Luận văn Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp huperzine A của chủng vi nấm nội sinh penicillium sp. lđl4.4 từ cây thạch tùng răng cưa

có thể phát triển trong một phạm vi pH nhất định và sự hình thành chuyển hóa các chất cũng chịu ảnh hư ng của giá trị pH [30]. Kim và cộng sự (200 ) đã báo cáo rằng, nồng độ các hợp chất polysaccharide ngoại bào và sinh khối sợi nấm đạt giá trị cao nhất tại pH = 6 và sẽ giảm dần khi giảm pH xuống ,0 hay tăng dần pH lên 9,0 [31] . Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh tổng hợp các chất tạo sinh khối sợi phụ thuộc vào m i loại nấm và điều kiện nuôi cấy. Nguồn dinh dưỡng carbon khác nhau có ảnh hư ng trực tiếp đến khả năng phân giải và hấp thụ dinh dưỡng của tế bào. Glucose và sucrose là 2 nguồn carbon mang lại hiệu quả sinh tổng hợp các hợp chất polysaccharide và tạo sinh khối sợi cao nhất đối với nấm. Nguồn dinh dưỡng nitrogen được sử dụng cho sự tăng trư ng hệ sợi nấm là amoniac, muối amoni, axit amin và nitrogen hữu cơ phức tạp [32]. Nitrogen hữu cơ được sử dụng rộng rãi nhất cho hầu hết các loại nấm và cho hiệu quả sinh trư ng của hệ sợi nấm trong môi trưòmg dịch thể cao hơn nguồn vô cơ. 20 Ngoài dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy cũng là một yếu tố ảnh hư ng đến sự sinh trư ng của hệ sợi nấm trong môi trường dịch thể. Nhiều nghiên cứu cho thấy, tốc độ lắc là cơ s duy nhất để cung cấp oxy hòa tan cho quá trình sống của sợi nấm trong môi trường dịch lòng, ảnh hư ng đến khả năng cuộn xoắn cùa hệ sợi nấm và ảnh hư ng trực tiếp đến hình thái kích thước pellet cũng như sinh khối sợi nấm thu được 1.4.2. Các nguồn dinh dư ng trong sinh trưởng của vi nấm Dinh dưỡng nấm mốc thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng. Đó là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡng nội bào. Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bên ngoài. Khi tế bào trạng thái đối với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được sử dụng – dinh dưỡng nội bào. Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục vụ cho sinh trư ng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào. 1 2 1 D dưỡ b Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm mốc bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác như đường, rượu, acid hữu cơ, acid amin, Hầu hết các loài nấm mốc đều không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulase. Vì vậy, nấm mốc không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose. Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm mốc sử dụng đặc biệt là đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các loài nấm mốc. Glucose được coi như nguồn carbon vạn năng đối với vi sinh vật. Trong môi trường có một h n hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trư ng tốt sẽ được ư tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế tiếp các nguồn carbon trong canh trường được gọi là 21 tính đa dưỡng của nấm mốc. Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết. Những loại nấm mốc cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất như nhau. Các loài khác nhu sẽ đồng hòa các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Các nguồn carbon khác thường được sử dụng cho dinh dưỡng nấm mốc như saccarose, maltose, lactose, các acid béo, 1 2 2 D dưỡ ơ Nguồn nito cần thiết cho tế bào nấm men thường là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường. Các hợp chất hữu cơ chứa nito của tế bào là các acid amin, các nucleotic purin và pyrimidin, protein và một số vitamin. Nguồn nito vô cơ được nấm mốc sử dụng tốt là các muối amoni acetat, amoni lactat, amoni maltat và amoni sucxinat. Trong môi trường có muối amoni đặc biệt là sunfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng. Các nguồn nito hữu cơ thường là h n hợp các acid amin, các peptid, các nucleic, Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên làm nguồn nito hữu cơ. Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc các acid amin vừa là nguồn nito vừa là nguồn carbon dinh dưỡng. Chúng đồng thời tham gia vào phản ứng cetoacid để tạo thành các acid amin mơi như là chất cho nhóm amin (NH2-). 1 2 3 D dưỡ y ố ô ơ Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm mốc bao gồm các nguyên tố phospho, kali, magie và lưu huỳnh, - Phospho: tham gia vào các thành phần quan trong của tế bào, như các nucleoproteic, acid nucleic, polyphosphate, phospholipid, Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và trong vận chuyển năng lượng. Nấm mốc sử dụng rất tốt nguồn phospho vô cơ là 22 orthophosphate. Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau khi được hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp. Người ta thường dùng KH2PO4, K2HPO4 hoặc dung dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P và K. - Lưu huỳnh: là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (SH-) của một số enzyme CoA. B i vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợp được protein. Những chất chứa lưu huỳnh như acid amin, vitamin và một số hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men. Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amoni và nguồn lưu huỳnh. - Các ion K+, Ca2+, Mg2+ cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên men. Thông thường ion K+ được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sunfat, ion Ca2+, Mg2+ thường có mặt trong nước sinh hoạt, tuy nhiên khi hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ quá cao (nước cứng), cần phải loại bớt hai ion này (làm mềm nước). Giúp cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật hiệu quả hơn. 1 2 D dưỡ á ưở Những chất kích thích sinh trường là các vitamin, các base purin và pyrimidin. Những nhân tố sinh trường cơ bản đối với nấm mốc là vitamin nhóm B, tiamin và acid paraaminobenzic. Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp bionin). Trong các thí nghiệm nuôi cấy phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc quy mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai tây, làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường. 1.5. TẠO GIỐNG VI SINH VẬT BẰNG ĐỘT BIẾN 1.5.1. Khái niệm chung 23 a) Khái niệm đột biến sinh học: Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền cấp độ phân tử (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền cho các đời sau [34] - Đột biến là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, ngẫu nhiên, không định hướng cơ thể sống trong điều kiện tự nhiên. - Đa số là đột biến gen lặn và có hại, một số ít có lợi và có ý ngh a rất lớn đối với quá trình tiến hóa và chọn giống. b) Phương pháp tạo đột biến [33] - Tạo đột biến bằng việc sử dụng các tác nhân vật lí - Tạo đột biến bằng các tác nhân hóa học - Tạo giống bằng phương pháp sốc nhiệt c) Cơ s khoa học của chọn giống bằng phương pháp đột biến [33] - M i một kiểu gen nhất định của một giống chỉ cho một năng suất nhất định. Trong điều kiện nuôi trồng tối ưu thì thì m i giống chỉ cho một năng suất tối đa nhất định (mức phản ứng của kiểu gen). - Để thu được hiệu năng cao hơn thì phải thay đổi vật chất di truyền của giống do đó ta sử dụng các tác nhân vật lí, hóa học tác động vào bộ máy di truyền để gây đột biến. 1.5.2. Quy trình tạo giống bằng phương pháp gây đột biến Quy trình tạo giống mới bằng phương pháp gây độ biến gồm các bước : Bước 1: Xử lí mẫu vật bằng tác nhân gây đột biến Bước 2: Chọn lọc các thể đột biến có kiểu hình mong muốn Bước : Tạo dòng thuần chủng 1.5.2.1. Xử í ẫ ậ bằ á y đ b ế a) Sử dụng tác nhân vật lí (Bảng 1.1) 24 Bảng 1.1. Sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến Loại tác nhân Cơ chế tác động Cách sử dụng Các loại tia phóng xạ (tia X, tia gama, tia bêta, chùm nơtrôn...) Kích thích và iôn hóa các nguyên tử khi chúng đi xuyên qua các mô sống. Các phân tử ADN, ARN trong tế bào chịu tác động trực tiếp của các tia phóng xạ hoặc chịu tác động gián tiếp của chúng qua quá trình tác động lên các phân tử nước trong tế bào (đặc biệt là các gốc OH- và H2O2 sinh ra có tác dụng ôxi hóa rất mạnh) làm thay đổi cấu trúc phân tử ADN gây ra đột biến gen và đột biến NST. Chiếu xạ với cường độ và liều lượng thích hợp lên đỉnh sinh trư ng của thân, cành hoặc hạt phấn, bầu nhụy, mô thực vật nuôi cấy. Tia tử ngoại Không có khả năng xuyên sâu và ion hóa các nguyên tử mà chỉ có khả năng kích thích, nhưng khi được tế bào hấp thu nó cũng gây ra đột biến gen và đột biến NST. Nhiệt độ Tăng giảm nhiệt độ đột ngột (sốc nhiệt) làm cơ chế nội cân bằng của cơ thể không kh i động kịp gây chấn thương bộ máy di truyền Thay đổi nhiệt đôi môi trường cách đột ngột b) Sử dụng tác nhân hóa học (Bảng 1.2): Bảng 1.2. Cơ chế tác động của tác nhân hóa học gây đột biến Loại tác nhân Cơ chế tác động 5BU(5 brôm uraxin) Thay thế T, chuyển đổi cặp A-T thành G-X qua nhân đôi ADN: A-T => A-5BU => G-5BU => G-X. Etyl metal sunfonat (EMS) Gây đột biến thay thế cặp G-X thành cặp A-T NMU Thay thế G –X thành X- G hoặc A-T Acridin Gây đột biến mất hoặc thêm cặp Nu, nếu được chèn vào mạch khuôn cũ gây đột biến thêm cặp Nu Côsixin Rối loạn hình thành thoi vô sắc dẫn đến rồi loạn phân li cặp nhiễm sắc thể 25 1 5 2 2 C ọ ọ á ể đ b ế ó ể ì ố Khi trong quần thể giống xuất hiện các đột biến, dựa vào những đặc điểm có thể nhận biết để tách các cá thể mang đột biến có lợi ra khỏi quần thể giống. 