Luận văn Nghiên cứu khả năng tạo sắc tố đỏ và monacolin K của vi nấm monascus purpureus

Aspergillus các loại ngũ cốc, trái cây và các loại đậu. Năm 1977, Wong và Bau phát hiện trong Monascus purpureus có citrinin được gọi tên là Monascidin A có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn như: Bacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Staphylococcus aureus [3], [13]. Nhưng không phải các chủng Monascus đều tạo ra citrinin, Monascus tạo ra citrinin còn tùy thuộc vào điều kiện môi trường và điều kiện nuôi cấy [53]. Năm 1994, Dresel cho rằng vi khuẩn gram dương thường bị ức chế nhiều hơn là vi khuẩn gram âm, thời gian đầu người ta cho rằng nó là chất kháng sinh có tiềm năng to lớn, nhưng những thử nghiệm trên động vật sau đó đã bác bỏ ý kiến trên do nó gây ảnh hưởng lên gan, thận. Tuy nhiên riêng Lactobacilus thì không bị ảnh hưởng [53]. Liều gây chết 50% của citrinin (LD50) là 50mg/kg trên chuột và 19mg/ kg trên thỏ. 1.4.3. Đặc tính vật lý và hóa học của citrinin Citrinin là phân tử có cấu tạo đơn giản và trọng lượng phân tử thấp, dạng kết tinh citrinin có màu vỏ chanh hình dạng sắc nhọn, tan chảy 1720C. Ít tan trong nước, tan trong NaOH, CaCO3, CH3COONa tan nhiều trong methanol, acetonitrile, ethanol và các dung môi phân cực. Citrinin bị phân hủy bởi ánh sáng và phát sáng dưới đèn huỳnh quang cả khi ở dạng rắn hay dung dịch, nó có thể bị mất hoạt tính bởi dung dịch kiềm hay acid và kém bền nhiệt. 1.4.4. Vấn đề an toàn sức khỏe khi sử dụng các sản phẩm từ nấm men đỏ Mặc dù một số chủng Monascus có khả năng tổng hợp citrinin. Nhưng các sản phẩm từ nấm men đỏ được cho là an toàn do lượng độc tố rất thấp, không có khả năng ảnh hưởng lên cơ thể. Đã có những thí nghiệm chứng minh rằng nguy cơ bị ảnh hưởng nhỏ hơn 0,2%. Bằng chứng là trên thị trường hiện nay có rất nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ bột gạo men đỏ như: chao đỏ (Trung Quốc), rượu vang đỏ, pate, xúc xích, dăm bông (Pháp), các loại thuốc dùng để điều trị cao huyết áp[15]. Tuy nhiên một số khuyến cáo khi sử dụng sản phẩm từ Monascus là không nên sử dụng các sản phẩm trên nước ép cam chanh hoặc bưởi do nó làm tích tụ Lovastain trong cơ 29 thể nên rất nguy hiểm. Ngoài ra cũng không nên sử dụng chung với niacin (vitamin B3) với liều lượng lớn hơn 1g/ ngày [3]. 1.5. Khái quát về CHOLESTEROL 1.5.1. Giới thiệu Cholesterol là một chất mềm dẻo, sáp giống như chất béo được tìm thấy trong máu và trong tất cả các tế bào. Cholesterol cần thiết cho sự sống, nó vừa được dùng để xây dựng, sửa chữa tế bào, sản sinh ra các hormone giới tính giống như estrogen và testosterone, nó được chuyển hóa thành dạng acid mật giúp cho cơ thể tiêu hóa thức ăn, được dùng để sản sinh ra lớp màng tế bào, một số hormone và cung cấp các nhu cầu cần thiết khác cho cơ thể, được tìm thấy với số lượng trong não và mô thần kinh. 1.5.2. Quá trình sinh tổng hợp cholesterol Cholesterol có 2 nguồn gốc [49]: - Do gan tạo ra chiếm 80%. Gan có thể tổng hợp cholesterol từ các chất khác nhau như đường đạm. - Từ nguồn thực phẩm có nguồn gốc động vật như: thịt, cá, trứng, gia cầm, bơ, sữa, phô mai chiếm 