Luận văn Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn sinh hoạt chất kháng nấm fusarium gây hại trên cây cà chua (lycopersicon esculentum mill.)

irai, Shimomura, 1965). Đối với bệnh đạo ôn trên cây khoai tây, Blastixidin S ức chế mạnh mẽ sự phát triển của hệ sợi P. oryzae. Hình 1.5: Cấu trúc của polioxin Hình 1.6: Cấu trúc của blastixidin S 24  Validamyxin Validamyxin là chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus var limoneus sinh ra. Chủng này có thể sinh ra 5 thành phần có cấu trúc tương tự nhau và được định tên từ Validamyxin là B – F, cùng với validoxylamine A (Iwasa và cs, 1971). Chúng có tác dụng tiêu diệt nấm gây bệnh khô vằn ở lúa do Rhizoctonia spp gây ra. Đặc biệt, validamyxin A có thể đặc trị đối với bệnh thối thân, thối rễ, đốm đen trên nhiều loại hạt (Wakae, Matssura, 1975). 1.3.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn trên thế giới và Việt Nam.  Trên thế giới Hiện tượng cây trồng bị nhiễm nấm đã trở nên phổ biến và tăng lên đáng kể trong nhiều thập kỉ qua. Các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã bỏ ra nhiều năm để điều tra tình hình sử dụng chất kháng sinh từ XK trong việc ngăn chặn các bệnh ở thực vật. Bộ Nông nghiệp, Hải sản và thực phẩm Anh (MAFF) đã đưa ra chỉ định tất cả các chất kháng sinh dùng trong y học không được phép sử dụng trong nông nghiệp [9, 44]. Ở Hà Lan, 2 chất kháng sinh được phép sử dụng là streptomycin và validamyxin. Năm 1954, Trung Quốc đã phân lập được Streptomyces.sp 5406 có khả năng sinh chất kháng sinh phòng chống bệnh thối rễ và đã áp dụng trên 6 triệu ha trồng Hình 1.7: Cấu trúc validamyxin A 25 bông và đã thu được kết quả khả quan [29]. Năm 2002, Ấn Độ đã phân lập chủng Streptomyces sp.201 có khả năng sinh kháng sinh mới là z – methylheptyl iso – nicotinate. Chất kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F. solani gây hại trên rau màu. Tại Nhật Bản năm 2003, kháng sinh yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP – A0356. Hơn nữa, Nhật Bản cũng đã có những chế phẩm chống các bệnh đạo ôn, khô vằn rất có hiệu quả như blastidin S, kasugamyxin, validamyxin [39]. Năm 2011, tác giả Bảo – Xin Zhang và công sự đã tìm ra chất kháng mới milbemycins từ chủng XK đột biến S. bingchenggensis X-4 có khả năng phòng trừ sâu bọ [29]. Nhiều nước khác như Hàn Quốc, Thái Lan, Mỹ cũng đã rất thành công trong việc nghiên cứu và sử dụng chất kháng sinh từ XK để phòng và trị nấm gây bệnh cây trồng. Không những trong lĩnh vực nông nghiệp mà trên lĩnh vực y học và nhiều lĩnh vực khác, kháng sinh từ XK có vai trò hết sức quan trọng. Từ 1940 – 1958, Waksman đã phát hiện ra 22 hợp chất kháng sinh khác nhau từ XK, trong đó 3 loại: actinomycin, neomycin và streptomycin đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị một số bệnh ở người. Năm 1952, ông đã tìm ra được kháng sinh vacomycin từ XK từ đất tại Ấn Độ và Indonesia. Kháng sinh này có tác dụng điều trị các bệnh nhiễm trùng do VK [51]. Trong những năm gần đây, năm 2010, Alexander DC và cộng sự đã tìm ra được A54145 thuộc nhóm kháng sinh lipopeptit sản xuất bởi S. fradiae ức chế sự hoạt động của một số VK gây hại trên da động vật và con người [32].  