Luận văn Nghiên cứu khả năng tích lũy coenzyme q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam

trong môi trường nước biển có độ mặn từ 8-11 % NaCl. 15 1.2.4. Các nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp 1.2.4.1. Nghiên cứu trên thế giới về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số loài VKTQH. Tian và cộng sự (2010) nghiên cứu về tối ưu môi trường nuôi cấy đối với loài Rhodospirillum rubrum nhằm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp phản ứng bề mặt (RSM) trong nuôi cấy ống nghiệm tĩnh. Môi trường tối ưu để sản xuất CoQ10 là: 2,5 g/l axit malic; 1,29 g/l chiết xuất men; 1,34 g/l (NH4)2SO4; 0,20 g/l MgSO4.7H2O; 0,9 g/l K2HPO4; 0,6 g/l KH2PO4; 0,08 g/l citrat sắt; 0,02 g/l EDTA. Hàm lượng thu được cao nhất của CoQ10 là 9,76 mg/l, phù hợp với hàm lượng dự đoán RSM (9,63 mg /l). Năng suất của CoQ10 trong thiết bị lên men 3 l cao hơn so với đạt được trong nuôi cấy tĩnh và đạt 10,81 mg /l, có thể được quy cho sự khuấy trộn liên tục (400 vòng/phút) giúp tăng cường tiếp xúc với chất nền tế bào trong suốt quá trình lên men [66]. Jiang và cộng sự (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (DO) về khả năng tích lũy CoQ10 của Rhodopseudomonas palustris bằng cách sử dụng quy trình lên men hai giai đoạn J001. Hàm lượng DO tối ưu cho sự phát triển của tế bào và tích lũy CoQ10 lần lượt là 45 % và 15 %. Quá trình lên men hai giai đoạn, bao gồm giai đoạn 1 với 45 % DO, giai đoạn 2 với 15 % DO và 2,0 % NaAc tại thời điểm chuyển đổi (42 giờ sau khi tiêm chủng), đã được chứng minh là tối ưu quá trình lên men để sản xuất CoQ10. Sinh khối tối đa, hàm lượng CoQ10 và tỷ lệ tích lũy CoQ10 lần lượt là 1,31 mg/l; 89,1 mg/l và 1,142 mg/l, tăng lần lượt 28 %; 585 % và 426 % so với quá trình lên men giai đoạn 1 với nồng độ DO là 45 %. Nồng độ DO là yếu tố chính để tăng hàm lượng CoQ10 theo quy trình lên men hai giai đoạn [67]. Nghiên cứu của Whu và cộng sự (2013) về tách và tinh chế CoQ10 từ các tế bào ướt được sản xuất bởi Rhodobacter sphaeroides BCRC 13100. 16 Hàm lượng của CoQ10 được xử lý trước bằng cách sử dụng enzyme, ethanol hoặc homogenizer cao ở nông độ lần lượt là 2,85 mg/g; 2,01 mg/g và 2,11 mg/g. CoQ10 được chiết xuất với các dung môi hữu cơ khác nhau. Sử dụng ethanol để chiết xuất CoQ10 hai lần trực tiếp từ các tế bào thô sau khi lên men tạo ra năng suất CoQ10 là 2,9 mg/g. Chiết xuất thô được tinh chế bằng cách sử dụng chiết xuất ethanol, sử dụng hexane để phá vỡ tế bào, sự kết tinh để tinh chế CoQ10 tinh khiết. Độ tinh khiết của CoQ10 được xác định bằng phương pháp HPLC đạt 96 % [34]. Wang và cộng sự (2016) đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides. Các quy trình tối ưu để sản xuất CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroide là: hàm lượng chủng thêm vào là 2 % so với môi trường, nhiệt độ lên men 30 °C, thời gian lên men 72 h, thể tích môi trường đến bình tổng thể tích 60 %, nhiệt độ chiết 90 °C, giá trị pH của nước axit trong chất chiết là pH=3. Trong các điều kiện tối ưu, năng suất của CoQ10 được tăng thêm 141 % so với các điều kiện trước khi tối ưu hóa [68]. 