Luận văn Nghiên cứu mối liên quan giữa hình thái phôi nang và đột biến nhiễm sắc thể của phôi trong thụ tinh ống nghiệm

Theo tác giả Majumdar (2017) tại thời điểm sinh thiết, các phôi nang đƣợc đánh giá dựa trên hình thái của chúng và đƣợc đánh giá thành ba nhóm: tốt, trung bình và xấu. Chất lƣợng tổng thể này dựa trên điểm số riêng đƣợc chỉ định cho từng phôi nang về mức độ mở rộng, khối tế bào bên trong (ICM) và các tế bào TE theo hệ thống tính điểm của Gardner D. Kvà Schoolcraft. Các phôi nang đƣợc nhóm lại nhƣ sau:  (1) Tốt: phôi nang với độ giãn rộng ≥3 và AA, AB và BA.  (2) Trung bình: phôi nang với độ giãn rộng ≥3 và BB.  (3) Xấu: phôi nang với độ giãn rộng ≥3 và ICM hoặc TE với điểm C [3]. Chúng tôi ƣu tiên tới hình thái của tế bào lá nuôi. Việc đánh giá nhƣ vậy sẽ dễ dàng cho việc so sánh mối liên quan về chất lƣợng giữa phôi nuôi cấy ngày 5 và đột biến NST (Bảng 2.1). Cách chọn phôi sinh thiết: những phôi có độ giãn rộng loại 3 trở lên mới đủ điều kiện sinh thiết và những phôi khi đã thoát màng hoàn toàn thì không sinh thiết vì phôi ở thời điểm đánh giá hình thái ngày 5 lúc này phát triển quá nhanh (phát triển bất thƣờng) và lúc này phôi khó để cố định đƣợc bằng kim giữ và quá trình bắn laser hay lấy cụm TE ra khỏi phôi cũng gây khó khăn cho quá trình thao tác. 46 Bảng 2.1. Đánh giá chất lƣợng phôi nang trong nghiên cứu theo tác giả Gardner D. K. (1999) và tác giả Majumdar (2017) Đánh giá chất lƣợng phôi nang Mô tả Tốt  Phôi có mức độ giãn rộng ≥3  Đánh giá ICM và TE là: AA, AB, BA. Trung bình  Phôi có mức độ giãn rộng ≥3  Đánh giá ICM và TE là: BB, CA. Xấu  Hoặc độ giãn rộng ≥3  Đánh giá ICM và TE là: AC, BC, CB, CC. Chúng tôi lựa chọn nhóm bệnh nhân cách nhau 5 năm là 21 - 25, 26 - 30, 31 - 35, 36 - 40 và ≥41 để nghiên cứu. 2.3.2 Phƣơng pháp sinh thiết phôi phôi nang theo tác giả Markus Montag (2014) và Costa - Borges (2017) [51], [52] Sinh thiết phôi giai đoạn phôi nang bằng laser, sự chính xác của chùm tia laser cho phép việc thao tác trên phôi ngƣời diễn ra dễ dàng, độ chính xác cao, an toàn cả với những trƣờng hợp có bất thƣờng về chiều dày của màng trong suốt. Sử dụng laser cho phép sử dụng nhiều lần với độ chính xác gần nhƣ tuyệt đối, dễ thao tác và độ tin cậy cũng nhƣ độ ổn định cao. Sử dụng với một cƣờng độ nhất định, các thiết bị sử dụng tia laser với năng lƣợng ánh sáng chỉ vừa đủ gây tổn thƣơng màng trong suốt mà không làm ảnh hƣởng đến các phôi bào bên trong. Và do không có đầu phát áp sát phôi mà thƣờng là xuyên qua đĩa nuôi cấy của phôi cho nên việc tạo ra nhiệt năng làm tổn thƣơng đến phôi là rất ít. Các chùm tia laser phát gián tiếp đƣợc dẫn qua môi trƣờng nuôi cấy có độ tập trung cao và chỉ đủ để xuyên thủng màng trong suốt với một mặt cắt hình tròn lý tƣởng. 