Trong nước Nhìn chung, những nghiên cứu chất kháng sinh từ XK đã bắt đầu được quan tâm bởi các nhà khoa hoc. Năm 1994, tác giả Lê Gia Hy đã có công trình nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam [15]. Năm 1995, tác giả Lê Thanh Bình đã thực hiện đề tài nghiên cứu cơ chế kháng kháng sinh của một số chủng XK (Streptomyces) với kháng sinh do chúng tổng hợp 26 ra và ứng dụng trong việc phân lập, tạo giống VSV. Năm 2000, tác giả Biền Văn Minh đã nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng XK phân lập từ đất Bình – Trị - Thiên. Năm 2004, tác giả Đỗ Thu Hà đã nghiên cứu XK sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng. Năm 2006, tác giả Bùi Thị Việt Hà đã thực hiện đề tài nghiên cứu XK sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam. Tác giả Nguyễn Hoàng Minh Huy cũng đã tiến hành khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn S. dicklowii [9, 12]. Năm 2008, tác giả Bùi Thị Hà đã tiến hành nghiên cứu XK thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên [10]. Năm 2011, tác giả Nguyễn Huỳnh Minh Quyên tiến hành điều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ XK [19]. Hiện nay, ở nước ta cũng sử dụng nhiều loại chất kháng sinh từ XK như: validamyxin chống bệnh khô vằn, polioxin chống bệnh đen lá, streptomyxin chống bệnh bạc lá hại lúaMặc dù đã thu được những hiệu quả nhất định song việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật ở nước ta còn hạn chế do người nông dân đã quen với việc sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật. Bên cạnh đó giá thành của các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất của người nông dân. Vì vậy, cần phối hợp thống nhất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm sinh học với việc tuyên truyền kiến thức cho người nông dân. Cần xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm đem lại hiệu quả cao trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng, đồng thời bảo vệ MT và sức khỏe con người. 27 Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Hóa chất - Các loại đường chuẩn: glucozơ, saccarozơ, lactozơ, maltozơ, inositol, dextrin, metanol, butanoldo hãng Merck (Đức) sản xuất. - Các loại dung môi: n-butanol, etanol, etyl-acetat, iso-propanol, metanol, benzen do Nga và Trung Quốc sản xuất. - Các hóa chất khác: cao thịt, cao nấm men, pepton do hãng Merck sản xuất. KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, FeSO4.7H2O, tinh bột tan, gelatin, CMC, xenlulozơ do Trung Quốc sản xuất. 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu đề tài gồm: nồi hấp cao áp ALP (Nhật Bản), tủ sấy Memmert (Đức), kính hiển vi quang học, máy chụp hình kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật Bản), máy đo pH Pometer KL-009(II) (Trung Quốc), máy li tâm Rotina (Đức), kính lúp soi nổi Olympus (Nhật Bản), tủ cấy vô trùng Box laminer (Việt Nam), tủ lạnh National (Nhật Bản), tủ giữ mẫu Sanyo (Nhật Bản), máy lắc Gerhardt (Đức), cân điện Sartorius (Đức). 2.1.3. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu + Môi trường Gauze-1 (g/l): phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn Tinh bột tan : 20 g K2HPO4 : 0,5 g FeSO4 : 0,01 g MgSO4.7H2O : 0,5 g KNO3 : 0,5 g NaCl : 0,5 g Agar : 18 g Nước cất : đủ 1000 ml pH : 7 – 7,4 (Môi trường giữ giống có thêm: pepton 5 g; cao nấm men 10 g). + Môi trường Gauze-2 (g/l): nghiên cứu XK Nước chiết thịt : 30 ml Pepton : 5 g NaCl : 5 g Glucozơ : 10 g Agar : 18 g Nước cất : đủ 1000 ml pH : 7 – 7,4 28  Cách tạo nước chiết thịt: - Thịt bò tươi lọc sạch gân, mỡ bạc nhạc đem xay hoặc thái nhỏ. Cứ 500 g thịt thêm 1000 ml nước cất. - Đun nóng từ từ, giữ ở 500C trong 1giờ. Sau đó đun sôi 30 phút. - Để nguội và lắng trong dung dịch vừa đun. - Lọc bằng vải hoặc giấy lọc. + Môi trường ISP – 4 (g/l): nghiên cứu XK Tinh bột tan : 10 g K2HPO4 : 1 g MgSO4.7H2O : 1 g NaCl : 