enzyme 37 3.3.1. Hoạt tính enzyme của xạ khuẩn 37 3.3.2. Khả năng chịu nhiệt của enzyme 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………….43 PHỤ LỤC……………………………………………………………………48 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt  Chú thích   CFU  Colony Forming Unit   CKS  Chất kháng sinh   G (+)  Gram dương   G (-)  Gram âm   HSKS  Hệ sợi khí sinh   HT  Hoạt tính   HTKS  Hoạt tính kháng sinh   KS  Kháng sinh   VK  Vi khuẩn   VSV  Vi sinh vật   VSVKĐ  Vi sinh vật kiểm định   XK  Xạ khuẩn   DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng  Tên bảng  Trang   1.1  Kháng sinh được phát hiện qua các năm  9   2.1  Các chủng VSV kiểm định  19   3.1  Sự phân bố của xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau  26   3.2  Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu  27   3.3  HTKS của xạ khuẩn theo nhóm màu  29   3.4  Khả năng ức chế các nhóm VSV kiểm định  30   3.5  Phổ kháng sinh của các chủng XK đã phân lập  32   3.6  HTKS của 5 chủng XK lựa chọn trên môi trường thạch  33   3.7  HTKS của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn  34   3.8  HT kháng nấm gây bệnh trên chè của 3 chủng XK lựa chọn  36   3.9  Hoạt tính enzyme của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn  37   3.10  Hoạt tính enzyme của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn  38   3.11  Khả năng bền nhiệt của dịch enzyme chủng HT12.7  39   DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình  Tên hình  Trang   1.1  Khuẩn lạc xạ khuẩn  5   1.2  Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng Streptomy ces cinereoruber subp  6   3.1  Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu  28   3.2  Một số chủng xạ khuẩn đã thuần khiết  28   3.3  Tỷ lệ các chủng XK có HTKS phân theo nhóm màu  30   3.4  Tỷ lệ XK có HT với các nhóm VSV kiểm định  31   3.5  Khả năng đối kháng của các chủng XK với các VSV kiểm định  32   3.6  HTKS của 5 chủng XK lựa chọn  33   3.7  Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn lựa chọn  35   3.8  HT kháng nấm gây bệnh chè của 3 chủng xạ khuẩn  36   3.9  HT enzyme của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn  38   3.10  Khả năng chịu nhiệt của Cellulase  40   3.11  Khả năng chịu nhiệt của Amylase  40   3.12  Khả năng chịu nhiệt của Protease  41   3.13  Vòng phân giải cơ chất của enzyme sau khi đã xử lí với nhiệt độ trong thời gian 20 phút  41   TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tên đề tài Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên. Đối tượng 70 chủng xạ khuẩn được phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên được dùng để tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học. Mục tiêu Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế. Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào. Kết quả chính Khảo sát sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất thu tại khu vực núi Pháo, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên là khu vực đã và đang chịu ảnh hưởng của hoạt động khai thác khoáng sản nhiều năm. Phân lập và thuần khiết được 70 chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau: đất trồng chè, đất trồng keo, đất trồng màu, đất trồng lúa, đất vườn, đất đồi trọc. Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn với các vi sinh vật kiểm định bao gồm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm mốc, đặc biệt có sử dụng các chủng nấm gây bệnh trên cây chè là loại cây trồng chủ đạo ở tỉnh Thái Nguyên. Tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao có hoạt phổ rộng, có khả năng kháng được các vi sinh vật kiểm định thuộc các nhóm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm mốc và nấm gây bệnh trên chè. Các chủng xạ khuẩn này được ký hiệu: HT17.8, HT19.1 và HT 12.2. Đây là các chủng có nhiều khả năng ứng dụng trong thực tiễn. Kiểm tra hoạt tính enzyme: amylase, protease và cellulase của các chủng xạ khuẩn và đã tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính enzyme cao được ký hiệu là: HT12.7 và HT10.6. Đồng thời đã nghiên cứu được khả năng chịu nhiệt của các enzyme. MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Từ xa xưa, các bệnh nhiễm khuẩn đã là một trong những nỗi kinh hoàng đối với con người. Chính điều đó đã thôi thúc các nhà khoa học trên thế giới phải tìm ra được một chất có khả năng phòng chống và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1928, A. Fleming phát hiện ra penicillin - CKS có nguồn gốc từ nấm Penicillium nhưng phải hơn 10 năm sau, năm 1941, penicillin mới chính thức được sử dụng trong y học và đã cứu sống được bệnh nhân nhiễm trùng máu đầu tiên, cũng từ đó kỷ nguyên CKS bắt đầu. Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế kỷ XX. Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm cho hiện tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển và ngày càng lan rộng. Việc sử dụng một số chất đặc hiệu để chữa trị một số loại bệnh đã không còn mang lại hiệu quả như mong muốn. Số lượng các vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày càng gia tăng. Chính vì vậy, việc tìm kiếm ra những CKS mới luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Cho đến nay, con người đã phát hiện khoảng 17.000 CKS có nguồn gốc VSV, hơn 3.000 CKS bán tổng hợp và mỗi năm vẫn có khoảng vài trăm CKS mới được phát hiện. Trong số các VSV sinh CKS thì xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, chiếm 80% các chất kháng sinh được mô tả, trong đó chủ yếu thuộc chi Streptomyces [11], [19]. Hiện nay, có hai xu hướng nghiên cứu để điều chỉnh sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn là tuyển chọn tạo ra các chủng xạ khuẩn công nghiệp có khả năng siêu tổng hợp chất kháng sinh và tối ưu hóa các thành phần môi trường, thiết bị và điều kiện lên men. Tuy các loại chất kháng sinh rất phổ biến trên thị trường nhưng công nghệ sản xuất chất kháng sinh lại chủ yếu tập trung vào một số nước, một số tập đoàn dược phẩm của Mỹ, Anh, Đức, Hà Lan… và được bảo hộ chặt chẽ dưới dạng các sáng chế độc quyền, lưu giữ trong từng cơ sở sản xuất công nghiệp và được xem như những bí mật thương mại [24]. Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp nên có khu hệ VSV khá phong phú, trong số đó có không ít loài xạ khuẩn sinh chất kháng sinh. Mặt khác, Thái Nguyên lại nằm trong vùng sinh khoáng, có nhiều loại hình khoáng sản phân bố tập trung. Điển hình là khu vực núi Pháo thuộc xã Hà Thượng - huyện Đại Từ, là nơi đã và đang diễn ra các hoạt động khai thác khoáng sản mạnh mẽ.Trong đó chủ yếu là khai thác quặng vonfram. Các hoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trường đất, nước và qua đó, rất có thể sẽ ảnh hưởng đến sự phân bố của hệ VSV. Trên thực tế đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động khai khoáng tới sự phát triển và đa dạng của các hệ động, thực vật nhưng lại chưa có nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động này tới sự phân bố và các hoạt tính sinh học đến hệ VSV đất. Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất thu tại khu vực núi Pháo, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên là khu vực đã và đang chịu ảnh hưởng của các hoạt động khai thác khoáng sản nhiều năm. - Nghiên cứu hoạt tính sinh học của xạ khuẩn để từ đó có thể tuyển chọn ra một số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế, đặc biệt là trong công tác bảo vệ thực vật và môi trường. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và thuần khiết xạ khuẩn từ các mẫu đất. - Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng đã phân lập được với các VSV kiểm định để tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính kháng sinh cao. - Kiểm tra khả năng sinh enzyme ngoại bào để chọn ra các chủng có hoạt tính enzyme cao. - Xác định khả năng chịu nhiệt của dịch enzyme. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn 1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ (Prokaryota) [34]. Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài, trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp vào nhóm XK hiếm [12], [42]. Streptomyces đặc biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng các enzyme ngoại bào. Một phần rất lớn các chất kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces, trong đó được biết đến nhất là streptomycin, erythromycin, tetracyclin [40]. Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn – actinomycete – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và ban đầu xạ khuẩn được coi là vi nấm vì chúng sinh trưởng giống với nấm. Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hệ sợi cơ chất) [27]. Đây là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn. Xạ khuẩn là VK G(+) có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA. Đa số xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nước và xác thực vật. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàn tự nhiên. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acid trong đất [42]. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignhin bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các peoxidase ngoại bào [33]. Các chủng xạ khuẩn xuất hiện trong môi trường giàu chất hữu cơ như các compost, ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu nhiệt (thermophilic) [39], và ở cống rãnh nước thải nơi mà các xạ khuẩn chứa mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn định, đặc trưng [37]. Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30ºC và pH trung tính là điều kiện tối ưu cho xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài đã được phân lập ở các môi trường khắc nghiệt ví dụ như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh được phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [28] và Nocardiopis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH 9,5 - 10 [30]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn * Khuẩn lạc Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 - 1 µm đến 2 - 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [11], [13]. Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Đây là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn thay đổi từ 5 - 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thường. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và tùy vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính của mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.

Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn [43] Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ… có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra môi trường. * Khuẩn ty Trên môi trường cơ chất đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào trong môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất - substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản. Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng [8]. 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đây là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn. Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30 - 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [10]. Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 - 400Aº chia làm 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH… Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [14].
Hình 1.2. Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng Streptomyces cinereoruber subp [6] 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự VK G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 nm có cấu tạo tương tự thành tế bào của VK G(+), thành phần chủ yếu là peptidoglucan tạo nên một lớp vách tế bào tương đối vững chắc. Phân tích dưới kính hiển vi điện tử thành tế bào XK gồm ba lớp: lớp ngoài cùng dày 60Aº, lớp trong và lớp giữa dày 50Aº. Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [5], [9]: Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này. Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi: Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella… Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic. Thuộc nhóm này có các chi: Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia… Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic, arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các chi: Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia… Thành tế bào có kết cấu dạng lưới, có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Ngoài ra thành tế bào XK có thể cho phép nhiều chất như: Chất kháng sinh, axit amin và nhiều hợp chất khác có kích thước tương đối lớn đi qua một cách dễ dàng. Các chất dinh dưỡng từ môi trường cũng thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào. Màng sinh chất là lớp tế bào nằm ngay sát dưới thành tế bào, dày khoảng 7,5 - 10 nm, chức năng chủ yếu là điều hòa sự hấp thu các chất dinh dưỡng vào tế bào, tham gia vào quá trình hình thành bào tử. Tế bào chất của XK gồm một số thành phần chủ yếu như: thể nhân, không bào và thể ẩn nhập. Nhân của tế bào XK không có cấu trúc điển hình, chỉ là nhiễm sắc thể không có màng bao bọc. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty. 1.2. Đại cương về chất kháng sinh 1.2.1. Chất kháng sinh (Antibiotic) Theo khái niệm cũ, CKS là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật mà ngay ở nồng độ thấp (µg/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác một cách chọn lọc (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…). Thuật ngữ antibiotic được bắt nguồn từ chữ Hi Lạp: “anti” là kháng lại, “bios” là sự sống. Thuật ngữ này được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phân biệt penicillin với sulfonamit đã được phát hiện từ những năm 1930. Thuật ngữ này được thay đổi sau khi penicillin và các chất kháng khuẩn khác đã được cải tiến và tổng hợp mới trong phòng thí nghiệm. Ngày nay, thuật ngữ này được sử dụng phổ biến để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, tổng hợp hoặc bán tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như một chất hóa trị liệu có khả năng kháng virus, tế bào ung thư… Tất cả các CKS đều có tính độc chọn lọc, mỗi CKS thường chỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định [10]. 1.2.2. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh Kháng sinh là thuốc được con người dùng chủ yếu để chống các bệnh truyền nhiễm. Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh của con người và động vật. Cho đến nửa sau thế kỷ 19 người ta đã phát hiện rằng vi sinh vật chính là thủ phạm gây ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm. Do đó liệu pháp hóa học nhằm vào các VSV gây bệnh đã được phát triển thành liệu pháp điều trị chính. Năm 1928, Fleming phát hiện ra penicillin và kháng sinh đã được dùng trong điều trị vào những năm 1940. Ngay sau đó penicillin đã trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh thế giới II [36]. Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được xác định hầu hết từ xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son của hóa liệu pháp kháng sinh (bảng 1.1). Bảng 1.1. Kháng sinh được phát hiện qua các năm [6] Năm  CKS được phát hiện  Nước  Năm  CKS được phát hiện  Nước   1929  Penicillin  Anh  1939  Gramicidin  Mỹ   1943  Streptomycin, Bacitracin  Mỹ  1945  Cephalosporin  Italia   1947  Cloramphenicol  Mỹ  1949  Neomycin  Mỹ   1950  Oxytetracyclin  Mỹ  1952  Erythromycin  Mỹ   1956  Vancomycin  Mỹ  1957  Kanamycin  Nhật   1963  Gentamycin  Mỹ  1966  Docycyclin  Mỹ   1971  Torbamycin  Mỹ  1972  Cephamycin  Mỹ   Năm 1944, streptomycin được phát hiện từ xạ khuẩn đất Streptomyces griseus. Sau đó đến chloramphenicol, tetracyclin, các kháng sinh thuộc nhóm macrolide và glycopeptide [11]. Vào năm 1962, các kháng sinh tổng hợp như nalidixic acid, thuốc chống VSV có bản chất quinolone cũng được tạo ra. Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu được phổ kháng VSV rộng hơn, hoạt tính kháng VSV cao hơn, ví dụ như các kháng sinh β - lactam. Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong điều trị ở thế kỷ 20 đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ năm 1980 số kháng sinh mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí phát triển và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn. Bên cạnh đó, một hiện trạng đáng báo động là ngày càng tăng các VSV gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Do vậy, các nghiên cứu cần phải tập trung vào làm thế nào để vượt qua tính kháng thuốc kháng sinh cũng như phát hiện các kháng sinh mới có cơ chế hoạt động khác nhau [29]. 1.2.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh. Đa số các CKS đang dùng trong y học hiện nay có nguồn gốc từ XK, trong khoảng 5.500 CKS đã biết đến hiện nay, có tới hơn 4000 chất từ XK [2]. Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng sinh rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loài VSV khác nhau. Ngày nay, người ta đã biết CKS là sản phẩm trao đổi thứ cấp của vi sinh vật. Dẫu vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai trò của CKS đối với XK. Một số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế giúp xạ khuẩn tồn tại trong môi trường tự nhiên, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh môi trường dinh dưỡng. Lại có giả thuyết cho rằng CKS chỉ là sản phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào… [17], [23]. Có 3 con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn: CKS được tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I, thông qua một chuỗi các phản ứng enzyme. CKS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau. CKS được hình thành bằng cách polime hóa các chất trao đổi bậc I, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau [6], [7]. 1.2.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Đa số các CKS được dùng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn, trong số đó có nhiều chất hiện vẫn đang được sử dụng tương đối phổ biến trong thực tiễn. Streptomycin: Được Waksman phát hiện ra từ năm 1943, có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng chống các VK G(+) khá mạnh. Streptomycin được sử dụng rất hiệu quả để điều trị các bệnh dịch hạch, ho gà và đặc biệt quan trọng hơn cả là dùng để chữa các bệnh lao [10]. Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces fradiae vào năm 1949, có tác dụng chống cả VK G(+) và G(-) . Đặc biệt là chống được nhiều loài vi khuẩn đã kháng lại với penicillin và streptomycin [10]. Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea, có phổ kháng sinh rộng, có tác dụng chống cả VK G(+) như tụ cầu, phế cầu đã kháng lại penicillin và VK G(-) như màng não cầu, lậu cầu. Trong y học, chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do nhiễm Pseudomonas [10]. Tetracyclin: Là kháng sinh được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, các CKS này có phổ kháng sinh rộng, chống được cả VK G(+) và G(-), ricketsia và một vài loài virus lớn. Ngoài sử dụng tron