47 - Sử dụng 2 đĩa petri sinh thiết phôi 35x10mm vô trùng, 1 đĩa để làm đĩa test (có tác dụng cân bằng áp lực trong kim và điều chỉnh góc kim sao cho song song với mặt ph ng thao tác) và 1 đĩa làm đĩa sinh thiết đối với bệnh nhân đƣợc chỉ định sàng lọc. Đĩa test đánh số bao gồm số thứ tự 1 dài, tiếp theo đánh số 1 và 2 là 2 vị trí 2 giọt môi trƣờng tráng kim viết nhỏ, dƣới đĩa ghi chữ TEST để đánh dấu và vị trí cho giọt PVP kí hiệu là p. - Đĩa sinh thiết đƣợc đánh số bao gồm số thứ tự bệnh nhân viết dài, số thứ tự phôi sinh thiết viết nhỏ đánh số từ 1 tới 5, tên bệnh nhân kí hiệu cho giọt PVP là p (Hình 2.9). - Dùng micropipet tạo 1 đĩa 2 giọt (để tráng kim) theo số thự tự đã ghi và 1 giọt PVP, 1 đĩa 5 đến 10 giọt môi trƣờng sinh thiết phôi (tùy vào dự kiến số phôi sinh thiết của mỗi bệnh nhân), thể tích mỗi giọt là 6,5µl. - Phủ dầu OVOIL dạng lỏng và để ổn định qua đêm (tối thiểu 6 giờ) trong tủ cấy 370C có CO2. Hình 2.9: Chuẩn bị đĩa test (A) và đĩa sinh thiết phôi (B) - Khởi động máy vi tính và phần mềm laser. - Gắn kim giữ (bên trái) và kim sinh thiết (bên phải) vào hệ thống vi thao tác. Căn chỉnh kim sao cho 2 kim cùng mặt ph ng thao tác. - Chỉnh áp lực của kim sinh thiết: hút 1 đoạn dầu OVOIL vào kim, tiếp theo hút 1 đoạn PVP (môi trƣờng này có độ nhớt cao sẽ giúp cho áp lực của kim ổn định hơn). Quan sát đoạn ranh giới giữa dầu và PVP khi hút vào và bơm ra để biết đƣợc độ ổn định của áp lực trong kim sinh thiết. Sau đó sẽ hút 1 đoạn A B 48 nhỏ dầu rùi hút 1 đoạn PVP và dùng đoạn dầu nhỏ để tạo áp lực quan sát. Nếu đoạn dầu đó đứng yên thì áp lực đã đƣợc cân bằng và có thể tiến hành sinh thiết trên phôi. - Đặt phôi vào giọt môi trƣờng sinh thiết, căn chỉnh sao cho nhìn r hình thái phôi, vị trí của nụ phôi và vị trí khối lá nuôi, lựa chọn vị trí của kim giữ gắn với phôi sao cho dễ sinh thiết, dễ lấy ra đƣợc khối tế bào lá nuôi mà tránh tối đa sự ảnh hƣởng tới nụ phôi, nơi có khoang quanh phôi lớn nhất hoặc phần tế bào lá nuôi đã bị thoát ra ngoài. Dùng kim sinh thiết xoay phôi để để phôi bào lựa chọn sinh thiết ở vị trí 3h và giữ cố định phôi bằng kim giữ tại vị trí 9h. - Dùng laser tạo lỗ thủng trên màng trong suốt của phôi tại vị trí 3h, kích thƣớc lỗ khoảng bằng kích thƣớc đầu kim sinh thiết đối với phôi độ 2, độ 3, độ 4 khi chƣa có hiện tƣợng thoát màng. Đƣa kim sinh thiết có đƣờng kính 25 µm qua lỗ thủng vừa hút vừa kéo khối tế bào lá nuôi ra khỏi màng trong suốt và dúng laser tiếp tục cắt đứt các liên kết của khối tế bào lá nuôi 1 cách nhẹ nhàng. - Đối với phôi độ 5 đã thoát 1 phần ra khỏi màng thì ta sẽ hút lấy 1 phần tế bào lá nuôi đó và dùng laser cắt đứt các liên kết để tách khối tế bào lá nuôi ra khỏi phôi và tránh tối đa việc gây tổn thƣơng tới nhiều tế bào xung quanh hoặc tới nụ phôi. - Nhả cụm tế bào lá nuôi đã sinh thiết nằm trong kim sinh thiết ra vị trí chính giữa và đƣa phôi ra vị trí khác, nhả kim giữ phôi sao cho phôi cách xa cụm tế bào sinh thiết để dễ dàng cho việc trả phôi về đĩa nuôi mà ko bị ảnh hƣởng tới cụm tế bào vừa sinh thiết. 