1 g (NH4)2SO4 : 2 g CaCO3 : 2 g Nước cất : đủ 1000 ml Dung dịch khoáng : 1ml pH : 7 – 7,4 + Môi trường ISP – 1 (g/l): nghiên cứu XK Tryton : 5 g Cao nấm men : 3 g Agar : 18 g Nước cất : đủ 1000 ml pH : 7 – 7,4 + Môi trường Potato Glucose Agar (PDA) (g/l): nuôi cấy , giữ giống nấm Fusarium. Khoai tây : 300g Glucozơ : 50 g Agar : 20g (nếu làm môi trường đặc) Nước cất : đủ 1000 ml  Cách chế dịch khoai tây: - Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. - Cân 300g, thái nhỏ, thêm 1000ml nước. - Đun sôi, nhỏ lửa trong 30 phút, lọc lấy dịch trong. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập xạ khuẩn  Lấy mẫu Sử dụng dụng cụ vô trùng gạt bỏ 5 cm lớp đất mặt và tiến hành lấy đất sâu 5cm. Đựng mẫu trong túi nilon, buộc kín miệng, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, thời 29 gian lấy mẫu. Bảo quản mẫu trong thùng xốp chứa nước đá được vận chuyển về phòng thí nghiệm và giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C.  Phân lập XK bằng phương pháp sấy khô (Nonomura et al, 1969)  Nguyên tắc - Tách rời các tế bào XK. - Nuôi cấy các tế bào trên môi trường đặc trưng để tạo ra KL riêng rẽ, cách biệt nhau.  Cách tiến hành - Các mẫu đất được làm khô ở nhiệt độ phòng trong 5 – 7 ngày, rồi xử lý ở nhiệt độ 90 – 1100C trong 10 – 30 phút để loại bỏ các VK không sinh BT (hầu hết các bào tử XK không chết ở điều kiện này). - Cân 1g đất cho vào bình tam giác 250 ml chứa 99 ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút sẽ được độ pha loãng là 1/100. Để có độ pha loãng là 1/1000 lấy 1 ml của dung dịch có độ pha loãng là 1/100 cho vào ống nghiệm có 9 ml nước cất vô trùng. Tiếp tục tiến hành pha loãng đến nồng độ mong muốn. - Từ dịch huyền phù ở độ pha loãng 10-4 nhỏ 0,1 ml lên bề mặt môi trường Gauze – 1 đã chuẩn bị sẵn trong các hộp Petri. Dùng que gạt vô trùng trang đều dịch huyền phù trên mặt môi trường cho 3 hộp, nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau 7 - 14 ngày mang các hộp Petri ra quan sát. - Các KL với hình thái khác nhau được chọn và cấy truyền sang MT Gauze - 1 mới để thuần khiết lần thứ hai. 2.2.2. Bảo quản giống bằng dầu khoáng  Nguyên tắc: - Đảm bảo tốt các điều kiện trong quá trình bảo quản để không làm thay đổi bản chất ban đầu của giống. - Làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV đồng thời ngăn cản sự sinh sản của chúng.  Cách tiến hành: - Khử trùng dầu khoáng 20% bằng cách hấp ở nhiệt độ 1210C trong 2 giờ. Sau đó, sấy khô ở 1700C trong 1 – 2 giờ, rồi để nguội. 30 - Cấy XK lên môi trường Guaze – 1 sau 14 ngày. Đổ lên bề mặt môi trường có XK phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm. - Trét parafin đặc lên miệng ống nghiệm và giữ ở điều kiện lạnh (-200C). 2.2.3. Quan sát hình thái xạ khuẩn  Quan sát đại thể Sử dụng que cấy đầu vuông vô trùng lấy một ít BT từ ống giống XK cho vào ống nghiệm chứa 5 ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi cấy chấm điểm vào giữa đĩa Petri. Ủ đĩa Petri trong tủ ấm 7 – 14 ngày, sau đó lấy ra quan sát đặc điểm KL (kích thước, màu sắc, hình dạng tính chất khuẩn lạc XK, màu sắc môi trường,...).  Quan sát vi thể (phương pháp xẻ rãnh thạch của Okamia Suzuki, 1968) Dùng dao vô trùng xẻ một rãnh thạch trong hộp Petri, cấy dịch BT xạ khuẩn xung quanh mép rãnh. Đặt 1 hoặc 2 lamelle vô trùng nghiêng 45° lên bờ của rãnh thạch vừa xẻ, đậy nắp đĩa Petri để vào tủ ấm 28 – 30°C. Sau 7-14 ngày lấy lamelle ra khỏi đĩa Petri tiến hành nhuộm màu và quan sát hệ sợi, cuống sinh BT,... dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100. 