1.2.4.2. Nghiên cứu trong nước về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn tía quang hợp Từ năm 1999, nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Lê Quang Huấn đã có những kết quả ban đầu về khả năng tích lũy CoQ10 của một chủng VKTQH thuộc chi Rhodobacter. Nhóm tác giả đã tinh sạch được ubiquinone với phổ hấp thụ đặc trưng ở dạng oxy hóa tại bước sóng 275 nm và phổ hấp thụ đặc trưng ở dạng khử tại bước sóng 291 nm [69]. Năm 2005, nhóm tác giả Đỗ Thị Tố Uyên và Trần Văn Nhị đã bước đầu xây dựng được quy trình sản xuất ubiquinone từ sinh khối VKTQH. Kết quả cho thấy, nhóm tác giả đã lựa chọn được bể thủy tinh để nuôi lấy sinh khối VKTQH và sử dụng phương pháp siêu âm để phá vỡ tế bào. Từ đó, tách chiết ubiquinone dạng thô bằng hệ dung môi diethyl ether/ethanol với tỷ lệ 3/1 (v/v) [70]. Trong nghiên cứu của Lê Thị Thanh Thảo, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng như nguồn carbon, nguồn nitơ, vitamin, dịch chiết cà rốt và dịch 17 chiết cà chua đến sự tăng trưởng tế bào cũng như sản xuất CoQ10 của các chủng vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 và PN31 được phân lập tại Việt Nam. Bổ sung vào môi trường nuôi cấy mannitol, pepton, cao nấm men và vitamin E sẽ làm tăng việc sản xuất CoQ10 từ các chủng vi khuẩn khảo sát. Chọn được phương pháp chiết Q10 từ tế bào vi khuẩn và chủng PN31 có hàm lượng Q10 là 399,8 µg/g sinh khối sau thời gian nuôi cấy là 72 giờ [71]. Tuy nhiên, khu hệ vi sinh vật ở nước ta là rất đa dạng, nhưng số lượng nghiên cứu và công bố về VKTQH có khả năng tích lũy CoQ10 còn chưa phong phú. Qua so sánh với các công bố trên thế giới, có thể thấy rằng hàm lượng tích lũy CoQ10 ở các chủng này còn chưa cao và quy trình tách chiết còn chưa được tối ưu [9, 49]. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam” đã được đặt ra. 18 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 2.1.1. Nguyên vật liệu - 06 chủng VKTQH có khả năng tích lũy sinh khối cao được phân lập từ các mẫu nước nhiễm dầu được ký hiệu là: FO2, DQ1, DQ2, DQ3, DQ4 và DQ5 và chủng Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408 được lưu giữ tại Phòng CNSH Môi trường, Viện Công nghệ sinh học - Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng để tách gen 16S rRNA: cặp mồi đặc hiệu 27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và 1527R (5′-AGAAAGGAGGTGATCC AGCC-3′). - Vector pCRTM được sử dụng làm vector tách dòng nhân đoạn gen 16S rRNA, chủng E. coli DH5 được sử dụng cho biến nạp do Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học. 2.1.2. Các thiết bị máy móc Các thiết bị máy móc được sử dụng bao gồm thiết bị của Phòng công nghệ sinh học Môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học: + Tủ nuôi cấy vi sinh (Binder, infors, Đức); + Bình khí nitơ (Nga), máy quang phổ NOVASPEC II (Anh); + Máy quang phổ UV-1650PC (Shimazdu, Nhật Bản); + Cân phân tích Mettler toldo (Thụy Sỹ); + Máy li tâm lạnh CT15RE HiMac (Hitachi); + Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ); + Máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ); + Máy soi DNA (mini-transllumminator, Bio-Rad, Mỹ); + Máy Vortex (Đức), + Máy đo pH (Thommas Scientific, Mỹ), + Máy lắc ổn nhiệt (N-Biotex, Hàn Quốc), 19 + Bể ổn nhiệt (N-Biotex, Hàn Quốc), + Máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), + Tủ lạnh thường GR-K22EA (Toshiba) và + Tủ lạnh sâu -20oC (Alaska), + Box cấy Biocyt ESI Flufrance (Pháp), + Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản) và + Kính hiển vi điện tử JEM1010 (Nhật Bản), + Máy đọc trình tự gene tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. 2.1.3. Hóa chất - CoQ10 chuẩn từ hãng Sigma. Các hóa chất thông thường dùng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất. Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử đều là các hóa chất có độ tinh khiết cao đặt từ các hãng như Merk (Đức), Ferrmentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Ấn Độ. 2.1.4. Thành phần môi trường nuôi cấy - Môi trường phân lập và nuôi cấy VKTQH là môi trường DSMZ 27 bao gồm các thành phần sau: Cao nấm men (0,3 g/l), succinate –Na (1 g/l), acetate (0,5 g/l), K2HPO4 (1 g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4.7H2O (0,4 g/l), CaCl2.2 H2O (0,05 g/l), NH4Cl (0,4 g/l), vi lượng SL6 (1 ml/l), dung dịch vitamin B12 (0,4 ml/l), nước cất (1000 ml), pH (6,8). - Môi trường DSMZ 27 có bổ sung 2% thạch - Vitamin và vi lượng bổ sung: + Dung dịch vi lượng SL6 (mg/l): HCl (25%) 6,5 ml; FeCl2.4H2O 1,5 g; H3BO3 0,3 g; MnCl2.2H2O 0,03 g; CoCl2.6H2O 0,2 g; ZnSO4. 7H2O 0,1 g; CuCl2.2H2O 17 mg; NiCl2.6H2O 24 mg; Na2MoO4.2H2O 36 mg, H2O 993 ml. + Dung dịch vitamin B12: 10 mg trong 100 ml nước được khử trùng bằng màng lọc và bổ sung vào môi trường trước khi sử dụng 20 2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Thời gian thực hiện: từ 15/8/2018 đến 15/8/2019 - Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ sinh học Môi trường (CNSHMT), Viện Công nghệ sinh học, VAST 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp VKTQH được nuôi cấy trong ống thủy tinh có nắp đậy cao su hoặc trong các bình thủy tinh hình trụ có thể tích chứa dịch môi trường DSMZ 27. Môi trường trong các bình và các ống thủy tinh được sục khí nitơ qua màng lọc vô trùng thay thế khí oxy trong môi trường sao cho nồng độ oxy hòa tan 0 mg/l. Các chủng VKTQH được nuôi trong lọ penicillin V=10 ml hoặc bình thủy tinh V=100 ml chứa môi trường DSMZ 27 ở điều kiện kỵ khí, ánh sáng đèn sợi đốt có cường độ 5000 lux, nhiệt độ 27-30 oC. Hoạt hóa các chủng VKTQH bằng cách: Khi sinh trưởng của các chủng VKTQH được nuôi cấy ở pha log với mật độ tế bào khoảng 109 thì được cấy vào bình thí nghiệm thể tích 500 ml khoảng 5-10 % (v/v) để đạt mật độ ban đầu OD800 khoảng 0,1. Sau đó các chủng VKTQH được nuôi bằng cách nuôi tĩnh trong môi trường DSMZ 27 điều kiện kỵ khí với cường độ ánh sáng 5000 lux từ đèn sợi đốt. Mỗi chủng VKTQH được hoạt hóa làm lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình thí nghiệm. Sinh trưởng của các chủng VKTQH được xác định thông qua độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở pha log (khoảng 5 ngày nuối cấy) tại bước sóng 800 nm (OD800), vì trong tế bào VKTQH Bchl có cực đại hấp thụ ở 800 nm và độ hấp thụ này tỷ lệ với hàm lượng Bchl và do vậy tỷ lệ thuận với sinh khối của tế bào. Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ UV-1650 PC. 2.3.2. Phương pháp xác định Coenzyme Q10 từ các chủng vi khuẩn tía quang hợp - Tách chiết, tinh sạch CoQ10 [13]: Dịch nuôi cấy các chủng VKTQH trong môi trường DSMZ 27 sau 5 ngày nuôi cấy được ly tâm loại dịch thu 21 sinh khối tươi (ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 oC trong 10 phút). CoQ10 được tiến hành chiết xuất dựa theo phương pháp của Paterson và Buddie [72]. + Cân khoảng 2,5 g sinh khối tươi cho vào ống falcol được thêm 25 ml hỗn hợp methanol: n- hexane (tỉ lệ thể tích 3:2). Sau đó lắc votex hỗn hợp trong 20-30 phút, ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 oC trong 10 phút. Tách lấy dịch trên và cô chân không ở 60 oC thu được cặn thô. + Cặn khô có chứa CoQ10 được hoàn tan trở lại trong hỗn hợp dung môi methanol: hexane và chiết