1 5 2 3 Tạ dò ầ Sau khi nhận biết được thể đột biến mong muốn, ta cho chúng sinh sản để nhân lên thành dòng thuần chủng theo đột biến tạo được. 1.5.3. Đột biến chủng bằng tia UV Tia UV có thể tạo ra đột biến giữa 2 vòng pyrimidine (cystosine hoặc thymine) để tạo nên 2 liên kết giữa chúng. Tia cực tìm tạo ra cầu nối dimer giữa các nhóm cytosine gần nhau. Việc dimer cytosine có thể tạo ra adenine (thay vì guanine) được bổ sung vào các sợi mới. Quá trình sao chép AND, CC (thể dại) thành TT (đột biến). Mặc dù, các đột biến điểm dimer cytosine trên ADN có thể được sửa chữa b i hệ thống của tế bào nhưng không thể hết. Kết quả là cặp GC, GC (tự nhiên) thành AT, AT (đột biến) sau khi chiếu UV. 1.5.4. Đột biến chủng MNNG (N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine) NTG là một trong những hóa chất gây đột biến được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu hiện nay, có công thức phân tử C2H5N5O3. NTG gây đột biến mạnh thuộc lớp alkyl hóa. Dạng alkyl hóa gây đột biến bằng cách thêm nhóm methyl hoặc nhóm ethyl trên các bazo, đó tạo sự thay đổi khi kết cặp của các bazo trên sợi ADN. Cơ chế của sự đột biến này là đột biến điểm, làm biến đổi bazo gây ra sự kết cặp sai. NTG gây ra là các đột biến điểm, thay thế cặp GC bằng cặp AT, một số rất ít các trường hợp dẫn đến dịch chuyển khung đọc hoặc mất đoạn [34]. 1.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ [35] 1.6.1. Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography – TLC) Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc. Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua 26 pha t nh trên đó đã chấm h n hợp các chất cần tách. Pha t nh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong h n hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha t nh và dung môi làm pha động. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Rf = Trong đó: - a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. - b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm. - Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l. Ngoài ra, khi sắc ký liên tục không xác định được tuyến dung môi, vị trí vết chất thử trên sắc đồ có thể xác định bằng hệ số dịch chuyển tương đối Rr. Hệ số dịch chuyển tương đối Rr được xác định bằng tỷ số giữa khoảng cách dịch chuyển của vết chất thử và khoảng cách dịch chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu được sắc ký trong cùng điều kiện và trên cùng bản mỏng với mẫu thử: Rr  27 Trong đó: + a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm. + c là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết chất chuẩn, tính bằng cm. 1.6.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC ) 1 6 2 1 K á ệ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (hay còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong h n hợp [36]. Sắc ký lỏng hiệu lăng cao do Csaba Horváth biên soạn lần đầu cho bài báo Pittcon 1970 của ông, ban đầu chỉ ra rằng áp lực cao được sử dụng để tạo ra dòng chảy cần thiết cho sắc ký lỏng các cột đóng [37]. Ban đầu, máy bơm chỉ có một áp suất 500 psi ( 5 bar). Đây được gọi là sắc ký lỏng cao áp , hoặc HPLC, là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong h n hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa h n hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. M i thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của m i thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột. Sắc ký lỏng hiệu suất cao bây giờ là một trong những công cụ mạnh mẽ nhất trong hóa học phân tích [36]. Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: - Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption liquid chromatography). - Sắc ký phân bố (partition chromatography). - Sắc ký ion (ion chromatography). 