2.2.4. Xác định khả năng kháng nấm của XK  Phương pháp khoan lỗ thạch  Nguyên tắc: Nuôi cấy VSV đối kháng trên cùng một MT thạch, kiểm tra vòng kháng nấm, để xác định chủng XK sinh hoạt chất kháng nấm Fusarium.  Cách tiến hành: Bổ sung 2% (v/V) giống XK với mật độ 108 BT/ml vào bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường dịch thể, lắc 220 vòng/ phút trong 3-5 ngày. Sử dụng khoan nút chai vô trùng (d = 9mm) khoan lỗ trên đĩa môi trường PDA. Dùng que cấy vô trùng, cấy chấm điểm Fusarium (nuôi 3 ngày trên môi trường PDA) vào 2 phía đối diện của lỗ thạch. Sau đó, dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch nuôi cấy XK nhỏ vào lỗ thạch mới khoan. Đậy nắp hộp Petri để ở nhiệt độ phòng, sau 3-5 ngày tiến hành 31 kiểm tra kết quả. Nếu XK có khả năng sinh hoạt chất kháng Fusarium thì dịch kháng nấm khuếch tán xung quanh lỗ thạch tạo nên vòng kháng nấm, làm cho nấm không phát triển xung quanh lỗ thạch.  Đánh giá kết quả: Đánh giá khả năng kháng nấm dựa vào khoảng cách vô khuẩn D - d (mm). D - d ≥ 25 mm: Hoạt tính kháng nấm rất mạnh. D - d ≥ 20 mm: Hoạt tính kháng nấm mạnh. D - d ≥ 15 mm: Hoạt tính kháng nấm trung bình. D - d <10 mm: Hoạt tính kháng nấm yếu. Trong đó: D là đường kính vô khuẩn, d đường kính lỗ thạch. 2.2.5. Tuyển chọn các chủng XK sinh chất kháng nấm - Nhân giống: giống gốc từ MT bảo quản được hoạt hóa trên môi trường thạch nghiêng sau 7 ngày, thu huyền phù BT chuyển sang các bình tam giác dung tích 250ml chứa 50 ml môi trường Gauze - 1 dịch thể và nuôi lắc 220 vòng/phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. - Lên men: chuẩn bị bình tam giác dung tích 250 ml chứa 50 ml môi trường Guaze – 1 dịch thể. Tiến hành bổ sung 2% MT nhân giống (v/V) (mật độ 108 BT/ml) vào bình môi trường đã chuẩn bị. Quá trình lên men kéo dài 72 giờ ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc 220 vòng/phút. Sau đó thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lọc, bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Dựa vào kết quả D – d để chọn chủng XK sinh chất kháng nấm mạnh nhất. 2.2.6. Phương pháp định loại xạ khuẩn bằng kĩ thuật di truyền phân tử (Steyn, A.J.C. and Pretorius, 1992)  Tách chiết bộ gen xạ khuẩn theo quy trình của Qiagen  Nguyên tắc Thành tế bào của XK được phá vỡ giúp ADN được giải phóng ra. Protein và ARN được tách ra khỏi ADN nhờ các loại ARN-aza,, proteaza và các loại dung môi thích hợp. Cách tiến hành Nuôi cấy chủng XK đã tuyển chọn trong môi trường Gauze-1, trên máy lắc với 32 vận tốc 220 vòng/phút. Sau 72 giờ, lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf. Li tâm 8000 vòng/phút, trong 5 phút thu sinh khối xạ khuẩn. Huyền phù sinh khối với 54% TE và 25 µl lysozyme nồng độ 5 mg/ml được ủ ở 370C, trong 30 phút. Cho 30 μl SDS 10% và 3 μl protein K 20 mg/ml, đảo đều. Ủ ở 370C, trong 1 h Tiếp tục cho 800 μl chloroform vào hỗn hợp trên, lắc mạnh. Sau đó, tiến hành ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút để thu dịch nổi. Cho phenol (bằng thể tích dịch nổi thu được), vortex, ly tâm, thu dịch nổi Cho phenol : chloroform (bằng thể tích dịch thu được), vortex, ly tâm, thu dịch nổi (thực hiện 2 lần) Cho chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, vortex, ly tâm thu dịch trong (thực hiện 2 lần) Cho 10 μl RNase (20 μg/ul), ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng Cho 0,7 lần thể tích Isopropanol Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa Rửa tủa bằng 500 μl ethanol 70%. Bảo quản -20 oC.  