lấy pha hexane; sau đó pha hexane được cô đặc đến khô (quá trình lặp lại 3 lần). Sau đó CoQ10 tiếp tục được tinh sạch bằng cột silica với dung môi methanol làm pha động và được cân bằng 10 lần thể tích cột. Mẫu dịch chiết CoQ10 được đưa lên cột và chạy với hệ dung môi rửa giải là ethanol. Do CoQ10 có màu vàng nên tiến hành thu nhận các phân đoạn chứa CoQ10. Cặn thô được hòa tan dung môi n –hexan được gọi là dịch thô chứa CoQ10. - Xác định sự có mặt của CoQ10 bằng sắc ký bản mỏng (TCL): Dịch thô thu được từ sinh khối các chủng được sử dụng để xác định sự có mặt của CoQ10 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng tráng silicagel 60 F254 (TCL) pha thường với hệ dung môi n–hexan: etyl ete với tỉ lệ là 4:1 (v/v). Lượng dịch thô của mỗi chủng tiêm vào sắc kí bảng mỏng là 5 µl. Chủng VKTQH có vết CoQ10 đậm nhất và sinh trưởng tốt nhất được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. - Định lượng CoQ10 bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) [73]. Xây dựng đường chuẩn Q10 bằng phương pháp HPLC Xây dựng đồ thị mối quan hệ giữa nồng độ Q10 và diện tích píc hấp thụ sắc ký trong khoảng nồng độ là 1200; 2400; 3600; 4800 và 6000 mg/l. Phân tích từng mẫu trên với thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC 1100 tại bước sóng  = 280 nm cho ra đường chuẩn dùng để xác định hàm lượng Q10 trong mẫu thí nghiệm. 22 Phân tích hàm lượng CoQ10 được thực hiện trên hệ thống HPLC: Dịch thô thu được từ sinh khối các chủng VKTQH được xác định hàm lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với các điều kiện: sử dụng cột Hypersil C18 (200 x 4 mm); tỷ lệ pha động Hexan : Aceton = 90: 10 (v/v); tốc độ dòng chảy 0,5 ml/phút và áp suất là 220 bar. Tiến hành: Sau khi đặt xong các thông số cần thiết, tiến hành rửa bơm, rửa cột, chạy đường nền và áp suất ổn định 30  45 phút. Lọc mẫu trước khi đo bằng micro filter 2-3 lần, lượng mẫu tối thiểu đạt 0,5 ml. Dùng Micropipet lấy 5 ml dung dịch phân tích đưa vào buồng mẫu. Máy sẽ tự động ghi các thông số: Thời gian lưu (RT), chiều cao pic và tính điện tích cũng như thành phần phần trăm (%) của từng cấu tử trong hỗn hợp. + Sau khi đo xong mẫu để thiết bị chạy đường nền 10 phút trước khi bơm mẫu tiếp theo. 2.3.3. Phương pháp xác định các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp 2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng và xác định các đặc điểm hình thái Chủng VKTQH sinh tổng hợp CoQ10 tốt nhất được nuôi cấy đồng thời trên môi trường DSMZ 27 thạch để quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào. Hình thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản) và chụp ảnh tế bào trên kính hiển vi điện tử JEM1010 (Nhật Bản) và được tiến hành tại phòng Vi sinh vât – Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà Nội. Phương pháp nhuộm Gram: Xác định Gram của vi khuẩn theo phương pháp của Harry, sử dụng chủng vi khuẩn E. coli và vi khuẩn Bacillus subtillis làm đối chứng. 