20%. Thực phẩm từ thực vật như trái cây, rau, củ, quả, ngũ cốc thì không có cholesterol. Cholesterol là một phân tử sinh học rất quan trọng, đóng vai trò trong cấu trúc màng cũng như tiền chất trong sự tổng hợp các hormone steroid và acid mật. Cả cholesterol trong thức ăn và cholesterol được tổng hợp sau đó đều được vận chuyển nhờ các phân tử lipoprotein. Cholesterol thường được tích tụ trong tế bào dưới dạng cholesteryl ester. Quá trình tổng hợp cholesterol thường diễn ra trong tế bào chất và microsomes từ nhóm acetate 2C của acetyl CoA. Quá trình gồm 5 bước chính: [52] 1. Acety-CoA chuyển thành 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA). 2. HMG-CoA chuyển thành mevalonate. 3. Mevalonate chuyển thành isopentenyl pyrophosphate (IPP), đi kèm với sự mất CO2. 30 4. IPP chuyển thành squalene. 5. Squalene chuyển thành cholesterol. Hình 1.7. Sơ đồ sinh tổng hợp cholesterol [52]. 1.5.3. Ảnh hưởng của cholesterol đối với bệnh tim mạch - Tại tim: làm hẹp động mạch đến nuôi tim, gây ra đau thắt ngực mà nặng hơn là nhồi máu cơ tim. - Tại não: Làm giảm lượng máu đến nuôi não, gây ra hiện tượng chóng mặt, tê người, yếu liệt thậm chí là té xỉu, nặng nhất là tai biến mạch máu não. 31 - Nếu động mạch đế nuôi chân bị ảnh hưởng: người bệnh có cảm giác đau ở chân khi đi nhiều, ngồi nghỉ một lát thì đỡ đau nhưng nếu tiếp tục đi thì lại đau trong y học gọi là đau cách hồi. - Nếu động mạch đến nuôi thận bị hẹp gây tổn thương thận. - Tác hại khác là sự hình thành cục máu đông kết hợp với xơ vữa động mạch gây nên hậu quả nghiêm trọng dễ dẫn đến đột quỵ, tai biến và tử vong. - Ngoài ra, việc tăng lipit huyết cũng kích hoạt một số căn bệnh khác như tiểu đường, gan nhiễm mỡ, cao huyết áp và béo phì. Hình 1.8. Ảnh hưởng của cholesterol đối với bệnh tim mạch. 1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước [5]. 1.6.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chất màu đỏ-vàng và Monacolin K trong công nghiệp thực phẩm và y tế đã được phát triển mạnh mẽ ở nhiều nước trên thế giới từ những năm 1980 cho đến nay. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất tổng hợp sắc tố màu đỏ và Monacolin K bằng các biện pháp công nghệ như tối ưu điều kiện nuôi cấy: nguồn dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, pHcùng với kỹ thuật gây đột biến để tạo ra các chủng Monascus cho khả năng tổng hợp sắc tố và Monacolin K cao. Hiện nay việc sản xuất gạo men đỏ chủ yếu bằng phương pháp lên men bán rắn, nguyên liệu sản xuất là gạo tẻ. Gạo sau khi hấp chỉ cấy giống sau thời gian lên men thu hoạch, sấy khô, nghiền mịn. Các sản phẩm bán ra thị trường có hàm lượng Monacolin K thấp, hình thức phổ biến là dưới dạng viên nén hay con nhộng. Có 3 nhóm chế phẩm chính từ gạo nấm men đỏ: 32 - Zhitai: Được sản xuất bằng cách lên men với hỗn hợp các chủng M. purpureus khác nhau trên cùng một loại gạo. - Cholestin hoặc Hypocol: Được sản xuất bằng lên men chủng M. purpureus có chọn lựa, sử dụng một quy trình độc quyền để sản sinh ra một lượng xác định Monacolin K. - Xuezhikang: được sản xuất bằng cách pha trộn giữa gạo, nấm men đỏ với cồn sau đó trải qua một quá