Khuếch đại trình tự ARNr 16S Sử dụng cặp mồi có trình tự như sau để khuếch đại vùng ARNr 16S của xạ khuẩn: Mồi xuôi: 27F 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ Mồi ngược: 1492R 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT’-3’ Thành phần của phản ứng PCR thu gen được trình bày trong bảng 2.1 Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng PCR Nước 77,5 µl dNTP 10 µl Buffer 10 µl 27F (100 pmol) 0,25 µl 1492R (100 pmol) 0,25 µl Template (500 ng/µl) 1 ul Enzyme (10U/µl) 1 µl Tổng thể tích 100 µl 33 Chu trình nhiệt Tinh chế sản phẩm PCR Sản phẩm khuếch đại được tinh chế bằng bộ kít QIAquick PCR Purification  Quy trình thực hiện: Hỗn hợp sản phẩm được cho vào một eppendorf 1,5 ml Bổ sung buffer PB với tỉ lệ 5:1 (v/v) so với thể tích sản phẩm PCR, trộn đều Chuyển dung dịch vào cột tinh chế. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 30 – 60 giây, đổ bỏ dịch sau khi qua cột Bổ sung 750 µl buffer PE vào cột để rửa. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 30 – 60 giây, đổ bỏ phần dịch sau khi qua cột Ly tâm lại 9000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn buffer PE Chuyển cột sang một eppendorf 1,5 ml mới Bổ sung 30 – 50 µl Buffer EB (10mM Tris-HCl, pH 8,5) hay Mili Q vào chính giữa cột, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm 9000 vòng/phút trong 2 phút, thu phần dịch chứa gen và ở nhiệt độ - 20oC.  Giải trình tự ARNr 16S Sản phẩm khuếch đại sau khi tinh chế được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc).  Định danh chủng xạ khuẩn dựa vào trình tự ARNr 16S Kết quả giải trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit. Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST. Từ đó xác định tên loài của chủng nghiên cứu. 95°C 95°C 55°C 72°C 72°C 4°C 5 phút 30 giây 30 giây A phút 5 phút ∞ 1 2 x 30 chu kỳ 3 34 2.2.7. Khảo sát môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp 2.2.7.1. Lựa chọn MT lên men thích hợp - Nhân giống: giống gốc từ MT bảo quản được hoạt hóa trên MT thạch nghiêng sau 7 ngày, thu huyền phù BT chuyển sang các bình tam giác dung tích 250ml chứa 50 ml môi trường Gauze - 1 dịch thể và nuôi lắc 220 vòng/phút trong 48 h ở nhiệt độ phòng. - Lên men: chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml lần lượt 4 môi trường dịch thể ISP-1, ISP-4 và Gauze -1, Gauze -2. Bổ sung 2% thể tích MT nhân giống (v/V) vào các bình tam giác đã chuẩn bị với tỉ lệ 2% thể tích với (mật độ 108 BT/ml). Tiến hành nuôi lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Xác định hoạt tính kháng nấm của XK trong dịch lên men ở thời gian 24, 48, 72, 96, 120, 144 h bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Lựa chọn MT và thời gian nuôi cấy cho hoạt tính kháng nấm của XK đạt mức cao nhất. 2.2.7.2. Khảo sát nguồn cacbon thích hợp Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT đã chọn. Bổ sung thay thế nguồn cacbon bằng tinh bột tan, glucozơ, lactozơ, saccarozơ vào MT nuôi cấy với một lượng tương đương. Giống sau khi được hoạt hóa và nhân giống, tiến hành bổ sung một lượng MT nhân giống 2% (v/V) (108 BT/ml) và tiến hành lên men trên máy lắc, với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định ở trên), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nguồn cacbon thích hợp nhất. 2.2.7.3. Khảo sát hàm lượng cacbon thích hợp Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường đã chọn. Bổ sung thay thế các hàm lượng khác nhau của nguồn cacbon đã xác định ở trên ở các mức: 16, 18, 20, 22, 24g. Giống sau khi được nhân