2.3.3.2.Phương pháp xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon Các chủng lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường DSMZ-27 trong đó nguồn carbon được thay thế bằng các nguồn như: glucose, acetate, fructose, citrate, succinate, benzoate với nồng độ 1 g/l. Khả năng sinh trưởng của 23 chúng được ghi nhận sau 5 ngày nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí, có chiếu sáng với cường độ khoảng 5000 lux. 2.3.3.3 Phương pháp phân tích gene mã hóa 16S rRNA ADN của các chủng lựa chọn đã được tách chiết bằng bộ kit QIAmp ADN mini và Blood Hard Book theo quy trình của nhà sản xuất Qiagen. Phản ứng PCR để nhân đoạn gen 16S rARN với cặp mồi đặc hiệu 27F (5′- GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và 1527R (5′-AGAAAGGAGGTGATCC AGCC-3′). Quá trình nhân tiến hành với tổng thể tích 25 l bao gồm: 12,5 l PCR master mix; 0,75 l mồi (20 M) mỗi loại; 8 l dH2O; 3 l ADN khuôn. Việc nhân gen được tiến hành với chu trình nhiệt: 94 0C trong 5 phút; 32 chu kỳ lặp lại (94 oC trong 1 phút; 56 oC trong 50 giây; 72 oC trong 50 giây); 72 oC trong 7 phút và 4 oC để bảo quản. Sản phẩm PCR được phân tách trên gel agarose 1 % và tinh sạch bằng bộ kit AccuPrep PCR Purification theo quy trình của nhà sản xuất Bioneer. Tiếp đó sản phẩm PCR (kích thước khoảng 1500 bp) được gắn vào vectơ tách dòng, biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Dòng plasmid chứa đoạn gen mong muốn được tách chiết, tinh sạch và xác định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer. Việc so sánh trình tự nucletide và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng BTLP1 với các chủng vi khuẩn đại diện khác sử dụng phần mềm Blast, Bioedit, Clustal X và Treeview. 2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn - Ảnh hưởng của nhiệt độ: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trụ 100 ml và được nuôi trong ở 3 khoảng nhiệt độ khác nhau 14-16 oC, 27-30 oC, 38-40 oC. Mỗi thí nghiệm về khoảng nhiệt độ nuôi cấy làm lặp lại 3 lần. Các bình được nuôi ở điều kiện kỵ khí, có ánh sáng. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả. 24 - Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trụ 100 ml, nhiệt độ 27-30 oC dưới ánh sáng đèn sợi đốt, có 6 mức cường độ ánh sáng thí nghiệm là 0, 1000, 2000, 3000, 4000 và 5000 lux. Ở mỗi thí nghiệm về cường độ ánh sáng làm lặp lại 3 lần. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả. - Ảnh hưởng của pH: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trụ 10 ml chứa các môi trường DSMZ-27 được điều chỉnh với 9 mức pH: 4; 5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 và 9. Các bình được nuôi trong điều kiện kị khí, sáng, nhiệt độ 27 – 30 oC. Ở mỗi thí nghiệm pH làm lặp lại 3 lần.Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả. - Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1, các chủng lựa chọn được nuôi trong các bình thủy tinh hình trụ 10 ml chứa môi trường DSMZ-27 với nồng độ muối ban đầu được điều chỉnh ở 10 mức nồng độ: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4 và 5 %. Ở mỗi thí nghiệm nồng độ muối làm lặp lại 3 lần. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả. - Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trự 100 ml chứa các môi trường DSMZ-27 có thay thế hàm lượng nitơ trong NH4Cl bằng 7 nguồn nitơ từ pepton, (NH4)2SO4, ure, NH4NO3, KNO3, NaNO3 và Ca(NO3)2.4H2O. Ở mỗi thí nghiệm về các nguồn nitơ làm lặp lại 3 lần. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả. 25 2.3.5. Xây dựng phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 từ các chủng lựa chọn Tiến hành nuôi cấy các chủng VKTQH lựa chọn trong bình 500 ml có chứa môi trường DSMZ 27 và môi trường tối ưu thu được từ các điều kiện nuôi cấy ở trên. Sau đó tiến hành tách chiết, xác định hàm lượng CoQ10 theo các bước ở mục 2.3.2 và so sánh đánh giá kết quả hàm lượng CoQ10 thu được. 