49 Quy trình sinh thiết phôi nang tại trung tâm Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông theo tác giả Markus Montag (2014) [51]. . Hình 2.10: Các bƣớc sinh thiết phôi nang ở ngƣời (A) Cố định phôi và chuẩn bị hướng sinh thiết ở vị trí 3 giờ. (B) Dùng kim sinh thiết hút vài tế bào lá nuôi ở vị trí đã định. (C) ùng laser cắt đứt các tế bào lá nuôi đã được lấy với phôi. (D) Phôi bào sinh thiết ra chờ đem đi rửa và xét nghiệm. - Phôi sau sinh thiết đƣợc chuyển qua đĩa nuôi có đánh số giống đĩa sinh thiết và tiếp tục nuôi phôi trong môi trƣờng nuôi, nuôi trong tủ ấm Thermo 370C, 5% O2, 6%CO2, 89% N2. Sau rửa phôi bào, phôi sẽ đƣợc đông lại. 2.3.3 Phƣơng pháp rửa phôi bào và bảo quản tế bào phôi theo tác giả Costa - Borges (2017) [52] Cần chuẩn bị quần áo dài tay sạch, găng tay vô trùng, mũ chụp đầu. Qui trình chuẩn bị ống PCR và quá trình thao tác phải đƣợc tiến hành trong buồng vô trùng để tránh lây nhiễm. A B C D 50 * Tiến hành rửa tế bào: 1. Lấy đĩa chứa phôi bào đã sinh thiết ra. 2. Chuẩn bị đĩa rửa với môi trƣờng tráng là G - MOSP (15 - 20 ul) và môi trƣờng rửa là PBS 1X 1% PVP (15 - 20 ul). Nội dung ghi kí hiệu là số thứ tự phôi và tên bệnh nhân. Mỗi môi trƣờng chuẩn bị 3 giọt, vậy mỗi cụm tế bào sẽ đƣợc rửa qua 6 giọt để đảm bảo phôi bào đƣợc rửa sạch, không dính dầu (Hình 2.11). Hình 2.11: Đĩa rửa cụm tế bào sau sinh thiết. 3. Khi đã chuẩn bị xong, đặt đĩa sang bên cạnh (trong tầm với khi sử dụng kính hiển vi). 4. Mở nắp túi đựng ống PCR đã đƣợc vô trùng, dùng kẹp lấy từng ống một ra khỏi túi và chuyển ống lên các giá đựng ống PCR. Ngay lập tức đóng nắp ống. Viết tên kí hiệu số thứ tự phôi và kí hiệu tên bệnh nhân. CHÚ Ý: tránh chạm vào phía trong của nắp ống. 5. Với mỗi cụm tế bào, sử dụng 02 ống PCR 0,2ml. - 01 ống PCR sử dụng để chứa 2,5µl PBS 1X – 1% PVP đƣợc lấy từ giọt rửa cuối cùng sẽ sử dụng làm đối chứng âm trong bƣớc khuếch đại toàn bộ bộ gen sử dụng kit Sureplex. - 01 ống PCR còn lại cũng phải đƣợc kí hiệu trên nắp và bên cạnh ống tƣơng tự trên đĩa. Ví dụ: H1 có nghĩa là cụm tế bào của phôi số 1 của bệnh nhân kí hiệu là H (kí hiệu tên). 51 Hình 2.12: Ống PCR và cách ghi kí hiệu trên ống 6. Sử dụng pipette 10 µl chỉnh về 2,5µl và đầu tip có màng lọc, cẩn thận chuyển 2,5µl PBS 1X – 1% PVP có chứa cụm tế bào vào mỗi ống PCR đã kí hiệu trên, tránh chạm vào các vị trí khác trong ống. Thay đầu tip sau mỗi lần chuyển hoặc thay ngay khi nghi ngờ bị nhiễm đối với 1 mẫu. 7. Sau khi rửa xong, sử dụng kính hiển vi để quan sát cụm tế bào nằm trong ống PCR đảm bảo không bị mất vật chất di truyền. Tất cả các ống cho vào bullet đậy nắp chặt để đứng cẩn thận và bảo quản trong khay lạnh ở nhiệt độ thích hợp. Tất cả các bƣớc đều có sự kiểm tra một cách nghiêm ngặt tránh nhầm lẫn. CHÚ Ý: kiểm tra thông tin của bệnh nhân và số hiệu phôi trên đĩa phải trùng với kí hiệu đánh dấu trên đĩa nuôi cấy và trên ống PCR. Phải đảm bảo tế bào không quá sát với đầu tip của pipette hoặc chạm thành trong ống. 8. Sử dụng dung dịch PBS 1X – 1% PVP làm chứng âm: Từ giọt rửa 6, hút ra 2,5ul PBS 1X – 1% PVP. Cẩn thận chuyển lƣợng PBS 1X – 1% PVP vào ống PCR tƣơng ứng. - Chỉ sinh thiết những phôi có đủ tiêu chuẩn cho chuyển phôi hoặc đông lạnh. 52 Hình 2.13: Thao tác trên Bullet khi rửa phôi bào. 1. Tiến hành rửa cụm tế bào 2. Đưa cụm tế bào vào ống PCR 3. Đặt ống PCR ngay ngắn lên giá 4. Đưa giá cùng ống PCR vào Bullet 5. Đậy nắp đúng kí hiệu 6. Xoay chặt ullet 