trình xử lý để loại tất cả các gluten của gạo. Xuezhikang chứa lượng Monacolin K nhiều hơn Cholestin (hơn 40%). - Tại Mỹ, gạo nấm men đỏ được bán dưới dạng sản phẩm bổ trợ tiêu hóa gọi là Cholestin TM (Pharmanes, Inc). - Tại Singapore, gạo nấm men đỏ được bán với tên gọi là: HypocolTM (Nalture WiseTM, Wearnes Biotech & Medicals, 1998). Cả hai sản phẩm này đều có thành phần tương tự nhau. - Tại Trung Quốc, Xuezhikang được bán dưới tên gọi cũng chính là Xuezhikang (Beijing WBL Peking University Biotech., Itd). 1.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chất màu đặc biệt là các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật còn hạn chế. Từ những năm 70 các nhà nghiên cứu Viện công nghệ thực phẩm đã tiến hành nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất chao đỏ bằng nấm sợi M. purpureus. Sản phẩm đạt chất lượng và không có độc tố. Công nghệ này được phổ biến và cung cấp cho một số cơ sở ở miền Bắc. Năm 2000-2002, các đề tài cấp bộ nông nghiệp “Nghiên cứu công nghệ khai thác chất màu thực phẩm từ thực vật và vi sinh vật” và “nghiên cứu dạng chế phẩm màu từ vi sinh vật và ứng dụng vào một số thực phẩm” đã tạo ra được màu đỏ của xúc xích, rượu vang (Phan Thị Sửu và Phan Tố Nga, 2000; Phan Tố Nga và Vũ Nguyên Thành, 2003). Năm 2007, Nguyễn Minh Nguyệt và cộng sự đã nghiên cứu và chọn lọc giống nấm Rhodotorula có khả năng phát triển cùng M. purpureus để tạo sản phẩm giàu dinh dưỡng. Trong nghiên cứu này, chủ yếu sử dụng Monascus như là vi sinh vật phân giải tinh bột giúp cho sự phát triển của Rhodotorula. 33 Ngoài ra, Lê Đức Mạnh và cộng sự cũng đã nghiên cứu về khả năng tạo sắc tố, Lovastatin và độc tố citrinin trên 2 chủng M. purpureus cho thấy chỉ 1 chủng M. purpureus 3403 tạo Lovastatin rất thấp (60µg/g sản phẩm khô). Mới đây, 2012 Vũ Thanh Thảo và cộng sự cũng nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy M. purpureus trên chất nền là gạo để thu sinh khối giàu Monacolin K cũng đạt được những thành công nhất định – xác định được điều kiện tối ưu để cho hàm lượng Monacolin K cao nhất. Như vậy, các nghiên cứu hiện nay còn ít và chưa được phổ biến trong khi lợi ích thu được từ kết quả nghiên cứu đem lại tìm năng ứng dụng rất to lớn. 34 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1. Giống vi sinh vật và nguyên liệu: - Chủng nấm Monascus purpureus N.212 do TS. Nguyễn Hữu Phúc cung cấp. - Chủng nấm Saccharomyces cerevisiae từ Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp dùng trong khảo sát đồng nuôi cấy. - Gạo tài nguyên loại I, mua tại chợ Thủ Đức - TP. Hồ Chí Minh. 2.1.2. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng - Môi trường PGA (potato glucose agar) dùng nuôi cấy nấm mốc [6]. + Khoai tây 200g, glucose 20g, agar 20g, nước cất vừa đủ: 1000ml, pH 6,5-7. - Môi trường lên men + Gạo tấm tài nguyên Việt Nam loại I, kích thước 2mm, pH được chỉnh về 4 bằng acid acetic (CH3COOH). - Môi trường Hasen nuôi cấy nấm men [6]. + Glucose 50g, pepton 10g, KH2PO4 3g, MgSO4 3g, agar 20g, nước vừa đủ 1000ml, pH 6. - Môi trường gelatin [6]. + K2HPO4 1,5g, KH2PO4 1,5g, gelatin 10g, agar 16g, nước cất 1000ml. - Môi trường Capeck [6]. + NaNO3 3g, K2HPO4 1g, tinh bột tan 15g, KCl 0,5g, MgSO4.7H2O 0,5g, FeSO4 0,01g (vết), agar 20g, nước cất cho đủ 1000ml, pH 7±0,2. 