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm ± độ lệch chuẩn (Standard Deviation - SD). Sử dụng phương pháp xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007 và phần mềm Irristat 5.0 để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa là α = 0,05. 26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VKTQH CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CAO 3.1.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy Coenzyme Q10 cao Việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 cao trước tiên dựa trên khả năng sinh trưởng (tạo sinh khối) và hàm lượng CoQ10 tích lũy. 3.1.1.1.Hoạt hóa và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp 06 chủng VKTQH từ bộ sưu tập chủng giống của phòng CNSH Môi trường được hoạt hóa trên môi trường DSMZ 27. Sau 5 ngày nuôi tĩnh trong điều kiện kỵ khí, sáng, chúng tôi tiến hành đo độ huyền phù tế bào OD800 của các chủng và thu được kết quả thể hiện ở Hình 3.1A và Hình 3.1B (A) 27 (B) Hình 3.1. Khả năng sinh trưởng các chủng vi khuẩn tía quan hợp trên môi trường DSMZ 27 sau khi hoạt hóa Từ hình 3.1A cho thấy, cả 6 chủng đều có khả năng sinh trưởng tốt (∆OD800 > 1,5), trong đó 2 chủng FO2 và DQ4 sinh trưởng tốt hơn cả (∆OD800 > 1,8). Tương ứng với giá trị ∆OD800 của 2 chủng FO2 và DQ4, nhận thấy dịch chứa sinh khối thu được từ hai chủng này màu đỏ đậm hơn so với 4 chủng còn lại (Hình 3.1 B). Như vậy, trong 6 chủng nghiên cứu có 2 chủng FO2 và DQ4 có khả năng tích lũy sinh khối tốt hơn trong môi trường DSMZ 27. 3.1.1.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tích lũy Coenzyme Q10 cao Để tiến hành sang lọc các chủng VKTQH có khả năng tích lũy CoQ10 cao, 06 chủng VKTQH lựa chọn đều được tiến hành loại dịch thu sinh khối tươi (ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 oC trong 10 phút). CoQ10 được tiến hành chiết xuất theo phương pháp của Paterson và Buddie (1991) [72]. Cặn thô được hòa tan vào dung môi n–hexan. Sự có mặt của CoQ10 ở các chủng đã được định tính trên sắc ký bản mỏng (Hình 3.2). FO2 DQ1 DQ2 DQ3 DQ4 DQ5 28 Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng thể hiện sự có mặt của Coenzyme Q10 (Chú thích C: Đối chứng CoQ10 chuẩn) Từ kết quả Hình 3.2 cho thấy, cả 6 chủng VKTQH đều có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 (vạch ở vị trí tương ứng với vạch màu vàng đậm của đối chứng CoQ10 chuẩn). Trong đó, chủng FO2 và DQ4 cho kết quả đậm nhất, điều này có thể phần nào khẳng định chủng này có khả năng tổng hợp CoQ10 cao hơn 4 chủng còn lại. Để đánh giá rõ hơn về khả năng tích lũy CoQ10 của các chủng chúng tôi tiến hành phân tích định lượng hàm lượng CoQ10 bằng phương pháp HPLC. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hàm lượng Coenzyme Q10 của các chủng STT Ký hiệu chủng Hàm lượng CoQ10 (mg/g sinh khối tươi) 1 FO2 5,67 2 DQ1 0,95 3 DQ2 1,15 4 DQ3 1,30 5 DQ4 6,06 6 DQ5 2,09 C FO2 DQ1 DQ2 DQ4 DQ3 DQ5 CoQ10 29 Từ số liệu bảng 3.1 cho thấy, trong 6 chủng VKTQH thì có 2 chủng FO2 và DQ4 có khả năng tích lũy CoQ10 là cao hơn hẳn so với các chủng còn lại, đạt lần lượt là 5,67 mg/g và 6,06 mg/g sinh khối tươi. Kết hợp với khả năng sinh trưởng ở trên, chủng VKTQH FO2 và DQ4 đã được chúng tôi lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn 3.1.