7. ullet chờ gửi đi 8. Mẫu đối chứng - Các mẫu vật phải đƣợc kiểm tra bởi 1 giám sát viên thứ 2 để đảm bảo không sai sót trong đánh dấu mẫu. - Khu vực sinh thiết phôi cho PGT-A cần đƣợc vệ sinh bằng nƣớc và dung dịch khử khuẩn sau mỗi lần thực hiện. - Đồng thời bật hệ thống lọc khí và bụi trong suốt quá trình thao tác. * Tiến hành bảo quản và vận chuyển mẫu: 1. Các phôi sau khi rửa đƣợc bảo quản trong PBS1X - 1% PVP và đƣợc đóng gói trong bullet vận chuyển mẫu sao cho đúng nhãn, đúng barcode của phôi. 8 7 6 5 1 2 3 4 53 2. Điền đầy đủ thông tin vào “Giấy yêu cầu phân tích ADN” trƣớc khi giao mẫu phôi. 3. Nhiệt độ bảo quản phôi bào: - Nếu thực hiện ngay các quy trình sau khi nhận phôi bào dƣới 24h thì bảo quản ở nhiệt độ: 4ᵒC - Nếu thực hiện ngay các quy trình sau khi nhận phôi bào trên 24h thì bảo quản ở nhiệt độ: -20ᵒC 4. Luôn giữ theo chiều th ng đứng các ống chứa mẫu. 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích NST của phôi Sàng lọc tiền làm tổ bằng phƣơng pháp giải trình tự gen thế hệ mới (Next GenerationSequencing/NGS) sử dụng bộ kít VERIEQ trên máy MiseQ. Kỹ thuật NGS bao gồm 4 giai đoạn chính sau đây: - Chuẩn bị thư viện (1): Thƣ viện là các phân đoạn DNA. Các mẫu DNA đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di và đƣợc phân đoạn (fragmentation) bằng siêu âm. Tiếp theo các phân đoạn DNA này đƣợc kết nối với các mã vạch (barcode) và đƣợc đánh dấu (indexing) cho các bƣớc phân tích máy tính tiếp theo. - Lai với các mẫu NA dò (probe) đặc hiệu (2): Sau khi đã chuẩn bị đƣợc thƣ viện là các phân đoạn DNA, các thƣ viện này sẽ đƣợc dùng để lai với các mẫu dò đƣợc thiết kế đặc hiệu cho các locus quan tâm. Trƣớc khi đọc, các thƣ viện này đƣợc kiểm tra chất lƣợng trên thiết bị Tapestation (Agilent) và định lƣợng bằng máy Qubit (Life Technologies). Dùng PCR với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại các đoạn DNA trên giá bám thành từng clone. - Đọc trình tự (3): Thƣ viện đƣợc đọc trên thiết bị giải trình tự gen thế hệ mới Miseq. Dữ liệu thu đƣợc đƣợc phân tích trên phần mềm bluefuse ở giai đoạn tiếp theo. 54 - Phân tích số liệu (4): Dữ liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Bluefuse. Phần mềm này cho phép phát hiện các đột biến, tính toán thống kê ý nghĩa giữa các mẫu nghiên cứu. Những sai khác hay đột biến phát hiện sẽ đƣợc so sánh và kiểm chứng với cơ sở dữ liệu đột biến gen ngƣời tại 2.3.5 Phƣơng pháp phân tích số liệu nghiên cứu * Về phương pháp thu thập số liệu: Các số liệu về hình ảnh phôi nuôi cấy ngày 5 đƣợc thu thập bằng cách chụp ảnh qua kính hiển vi đảo ngƣợc kính hiển vi đảo ngƣợc vi thao tác Carl zeiss (Đức). Các phôi của bệnh nhân đặt trong môi trƣờng nuôi cấy, giữ ấm bằng đĩa nhiệt ở nhiệt độ 37oC, thời gian chụp ảnh trong vòng 2 phút. Do đó đảm bảo tính chính xác của hình ảnh phôi mà không ảnh hƣởng đến chất lƣợng và tỷ lệ sống của phôi. Các số liệu về kết quả sàng lọc di truyền đƣợc nhận từ phòng di truyền có mã số hồ sơ và thông tin bệnh nhân. * Về phương pháp xử lí số liệu: - Sử dụng phần mềm phân tích số liệu SPSS22.0 - Sử dụng