2.1.3. Hóa chất: - Dùng trong tạo môi trường nuôi cấy: Glucose, pepton, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, FeSO4, NaCl, acid acetic, cao nấm men, gelatin, tinh bột tan (Trung Quốc), agar, nước cất 35 - Ethanol 96%, NaOH, CH3COOH, HCl (Trung Quốc) - Thuốc nhuộm Fuchsin, xanh methylen, lugol (Trung Quốc), HgCl2 (Merck). - Chất chuẩn Statin: Thuốc Lovastatin của xí nghiệp Domesco – Đồng Tháp (hàm lượng Monacolin K 20mg/ viên). - Hóa chất trong xác định hoạt tính ezyme [1]: + Amylase: Tinh bột 1%, NaCl 3%, đệm photphat 1/15M, lugol 1%, HCl 1N + Protease: Tyrosin chuẩn (Merck), casein 1%, acid tricloacetic (TCA) 5%, folin (tỷ lệ với nước 1:4), NaOH 0,5N, Na2CO3 6%, HCl 0,2N. 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ: - Thiết bị nuôi cấy: Tủ cấy, đèn cồn, que cấy, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp vô trùng, tủ lạnh, bếp điện , - Thiết bị phân tích: Kính hiển vi (Nikon – Nhật), lame, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy đo pH (Thermo Orion), máy ly tâm (Hermle Labortechnik – Đức), máy đo quang phổ (Agilent – USA), bể ổn nhiệt (Memmert - Đức), máy cô quay (Heidolph - Đức),Tất cả thiết bị trên đều có tại Viện Sinh học Nhiệt đới. - Dụng cụ thủy tinh: Ống đong, đĩa Petri, bình tam giác 250ml, pipet, phễu, pipetman, ống nghiệm, bình định mức (100ml, 250ml) 2.2. Nội dung thí nghiệm 36 2.3. Phương pháp thí nghiệm: 2.3.1. Quan sát hình thái nấm Monascus 2.3.1.1. Quan sát đại thể - Để quan sát hình dạng khuẩn lạc của nấm M. purpureus N.212 tiến hành cấy chấm điểm trên đĩa Petri chứa MT PGA nuôi ở nhiệt độ phòng. - Thời gian quan sát hằng ngày bằng mắt thường cấy đến 17 ngày. Đo đường kính khuẩn lạc, quan sát màu sắc, đặc điểm khuẩn lạc theo từng thời gian [7]. 2.3.1.2. Quan sát vi thể - Để dễ quan sát hình thái cấu trúc sợi nấm và các cơ quan sinh sản của nấm M. purpureus N.212 ở trạng thái tự nhiên chúng tôi dùng phương pháp nuôi cấy phòng ẩm [7]. . Nuôi cấy phòng ẩm: Đặt vào đáy đĩa Petri một tờ giấy thấm sau đó là một phiến kính. Đậy nắp đĩa Petri lại, gói giấy và hấp khử trùng. Lấy từ đĩa Petri có chứa môi trường PGA đã vô trùng để vào - Định lượng sắc tố - Định lượng monacolin K - Độ bền dịch chất - Thời gian - Độ ẩm - pH - Số lượng giống - Nguồn Carbon, nitơ - Đồng nuôi cấy - Sấy, nghiền - Ethanol 70o - Định lượng sắc tố - Định lượng Monacolin K - Độ bền dịch chiết Xử lý mẫu sau lên men Giống Monascus purpureus N.212 Dịch mẫu thô và phân tích Trích ly Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy Lên men gạo 37 tủ cấy gần đèn cồn, dùng que mũi mác cắt lấy một miếng thạch nhỏ, rồi mở hé nắp đĩa Petri đặt miếng thạch lên phiến kính. Bổ sung một ít nước cất vô trùng, đủ thấm ướt giấy thấm để giữ độ ẩm. Dùng que cấy móc thu lấy khuẩn ty bằng cách khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm, chấm đầu que cấy lên phần thạch của phiến kính trong phòng ẩm. Gói cả hộp lại và ủ ở nhiệt độ thích hợp 2-3 ngày. Lấy phiến ra khỏi đĩa Petri, dùng giấy thấm lau mặt đáy phiến kính, đậy một lá kính lên chỗ có khuẩn lạc mọc và đặt dưới KHV quan sát với vật kính x10, x40, x100. 