lên, tiến hành bổ sung một lượng MT nhân giống 2% (v/V) (108 BT/ml) và tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm 35 trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nồng độ cacbon thích hợp nhất. 2.2.7.4. Khảo sát nguồn nitơ thích hợp Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường đã chọn (có bổ sung nguồn cacbon với nồng độ thích hợp đã chọn). Bổ sung thay thế lần lượt nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 và KNO3 vào 50 ml dung dịch môi trường nuôi cấy. Sau đó, cấy vào MT lên men 1 lượng 2% (v/V) giống đã được nhân giống. Tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nguồn nitơ thích hợp nhất. 2.2.7.5. Khảo sát hàm lượng nitơ thích hợp Chuẩn bị bình tam giác 250 ml chứa 50 ml dung dịch môi trường (dịch thể) đã chọn, có bổ sung nguồn cacbon với nồng độ thích hợp. Bổ sung thay thế các hàm lượng khác nhau 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07g của nguồn nitơ đã xác định ở trên. Sau đó, cấy 2% (v/V) giống đã được nhân lên và tiến hành lên men trên máy lắc với tốc độ 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định), tiến hành thử hoạt tính kháng nấm trong dịch lên men bằng phương pháp khoan lỗ thạch để chọn nồng độ nitơ thích hợp nhất. 2.2.7.6. Khảo sát pH thích hợp cho xạ khuẩn sinh hoạt tính kháng nấm Cấy 2% (v/V) dịch nhân giống XK vào bình tam giác 250ml chứa 50 ml MT lên men, chỉnh pH ban đầu theo các mức khác nhau 6; 6,5; 7; 7,5; 8. Sau đó tiến hành lên men trong điều kiện lắc (220 vòng/ phút), ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian (đã xác định) thử hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Lựa chọn pH ban đầu thích hợp để XK sinh hoạt tính kháng nấm cao nhất. 2.2.7.7. Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho xạ khuẩn sinh chất kháng nấm Cấy 2% (v/V) XK đã được nhân giống vào 50 ml dung dịch MT (dịch thể) đã chọn trong bình tam giác 250ml, tiến hành nuôi lắc (220 vòng/ phút) ở các nhiệt độ 36 25, 28, 30, 35, 370C. Tiến hành lên men sau thời gian (đã khảo sát được) và thử hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khoan lỗ thạch. Lựa chọn nhiệt độ thích hợp để XK sinh hoạt tính kháng nấm cao nhất. 2.2.7.8. Động học quá trình lên men tổng hợp chất kháng Fusarium từ XK Mục đích của việc nghiên cứu động học lên men là để xác định thời gian và điều kiện tối ưu cho việc hình thành chất kháng nấm của chủng XK nghiên cứu. Tiến hành lên men chủng đã được tuyển chọn cùng các đều kiện nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ với hàm lượng đã xác định và thời gian thích hợp. Tiến hành xác định sinh khối, hoạt tính kháng nấm và pH tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 132, 144 h. Vẽ đồ thị động học của quá trình sinh tổng hợp chất kháng Fusarium của chủng XK nghiên cứu. Xác định thời điểm tốt cho hoạt tính kháng nấm và thu sinh khối của chủng XK. 2.2.8. Phương pháp tách chiết chất kháng nấm  Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan trong các dung môi hữu cơ của chất kháng nấm, tiến hành li tâm không những loại bỏ được sinh khối mà còn loại bỏ được các chất độc hại ra khỏi dịch nuôi cấy.  Cách tiến hành: Sau khi nuôi cấy XK trong các điều kiện MT cụ thể đã xác định, trên máy lắc 220 vòng/phút. Sau đó, tiến hành li tâm 5000 vòng/ phút để tách riêng dịch nuôi cấy và sinh khối.  