kiểm định Chi-square để kiểm định các biến độc lập, tính Odds ratio (OR) với Cofidence interval (95% CI) để đo lƣờng mức độ liên quan, T-Test, ANOVA so sánh các giá trị trung bình, Z-Test kiểm định 2 tỷ lệ. 2.3.6 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu - Trong một nghiên cứu lớn nhất mới đƣợc công bố năm 2010 về ảnh hƣởng của việc sinh thiết phôi bào lên sức khỏe của trẻ đƣợc sinh ra nhờ phƣơng pháp tiêm tinh trùng vào bào tƣơng của noãn và sàng lọc phôi trƣớc làm tổ, các tác giả đã nêu lên rằng không gây ảnh hƣởng gì đến sức khỏe của trẻ sơ sinh [53]. - Các thủ tục hành chính trong nghiên cứu đã tuân thủ đúng theo qui định và luật pháp Việt Nam đƣợc ban hành trong lĩnh vực Hỗ trợ sinh sản 55 - Nghiên cứu đƣợc sự cho phép của lãnh đạo Trung tâm Hỗ trợ sinh sản bệnh viện Đa khoa 16A Hà Đông. - Đối tƣợng nghiên cứu đồng ý, tự nguyện có đơn xin hỗ trợ sinh sản và cam kết thực hiện kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm và đƣợc thông tin đầy đủ về mục đích nghiên cứu. Các thông tin cá nhân của đối tƣợng đƣợc giữ kín theo đúng nguyên tắc. - Đánh giá hình thái các phôi theo tiêu chuẩn nghiên cứu và tiến hành kỹ thuật sinh thiết dƣới 2 phút để đảm bảo rằng không ảnh hƣởng tới chất lƣợng phôi. 56 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 3.1.1 Kết quả nuôi cấy phôi nang ngày 5 Biểu đồ 3.1: Kết quả nuôi cấy phôi nang ngày 5 Sau khi tiến hành tiêm tinh trùng vào bào tƣơng noãn cho 2017 trứng, chúng tôi thu đƣợc1818 phôi ngày 1 chiếm 90,13%. Số lƣợng phôi ngày 3 và ngày 5 lần lƣợt là 1754 và 1192 phôi tƣơng ứng với 86,96% và 59,10% (Biểu đồ 3.1). Tỷ lệ phôi ngày 3 phát triển lên thành phôi nang ngày 5 trong nghiên cứu của chúng tôi đạt tới 67,9%. Theo nghiên cứu của tác giả Dƣơng Đình Hiếu (2016), tỷ lệ phôi ngày 3 phát triển thành phôi nang ngày 5 là 42,8% [42]. Năm 2016, nghiên cứu của Minasi và cộng sự cũng cho thấy tỷ lệ phôi ngày 3 phát triển thành phôi nang ngày 5 chiếm 52,3% [26]. Nhƣ vậy, tỷ lệ hình thành phôi nang ngày 5 của chúng tôi cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiên cứu của các tác giả (p<0,001). Tất cả 200 cặp vợ chồng tham gia nghiên cứu đều có phôi nang ngày 5, không có trƣờng hợp nào không có phôi 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% thụ tinh ngày 3 ngày 5 T ỉ lệ % Tỉ lệ nuôi phôi nang 90,13% 86,96% 86,96% 59,10% 57 để chuyển. Tuy nhiên chỉ có 953 phôi đƣợc tiến hành sàng lọc nên trong nghiên cứu, chúng tôi chỉ xét trên 953 phôi này. 3.1.2 Phân bố tuổi mẹ của nhóm đối tƣợng nghiên cứu Tổng số bệnh nhân tham gia nghiên cứu là 200 bệnh nhân. Tuổi trung bình của nhóm đối tƣợng nghiên cứu là 33,04 ± 6,49. Trong đó, bệnh nhân trẻ tuổi nhất có chỉ định làm thụ tinh ống nghiệm (TTON) là 21 tuổi. Bệnh nhân lớn tuổi nhất tham gia nghiên cứu là 44 tuổi. Bảng 3.1. Phân bố tuổi mẹ của nhóm đối tƣợng nghiên cứu Nhóm tuổi Số lƣợng bệnh nhân Số lƣợng phôi Số phôi trung bình p 21 - 25 27 13,5 % 184 19,3% 6,81 ± 3,47 <0,001 26 - 30 49 24,5 % 285 29,9 % 5,81 ± 2,82 31 - 35 55 27,5 % 229 24,0 % 4,16 ± 2,36 36 - 40 36 18 % 125 13,2 % 3,47 ± 2,34 ≥41 33 16,5 % 130 13,6 % 3,94 ± 2,55 Tổng 200 953 4,77 ± 2,89 X ± SD (min - max) 33,04 ± 6,49 (21 - 44) Trong bảng 3.1 về phân bố tuổi, chủ yếu các bà mẹ ở độ tuổi từ 26 - 35 với 104 ngƣời (52,0%). Nhóm tuổi 21 - 25 chiếm tỷ lệ ít nhất (13,5%). Giải thích cho điều này là do độ tuổi 21 - 25 là tƣơng đối trẻ. So với các nhóm tuổi lớn hơn, tỷ lệ bệnh nhân ở độ tuổi này gặp phải vấn đề vô sinh hiếm muộn không cao. Thêm vào đó, thời gian mong con ở độ tuổi này cũng chƣa lâu, 58 nên sẽ đƣợc áp dụng các biện pháp khác trƣớc khi đƣợc điều trị bằng TTON. (Trừ các trƣờng hợp một số bệnh lý đã xác định r nguyên nhân, đƣợc chỉ định làm TTON ngay từ đầu). Trung bình tuổi mẹ trong nghiên cứu của chúng tôi là 33,04 ± 6,49 (min - max: 21 - 44). Tác giả Minasi và cộng sự đã khảo sát chất lƣợng hình thái trên 1730 phôi ngày 5 thu đƣợc từ 530 bà mẹ, đã ghi nhận trung bình tuổi mẹ là C [26], cao hơn trung bình tuổi mẹ ở nghiên cứu của chúng tôi. Trong 953 phôi ngày 5 trong nghiên cứu của chúng tôi, số lƣợng phôi của các bà mẹ 26 - 30 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (29,9%), số lƣợng phôi của các bà mẹ 36 - 40 tuổi là thấp nhất (13,2%). Các nhóm tuổi khác theo thứ tự giảm dần về số lƣợng phôi lần lƣợt là (31 - 35), (21 - 25), (≥41) với % tƣơng ứng là 24,0%; 19,3%; 13,6%. Nghiên cứu của tác giả Minasi đã ghi nhận nhóm tuổi mẹ có nhiều phôi nhất là 37 - 41 (42,02%) [26]. Cả 2 sự khác biệt về trung bình tuổi mẹ và nhóm tuổi có nhiều phôi nhất có thể do yếu tố địa dƣ, và độ tuổi sinh đẻ trung bình của các phụ nữ phƣơng tây thƣờng cao hơn phụ nữ châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng [54]. Bên cạnh đó tổng số phôi của mỗi nhóm tuổi còn phụ thuộc vào số bà mẹ trong nhóm tuổi đó nên chúng tôi tiếp tục tiến hành so sánh trung bình số phôi ngày 5 theo nhóm tuổi. Số phôi ngày 5 trung bình giảm dần theo các nhóm tuổi, trong đó cao nhất là 6,81 ± 3,47 ở nhóm tuổi 21 - 25 và thấp nhất ở nhóm tuổi 36 - 40 (3,47 ± 2,34). Điều này hoàn toàn phù hợp với những lý thuyết đã biết về khả năng sinh sản của ngƣời phụ nữ thông qua đánh giá dự trữ buồng trứng. Ngoài số lƣợng nang thứ cấp đếm đƣợc vào ngày 2 chu kỳ kinh, dự trữ buồng trứng đƣợc đánh giá thông qua chỉ số AMH. Tác giả Kelsey năm 2012 đã đƣa ra mô hình nồng độ AMH, trong đó chỉ ra AMH đạt đỉnh ở 25 tuổi sau đó giảm dần, đặc biệt AMH giảm r rệt sau tuổi 35 [55]. Do dự trữ buồng trứng giảm nên số trứng chọc hút đƣợc trong chu kỳ sử dụng kích thích buồng trứng phục vụ TTON giảm theo. Điều này cũng phản ánh phần nào lý do số phôi ngày 5 tạo đƣợc cũng giảm tƣơng ứng theo độ tuổi. 59 3.1.3 Tỷ lệ các loại đột biến NST của phôi nang ngày 5 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ các loại đột biến NST của phôi nang ngày 5 Có thể thấy tỷ lệ đột biến NST xảy ra rất lớn ở phôi nang ngày 5. Kết quả của chúng tôi trong 953 phôi sàng lọc, có 414 phôi bất thƣờng. 