2.3.2. Phương pháp định lượng tế bào vi sinh vật. - Để xác định số lượng bào tử và số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu, sử dụng phương pháp xác định gián tiếp bằng cách đếm khuẩn lạc trên môi trường PGA chọn lọc. - Nguyên tắc: Pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, sao cho có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn, để hạn chế sai số và tính toán, số lượng khuẩn lạc tối ưu là 25 - 250 khuẩn lạc/đĩa [6]. - Thực hiện: + Đổ 15ml MT PGA vào đĩa Petri vô trùng để thạch đông. + Pha loãng mẫu thành nhiều mật độ pha loãng thích hợp. + Dùng pipet và đầu típ vô trùng chuyển 100µl mẫu pha loãng trên mặt thạch dùng que gạt khử trùng trãi đều dịch giống. + Ủ đĩa trong tủ ấm ở 280C-300C trong 2-3 ngày. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc. - Tính kết quả: Mật độ tế bào trong mẫu được tính như sau: Mi = Ai x Di/V (CFU/ml) Trong đó: Ai: số khuẩn lạc trung bình/ đĩa; Di: độ pha loãng; V: thể tích dịch mẫu cho vào đĩa (0,1ml). 38 2.3.3. Xác định độ ẩm ban đầu của gạo và độ ẩm gạo sau lên men 2.3.3.1. Độ ẩm ban đầu của gạo: Sau khi ngâm cơ chất gạo qua một đêm, vớt ra để ráo nước, lấy 10g gạo cho vào đĩa Petri. Cân Petri có mẫu và ghi nhận số liệu. Đem petri đi sấy đến khối lượng không đổi, ghi nhận số liệu sau khi sấy. Kết quả tính theo công thức: W(%) = (trọng lượng mẫu trước sấy – trọng lượng mẫu sau sấy)/10*100 2.3.3.2. Độ ẩm gạo sau lên men: Cân chính xác 1g mẫu thu được sấy khô đến khối lượng không đổi cân lại trọng lượng khô. Kết quả được tính theo công thức: W(%) = (trọng lượng ướt – trọng lượng khô)/ trọng lượng ướt *100 2.3.4. Phương pháp lên men thu nhận chế phẩm - Chuẩn bị môi trường lên men (môi trường rắn trên cơ chất gạo) + Gạo nguyên hạt được vo sơ để rửa nhằm loại bỏ bụi bẩn, ngâm qua đêm, pH = 4, sau đó vớt ra để ráo nước. + Cho vào erlen 250ml với lượng 20g, đậy nút bông hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, thời gian 20 phút, lấy ra để ở nhiệt độ phòng, cấy giống từ ống thạch nghiêng đã nuôi trước đó 7- 10 ngày. - Chuẩn bị giống cho lên men: + Hút 10ml nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng cho vào mỗi ống giống, dùng que cấy đánh đều bào tử trên mặt thạch hòa tan vào nước. + Dùng pipet hút 2ml (23x106 CFU/ml) cho vào môi trường lên men nói trên. Sau khi cấy xong để các bình môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 20 ngày nuôi cấy, sấy khô mẫu sau lên men ở 50oC trong 24 giờ ta thu được sản phẩm bảo quản ở nhiệt độ thường để tiến hành định lượng sắc tố và Monacolin K. 39 2.3.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K 2.3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy - Để xác định thời gian cho lượng sắc tố và Monacolin K sinh ra cao nhất trong quá trình lên men, chúng tôi tiến hành như sau: + Chuẩn bị môi trường lên men giống như ở mục 2.3.4, bổ sung thêm nước để có độ ẩm 30% tiến hành lên men. + Phân tích mẫu theo từng thời gian, bắt đầu từ lúc màu môi trường chuyển sang màu đỏ (ngày thứ 5), lấy mẫu vào các ngày 5, 7, 10, 12, 14, 17, 20, 22. Định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu. + Vẽ biểu đồ đường biến thiên theo thời gian. Rút ra kết luận. 2.3.5.2. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu - Để xác định độ ẩm cần thiết cho môi trường lên men ở chủng M. purpureus N.212 chúng tôi làm như sau: - Môi trường gạo bổ sung nước với thể tích lần lượt là: 5,03, 10,04, 17,55, 30,06ml (độ ẩm tương ứng lần lượt là: 40%, 50%, 60% và 70%). Môi trường tiệt trùng và lên men theo cách trên. Sau 17 ngày thu nhận sản phẩm, đem tiến hành định lượng sắc tố và MonacolinK có trong mẫu. 2.3.5.3. Ảnh hưởng của số lượng giống - Để xác định số lượng giống cần thiết cho môi trường lên men của chủng M. purpureus N.212 chúng tôi tiến hành như sau: + Môi trường được chuẩn bị như mục 2.3.4, hấp khử trùng và lên men ở các nồng độ khác nhau chúng tôi chọn các nồng độ 104,105, 106(CFU/ml). Thu lấy mẫu vào các ngày 5, 8, 11, 14, 17, 20.Tiến hành định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu. 2.3.5.4. Ảnh hưởng pH ban đầu - Để xác định ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sắc tố và Monacolin K của M. purpreus N.212 chúng tôi tiến hành như sau: 40 + Ngâm gạo trong nước có pH 4, 5,5 và 7 điều chỉnh bằng CH3COOH và NaOH. Tiến hành tiệt trùng, lên men như trên, trích mẫu vào các ngày 5, 7, 10, 13, 15, 18. Định lượng sắc tố cũng như hàm lượng Monacolin K có trong mẫu. 2.3.5.5. Ảnh hưởng nguồn nitơ 0.5% - Để xác định ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K của M. purpureus N.212. Chúng tôi tiến hành như sau: + Bổ sung pepton, NaNO3, (NH4)2SO4 và cao nấm men 0,1g tương ứng với nồng độ 0,5%. Tiến hành lên men trong 17ngày thu nhận mẫu, phân tích định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu 2.3.5.6. Ảnh hưởng nguồn carbon - Để xác định ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K của M. purpureus N.212, chuẩn bị môi trường bổ sung thêm: + Thành phần glucose theo 3 nghiệm thức: 0,1g, 0,2g, 0,4g tương ứng với nồng độ 0,5%, 1% và 2%. Lên men trong 17ngày thu nhận mẫu, phân tích định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu. + Thành phần ethanol 70% theo 3 nghiệm thức 0,3%, 0,5%, 0,7% được bổ sung vào sau khi môi trường hấp tiệt trùng. Sau 17ngày lên men tiến hành thu mẫu, phân tích, định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu. 2.3.5.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol - Để xác định ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol vào môi trường tác động đến sự tống hợp sắc tố và Monacolin K, chúng tôi tiến hành như sau: + Bổ sung vào môi trường lên men lượng glycerol với nồng độ lần lượt là: 0,8%, 2,4%, 4% (V/m). Tiến hành khử trùng và lên men trong 17 ngày thu nhận mẫu, phân tích, định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu. 2.3.5.8. Ảnh hưởng của việc nuôi cấy kết hợp với S.cerevisiae - Để khảo sát ảnh hưởng của việc đồng nuôi cấy nấm M. purpureus N.212 với giống vi sinh vật khác đến quá trình sinh tổng hợp sắc tố và Monacolin K, chúng tôi tiến hành như sau: 41 + Môi trường khử trùng để nguội, cấy