Phần sinh khối: Phần sinh khối được chiết bằng các loại dung môi khác nhau ( etanol, axeton, etyl axetat, metanol), với tỉ lệ là 1: 1. Hỗn hợp dung môi sinh khối này được lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó li tâm 5000 vòng/ phút để loại sinh khối. Cuối cùng dùng dung môi chiết được thử hoạt tính kháng nấm Fusarium bằng phương pháp khoan lỗ thạch. So sánh kết quả đo vòng kháng khuẩn để lựa chọn dung môi thích hợp để tách chất kháng nấm từ sinh khối XK. 37  Dịch nuôi cấy Dịch nuôi cấy sau khi loại sinh khối có thể được tách chiết bằng các loại dung môi hữu cơ khác nhau như: n – butanol, etyl axetat, n – propanol và iso – butanol tỷ lệ giữa dịch chiết và dung môi là 1 : 1. Hỗn hợp dịch nuôi cấy và dung môi được lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó thử hoạt tính kháng nấm Fusarium trong dung môi và trong dịch chiết bằng phương pháp khoan lỗ thạch. So sánh kết quả đo vòng kháng khuẩn để lựa chọn dung môi thích hợp để tách chất kháng nấm từ dịch nuôi cấy XK. 2.2.9. Xác định ảnh hưởng của dịch lên men đến khả năng nảy mầm của hạt và sự sinh trưởng của cây cà chua Dịch lên men XK đã kiểm tra hoạt tính kháng nấm được pha loãng đến các nồng độ: 1, 10, 20, 50 và 100%. Ngâm hạt cà chua vào dịch pha loãng ở các tỉ lệ trên, sau 24 h vớt ra, đặt vào hộp Petri có lót bông thấm nước. Mỗi hộp đặt 150 hạt. Để hộp này ở nhiệt độ phòng, theo dõi khả năng nảy mầm của hạt sau 4 ngày. Đối chứng ngâm hạt trong nước cất. Tính tỉ lệ nảy mầm và theo dõi sự sinh trưởng của cây ở lô đối chứng và các lô thí nghiệm. 2.2.10. Thử nghiệm khả năng kháng Fusarium của dịch lên men XK trên cây cà chua - Nguyên tắc: Tính số lượng cây bị nhiễm bệnh dựa trên các dấu hiện ban đầu của thân, lá của cây cà chua sau khi xử lý dịch lên men chủng XK nghiên cứu. - Phương pháp gây nhiễm: + Chuẩn bị dịch Fusarium: Nấm Fusarium được nuôi cấy trên môi trường PDA, để ở nhiệt độ phòng trong 3 – 5 ngày. Dùng que cấy lấy các bản thạch mỏng có tơ nấm và hạch nấm cho vào bình tam giác có sẵn 20 ml nước cất vô trùng. Lắc dung dịch trên máy lắc 1000 vòng/phút trong 15 phút. + Cách tiến hành: Tưới, phun trực tiếp dịch nấm Fusarium, dịch kháng nấm không pha loãng của XK vào đất hoặc cây trồng. 38 - Bố trí thí nghiệm như sau: + Cơ chất gieo trồng và chế độ chăm sóc của 4 lô thí nghiệm trên đều như nhau: • Đất trồng: đất sạch Gino được cung cấp bởi Công ty TNHH Nguyên Nông - Gino (146/ 6A Võ Thị Sáu, quận 3, Tp.HCM). • Chậu cây: có kích thước 36 x 42 cm. • Số lượng cây: 10 cây/chậu. Mỗi lô thí nghiệm 50 cây. • Tưới cây 2 lần/ ngày đảm bảo đủ ẩm vào buổi sáng và chiều mát. • Sau khoảng 20 ngày cần bổ sung phân đạm (5g/20 lít nước/ 200 cây) để đảm bảo cung cấp chất dinh dưỡng đầy đủ cho cây trồng phát triển. + Đảm bảo đồng nhất các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, nước và phân bón) ở các lô thí nghiệm. - Các lô thí nghiệm được bố trí như bảng sau: Công thức Kí hiệu Tiến hành Mục đích CT 1 ĐC 1 Không gây nhiễm (A), không sử dụng (B) vào đất, hạt giống. Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển bình thường của cây khi không có xử lí. CT 2 ĐC 2 Sau khi gieo hạt 5 ngày tiến hành gây nhiễm (A) vào đất và không xử lí thêm (B). Theo dõi sự tấn công của nấm Fusarium trên cây cà chua. CT 3 TN 1 - Hạt không được ngâm trong dịch (B). - Phun (B) vào đất trước khi trồng cây con. - Phun (A) vào đất sau khi trồng cây con 5 ngày. Xác định khả năng phòng nấm Fusarium nhờ chất kháng nấm của xạ khuẩn 39 Công thức Kí hiệu Tiến hành Mục đích CT 4 TN 2 - Hạt không được ngâm trong dịch (B) - Phun (A) vào đất trồng. - Sau khi thấy xuất hiện dấu hiệu bệnh đầu tiên mới bắt đầu phun (B) vào đất. Xác định khả năng trị nấm Fusarium nhờ chấ