414 phôi bất thƣờng mang 614 đột biến NST gồm có đột biến số lƣợng, đột biến cấu trúc, đột biến khảm. Tỷ lệ đột biến khảm rất cao chiếm 56,68%; trong đó chủ yếu là đột biến khảm mất NST và thừa NST, chiếm tỷ lệ là 23,29% và 24,92%; còn lại đột biến khảm mất đoạn và thừa đoạn lần lƣợt là 4,40% và 4,07% (Biểu đồ 3.2). Ngoài đột biến khảm, còn có tình trạng đột biến số lƣợng cũng rất phổ biến, tỷ lệ xuất hiện đột biến số lƣợng NST là 36,65%; trong đó đột biến mất NST và thừa NST tƣơng đƣơng nhau lần lƣợt là 18,73% và 17,92%. Điều này tƣơng tự trong nghiên cứu của Franasiak và cộng sự (2014) khi nghiên cứu trên 15169 phôi, nhóm tác giả chỉ ra rằng tỷ lệ 0% 20% 40% 60% 80% 100% Mất NST Thừa NST Mất đoạn Lặp đoạn Khảm mất NST Khảm thừa NST Khảm mất đoạn Khảm thừa đoạn Axis Title Đột biến cấu trúc (6.67%) Đột biến khảm (56.68%) Đột biến số lƣợng (36,65%) , , 4,40% 4,07% 23,29% 24,92% 3,09% 3,58% 17,92% 18,73% 60 trisomy/monosomy xấp xỉ 1. Các đột biến thừa NST và mất NST là phổ biến và gần nhƣ chiếm tỉ lệ tƣơng đƣơng nhƣ nhau [25]. Tỷ lệ xuất hiện đột biến cấu trúc NST trong nghiên cứu của chúng tôi là thấp nhất chiếm 6,67%; trong đó đột biến mất đoạn và lặp đoạn lần lƣợt là 3,09% và 3,58%. 3.1.4 Tỷ lệ số lƣợng đột biến NST tính trên 1 phôi Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ số lƣợng đột biến NST tính trên 1 phôi Trong 1 phôi, có thể xảy ra 1 đột biến hoặc nhiều đột biến NST. Trong 953 phôi, các phôi không có đột biến NST là chủ yếu chiếm tỷ lệ 56,6%. Các phôi chứa 01, 02, 03 và 04 đột biến NST có tỷ lệ % giảm dần, lần lƣợt là 25,5%; 15,1%; 2,6%; 0,2% (Biểu đồ 3.3). Nhìn chung, tỷ lệ phôi có một và hai đột biến NST xảy ra chiếm đa số với tỷ lệ là 40,6 %; số phôi có nhiều hơn 2 đột biến NST chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ. Tỷ lệ phôi mang 1 đột biến NST là 0 1 2 3 456,6% 2,6% 0,2% 15,1% 25,5% 61 25,5%. Kết quả của chúng tôi cũng tƣơng tự nghiên cứu của Franasiak và cộng sự (2014) khi phân tích trên 15169 phôi nang sinh thiết, nhóm tác giả chỉ ra rằng có 26% phôi mang 1 đột biến NST [25]. Tuy nhiên kết quả này lại thấp hơn trong nghiên cứu của Liu và cộng sự (2012) khi phân tích trên 244 phôi nang, kết quả cho thấy tỷ lệ phôi nang mang 1 đột biến NST là 35,2% [56]. Sự khác biệt này có thể do đối tƣợng nghiên cứu của nhóm tác giả chủ yếu là bệnh nhân có tiền sử sảy thai nhiều lần và tuổi mẹ cao, chủ yếu ở độ tuổi từ 35 trở lên chiếm 82,4% trong khi nghiên cứu của tôi nhóm tuổi mẹ trên 35 chỉ là 26,8%. 3.1.5 Các nhiễm sắc thể đột biến thƣờng gặp Trong 953 phôi tiến hành sàng lọc, chúng tôi ghi nhận đột biến số lƣợng và cấu trúc xảy ra trên nhiều NST, tỷ lệ đột biến số lƣợng chiếm 36,6% cao hơn so với tỉ lệ đột biến cấu trúc là 6,68 % (biểu đồ 3.2) nên chúng tôi tiếp tục thống kê các NST đột biến số lƣợng liên quan tới các bệnh hay gặp trên lâm sàng. Bảng 3.2. Các NST đột biến thƣờng gặp NST đột biến Số phôi Tỷ lệ +13 25 2,62% +16 43 4,51% +18 16 1,68% +21 36 3,78% +22 19 1,99% +X 12 1,26% - X 32 3,36% Kết quả bảng 3.2 cho thấy: tỷ lệ trisomy 16 chiếm tỷ lệ cao nhất là 4,51%; tỷ lệ trisomy 22 chiếm 1,99%. 