giống M. purpureus N.212 đồng thời bổ sung 1ml nấm men S.cerevisiae (12x104 CFU/ml) vào môi trường. Tiến hành lên men, sau 17 ngày thu mẫu,phân tích, định lượng sắc tố và Monacolin K có trong mẫu. 2.3.6. Phương pháp trích ly sắc tố  Cách tiến hành: - Gạo sau khi lên men được sấy khô 500C trong 24 giờ, nghiền mịn. - Cân 0,5gam bột mịn cho vào 10 ml ethanol 70%, lắc 120 vòng/ phút trong 2giờ ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 5000 vòng/ phút trong 10 phút để loại bỏ chất lơ lửng. Hút dịch nổi cho vào ống nghiệm, pha loãng với ethanol 700 đến mức có thể đo được, lắc đều. - Dung dịch nổi được phân tích bằng máy đo quang phổ với mẫu đối chứng ethanol 70%. - Đơn vị sắc tố đỏ là một sắc tố được trích ly ra bằng ethanol 70% và đo ở bước sóng 410nm (sắc tố vàng) và 505nm (sắc tố đỏ) trong cuvette 1cm. - Mẫu được pha loãng đến mức độ cần thiết, kết quả tính bằng đơn vị hấp thu (AU) trên gram sản phẩm thô. - Tổng số sắc tố hấp thu (AU/g) = Abs x (10/0,5) x df Trong đó: Abs: độ hấp thu mẫu; df: hệ số pha loãng 2.3.7. Xác định hàm lượng Monacolin K Nguyên tắc: Monacolin K có độ hấp thu cao nhất tại bước sóng 238nm. Dịch trong thu nhận được pha loãng đến nồng độ có thể đo được. Đo mật độ quang ở bước sóng 238nm, từ đường chuẩn suy ra nồng độ Monacolin K có trong mẫu. 2.3.7.1. Phân tích Monacolin K từ gạo nấm men đỏ - Cân 0,5gam mẫu bột gạo sau lên men, cho vào bình tam giác 10ml ethanol 70%, lắc 120 vòng/ phút trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó ly tâm 5000 vòng/ phút, thời gian 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch trong, pha loãng mẫu nếu cần thiết rồi đem đo ở bước sóng 238nm. Dựa vào đường chuẩn xác định lượng Monacolin K tạo thành trong mẫu đo. 42 - Tính kết quả: Tổng lượng Monacolin K tạo thành (mg/g) = C x (10/0,5) x df C: nồng độ Monacolin K có trong mẫu đo df: hệ số pha loãng 2.3.7.2. Xây dựng đường chuẩn Monacolin K Vì không có Monacolin chuẩn, chúng tôi sử dụng gián tiếp theo hàm lượng của viên thuốc Lovastatin có bán trên thị trường TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. Trong đó mỗi viên chứa 20mg Monacolin K. - Pha dung dịch Monacolin K chuẩn (1mg/ml). + Nghiền mịn 1viên thuốc Lovastatin. Thêm vào 20ml ethanol 700. + Lắc trong 1giờ ở nhiệt độ phòng. + Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10phút. + Bỏ bã và thu dịch Monacolin K chuẩn. - Dựng đường chuẩn: + Pha theo bảng 2.1. Ống số 1 2 3 4 5 Dung dịch Monacolin K (ml) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Ethanol 700 (ml) 9,95 9,9 9,85 9,8 9,75 Nồng độ Monacolin K (µg/ml) 5 10 15 20 25 - Đem đo ở bước sóng 238nm ghi nhận kết quả, xây dựng đường chuẩn Monacolin K dựa vào kết quả ghi nhận. 2.3.8. Đặc tính sinh học của chế phẩm gạo men đỏ: Chuẩn bị dung dịch chế phẩm enzyme: 43 - Cân 1gam chế phẩm gạo đỏ cho vào cốc thủy tinh 25ml, thêm vào 20ml dung dịch đệm photphat, trộn đều, để yên 20phút. Tiến hành thu lấy dịch trong (Với Amylase sử dụng đệm có pH 5,5, protease đệm có pH 7,6). 