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào là đặc điểm quan trọng trong việc phân loại các vi khuẩn. Để xác định đặc điểm hình thái, các chủng lựa chọn được nuôi cấy trong môi trường DSMZ -27 bổ sung 2 % thạch vào môi trường dịch thể, ở điều kiện kỵ khí-sáng với cường độ chiếu sáng khoảng 5000 lux, nhiệt độ 27-30 oC. Tiến hành nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử đã được tiến hành khi chúng đang sinh trưởng ở giai đoạn logarit. Sau 5 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành quan sát hình dạng qua kính tử vi điện tử và quan sát huyền phù tế bào. Kết quả thu được như sau: Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng FO2: Khuẩn lạc chủng FO2 có màu đỏ đậm, bề mặt bóng, mọc nổi trên bề mặt thạch, đường kính từ 0,7-1,2 mm. Tế bào dạng hình que hơi lượn sóng, bề mặt xù xì, thô ráp. Kích thước từ (0,52-0,55) x (1,14-1,17) µm. Dịch huyền phù tế bào của chủng FO2 màu đỏ đậm, sinh sản bằng cách nảy chồi, không quan sát thấy “giọt” lưu huỳnh tích lũy trong tế bào. Chủng FO2 là vi khuẩn Gram (-). Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng DQ4: Khuẩn lạc chủng DQ4 hình tròn, bóng, màu đỏ đậm, bề mặt lồi, đường kính khoảng 1-2 mm. Tế bào dạng hình que, bề mặt xù xì, thô ráp. Kích thước từ (0,596-0,835) x (1,75-3,64) µm (Hình 3.3). Dịch huyền phù tế bào chủng DQ4 màu nâu đỏ, sinh sản bằng cách nảy chồi, không qua sát thấy “giọt” lưu huỳnh tích lũy trong tế bào. Chủng DQ4 là vi khuẩn Gram (-). 30 (A) (B) (C) (D) Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng FO2 (A, B) và của chủng DQ4 (C, D) Như vậy 2 chủng mà chúng tôi lựa chọn có đặc điểm như: dịch huyền phù màu đỏ đậm hoặc nâu đỏ, tế bào các chủng lựa chọn đều có dạng hình que hoặc với các kích thước khác nhau, không quan sát thấy “giọt” lưu huỳnh tích lũy trong tế bào. Theo khóa phân loại của Bergey’s, mặc dù khả năng sử dụng các hợp chất khử lưu huỳnh đều được phát hiện ở cả hai họ vi khuẩn tía lưu huỳnh và không lưu huỳnh, nhưng “giọt” lưu huỳnh chỉ quan sát được trong tế bào các loài vi khuẩn tía lưu huỳnh. Như vậy cả hai chủng trên đều thuộc nhóm VKTQH không lưu huỳnh. Cả 2 chủng này đều là vi khuẩn Gram (-), các đặc điểm hình thái trên tương tự với một số loài thuộc chi Rhodopseudomonas. Tuy nhiên, để xác định chính xác vị trí phân loại của các chủng lựa chọn, cần có các nghiên cứu sâu hơn. 5 mm 31 3.1.2.2 Khả năng sử dụng các nguồn carbon Ngoài khả năng cố định CO2, VKTQH có khả năng sử dụng được nhiều nguồn carbon hữu cơ cho sinh trưởng, một số nguồn carbon được sử dụng mang tính chất đặc trưng cho loài như một yếu tố để phân loại vi khuẩn. Để xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon cho sinh trưởng của 2 chủng FO2 và DQ4, chúng tôi đã nuôi cấy chúng trong môi trường DSMZ 27 dịch thể và trên đĩa thạch, trong đó acetate được lần lượt thay thế bằng một số nguồn khác cùng nồng độ 1 g/l, thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện kỵ khí sáng. Khả năng sử dụng các nguồn carbon: acetate, glucose, fructose, citrate, succinate, benzoate của 2 chủng được ghi nhận sau 5 ngày nuôi cấy và so sánh với khả năng cố định carbon của chủng Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408 trong nghiên cứu của Wong và cộng sự (2014) [74]. Kết quả so sánh khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau của 2 chủng lựa chọn với Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408 được thể hiện ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. So sánh khả năng sử dụng một số nguồn C của các chủng lựa chọn với Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408 Nguồn FO2 DQ4 Rhodopseudomo