62 Chúng tôi cũng thống kê đƣợc tỷ lệ các đột biến trisomy 13, trisomy 18, trisomy 21 lần lƣợt là 2,62%; 1,68%; 3,78%. Các đột biến này gây nên hội chứng Patau, hội chứng Edwards và hội chứng Down trên lâm sàng. Đối với NST giới tính, chúng tôi ghi nhận trên NST X: đột biến trisomy xảy ra trên 12 trƣờng hợp chiếm tỷ lệ 1,26% và đột biến monosomy trên 32 trƣờng hợp chiếm tỷ lệ khá cao là 3,36%. Sự bất thƣờng NST ở giai đoạn phôi tiền làm tổ có thể sảy ra trên bất cứ NST nào. Đặc biệt là những NST mà chúng ta thƣờng ít nghĩ tới trong chƣơng trình sàng lọc tiền sinh lại có tỷ lệ bất thƣờng khá cao nhƣ 16, 22. Nhóm tác giả Rubio năm 2013, chỉ ra rằng các NST bị ảnh hƣởng nhiều nhất đối với cả bệnh nhân có phôi không làm tổ liên tiếp và bệnh nhân lớn tuổi là NST 22 và 16 sau đó là NST 13, 21, 18, XY, 15, 17 cho nhóm bệnh nhân bị phôi không làm tổ liên tiếp và 21, 15, 13, 18, 17 và XY ở nhóm bệnh nhân lớn tuổi [58]. Franasiak và cộng sự (2014) đã sử dụng phƣơng pháp RT - PCR và SNP để đánh giá 23 cặp NST của phôi nang. Kết quả là NST hay bị lệch bội nhất cũng là 13, 15, 16, 18, 19, 21 và 22 [25]. Các đột biến thƣờng gặp này cũng tƣợng tự nghiên cứu năm 2016 của Phan Thị Khánh Vy (22, 19, 16, 15, 21 và XY), đây cũng là sai lệch NST liên quan đến thai bất thƣờng có thể phát hiện đƣợc trong thời gian mang thai [58]. Đột biến trisomy 16 và trisomy 22 là 2 đột biến gây nên hiện tƣợng sảy thai sớm trƣớc tuần 12, đối với các bệnh nhân thực hiện kỹ thuật IVF thì việc sàng lọc 2 loại đột biến này có ý nghĩa cực kì quan trọng ảnh hƣởng trực tiếp đến tỷ lệ có thai cũng nhƣ tỷ lệ sinh sống. Các đột biến còn lại gây ảnh hƣởng tới sức sống, trí tuệ, khả năng sinh sản của trẻ gây nên nhửng ảnh hƣởng rất lớn về cả vật chất lẫn tinh thân cho bản thân mỗi đứa trẻ cũng nhƣ ảnh hƣởng tới gia đình và toàn thể xã hội. Có thể thấy kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả của những nghiên cứu đã thực hiện trƣớc đây. Chính vì thế, việc phát hiện các đột biến trên không những đã góp phần cải thiện tỷ lệ thành công trong chu kì điều trị mà còn góp phần cho ra đời những em bé hoàn toàn khỏe mạnh. 63 Hình 3.1, hình 3.2, hình 3.3 là 1 số kết quả sàng lọc trong nghiên cứu của chúng tôi. Hình 3.1. Hình ảnh của mẫu có bộ NST 47,XY,+21 Hình 3.2. Hình ảnh của mẫu có bộ NST 46,XX,+13,-16 Hình 3.3. Hình ảnh của mẫu có bộ NST 45,X 64 3.2. ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI PHÔI NANG NGÀY 5 TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM 3.2.1 Đánh giá mức độ giãn rộng của khoang phôi Biểu đồ 3.4: Đánh giá mức độ giãn rộng khoang phôi Trong tổng số 953 phôi nang xếp loại theo mức độ giãn rộng khoang phôi có: 530 phôi độ 5; 343 phôi độ 4; 80 phôi độ 3. Đa số là các phôi giãn rộng độ 5, chiếm tỷ lệ 55,61%; tiếp theo là độ 4 chiếm 35,99%; độ 3 thấp nhất chiếm 8,40% (Biểu đồ 3.4). Độ giãn rộng khoang phôi độ 5 và độ 4 chiếm tỷ lệ rất lớn chiếm 91,6%; độ giãn rộng các phôi đa số đều trong ngƣỡng phôi có độ giãn rộng tốt. Điều này cho thấy đa số các phôi đạt độ giãn rộng phù hợp với sự phát triển của phôi nang và phù hợp với việc tiến hành kỹ thuật sinh thiết đảm bảo tính chính xác cho nghiên cứu. Theo nhiều nghiên cứu độ giãn rộng tƣơng ứ