2.3.8.1. Phương pháp định tính amylase và protease căn cứ vào vòng phân giải cơ chất của dịch chiết enzyme [1]. Nguyên tắc: Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch chứa môi trường cần thử hoạt tính. (Môi trường Zapeck đối vối amylase, môi trường Gelatin đối với protease). - Các enzyme đặc trưng được chúng tiết ra môi trường xung quanh dưới dạng vòng trong suốt bao quanh lỗ thạch, gọi là vòng thủy phân. Dựa vào đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc đánh giá khả năng hình thành enzyme chế phẩm. Tiến hành: Để định tính enzyme của chế phẩm gạo men đỏ chúng tôi tiến hành như sau: - Đổ vào đĩa Petri môi trường tương ứng với từng enzyme: Môi trường Zapeck đối vớii amylase và môi trường Gelatin đối với protease. + Dùng ống nghiệm nhỏ (d = 12mm) khử trùng đục lỗ thạch, sau đó nhỏ 100µl dung dịch enzyme đã trích ly như trên vào lỗ thạch. Bao gói ủ ở 35oC trong 18h. Sau đó cho chất thử (lugol 1% đối với amylase và dung dịch HgCl2 đối với protease) lên bề mặt môi trường quan sát, ghi nhận lại kết quả. 2.3.8.2. Định lượng hoạt tính enzyme của gạo men đỏ Amylase: Nguyên tắc: Amylase có khả năng thủy phân tinh bột tạo các dextrin, có phân tử lượng khác nhau. Khi cho tác dụng với iot chúng sẽ tạo màu. Đo cường độ màu tạo thành sẽ tính được hoạt độ amylase. Đó chính là lượng enzyme xúc tác thủy phân được 1mg tinh bột tạo thành dextrin ở nhiệt độ 300C trong 30 phút. Thực hiện: Lấy 2 ống nghiệm (ống chuẩn và ống thử). + Ống chuẩn: 1ml nước cất, 1ml đệm photphat 1/15M, lml hồ tinh bột, 0,5ml NaCl 3%. 44 + Ống thử: 1ml dịch enzyme, 1ml đệm photphat 1/15M, lml hồ tinh bột, 0,5ml NaCl 3%. Ủ 400C trong 30 phút, sau đó lần lượt cho vào ống nghiệm 1ml HCl 1N. Thêm nước cất cho đủ mỗi ống, cho vào mỗi ống 1 giọt lugol 1%. Đo mật độ quang ở bước sóng 600nm. Đơn vị hoạt tính: UI = Trong đó: Eo: Mật độ quang ống chuẩn; Ek: mật độ quang ống thử C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng L: hệ số pha loãng (20) t: thời gian phản ứng (30phút) Protease: Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Anson cải tiến [1]. Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với casein hoặc hemoglobin, sau đó kết tủa protein dư thừa bằng TCA, xác định bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Biểu diễn hoạt tính bằng đơn vị hoạt độ. Một đơn vị hoạt độ lượng enzyme trong 1nphút ở 30oC phân giải được lượng protein tương ứng với 1µmol tyrosin.  Xây dựng đường chuẩn tyrosin: - Chuẩn bị 6 ống nghiệm (đánh dấu 1, 2, 3, 4, 5, 6) và bổ sung các dung dịch theo hàm lượng như sau: + Dung dịch tyrosine chuẩn (ml): 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 + Lượng tyrosine tương ứng (µmol/l): 0,0; 0,1; 0.2; 0,3; 0,4; 0,5 + Dung dịch HCl 0.2N (ml): 2,5; 2,4; 2,3; 2,2; 2,1; 2,0 + Dung dịch NaOH 0.5N (ml): 5,0; 5,0; 5,0; 5,0; 5,0; 5,0 + Dung dịch Folin (1:3) (ml): 1,5; 1,5; 1.5; 1,5; 1,5; 1,5 45 Lắc mạnh sau 5-10phút, đo OD ở bước sóng λ = 660nm. Tính hiệu số mật độ quang giữa các ống với ống số 1. + Dựng đồ thị biểu hiện sự tương quan giữa ∆OD (ΔOD = ODTN - ODKC ) với nồng độ protein của các ống. - Tiến hành thí nghiệm: Lấy 2 ống nghiệm sạch, khô (ống chuẩn và ống thử). Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Ống thử Ống chuẩn Dung