28 - Sắc ký rây phân tử (size exclusion gel permeation chromatography). Trong sắc ký phân bố nói chung, pha t nh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: - Pha t nh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý: sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). - Pha t nh liên kết hóa học với chất nền : sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography). Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau: - Hòa tan mẫu phân tích. - Phù hợp với đầu dò. - Không hòa tan hay làm mòn pha t nh. - Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao. - Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade). Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng h n hợp dung môi MeOH nước trước, rồi ACN nước hay THF nước. Với một h n hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các h n hợp MeOH, ACN và THF hoặc ethylenglycol với nước có độ rửa giải tương đồng. Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn [36]. 1 6 2 2 y ắ Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong h n hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn nhau: Pha t nh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của h n hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp thụ hoặc phân bố 29 vào pha t nh tùy thuộc vào bản chất của cột và chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách [36]. Các chất sau khi ra khỏi cột tách sẽ được phát hiện b i bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in. 1 6 2 3 Cơ ở ý yế Quá tình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha t nh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theobaor chất pha t nh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách của các chất ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký chúng ta có sắc đồ [36]. 1 6 2 y ắ ạ ệ ố C Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau [36]: - Hệ thống bơm: Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 – 400 bar) - Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi: Bình chứa dung môi bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ 0.45 µm) và đuổi khí hòa tan. - Hệ tiêm mẫu: Để đưa mẫu phân tích vào cột. Có nhiều phương phap tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động. Mẫu thử (dạng lỏng hay rắn) đều phải hòa tan trong dung môi thích hợp rồi lọc qua màng lọc 0.45µm trước khi tiêm. - Cột sắc ký lỏng HPLC: Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar 30 + Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pah t nh có đường kính rất nhỏ ( .5, 10 µm). + Đường kính cột: 4 hoặc 4.6 mm Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu sử dụng đúng cách. Ví dụ dung môi có tính chất axit mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay các nguyên liệu bẩn thì tuổi tho của cột sẽ bị giảm. - Detector trong HPLC: Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất cần phân tích mà sử dụng hay detector hấp thụ UV – VIS. Nguyên lý hoạt động của detector UV – VIS dựa trên nguyên lý hoạt động của phương pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa. 1 6 2 5 Ứ dụ C Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng cso ứng dụng chính: - Định tính và thử độ tinh khiết: Thời gian lưu của các chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ. - Sắc ký điều chế: Qua quá trình sắc ký các chất được tachs ra và dịch rửa giải được hứng riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất. - Định lượng: Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lơn trong định lượng chất trong h n hợp và xác định giới hạn tạp chất. Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha t nh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả 31 năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong l nh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi nấm nội sinh Penicillium sp. LĐL 4.4 phân lập từ lá cây Thạch tùng răng cưa phân bố tại Đà Lạt - Việt Nam, đã được xác định có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A. Chủng Penicillium sp. LĐL4.4 hiện đang được lưu giữ tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học. - Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN. 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị thí ngiệm Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN. Hầu hết dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: - Cân phân tích (Mettelex, Toledo - Tủ cấy vô trùng (Esco, Singapore) - Máy lắc ổn nhiệt (Gerharat, Đức) - Tủ lạnh (Sanaky, Nhật) - Kính hiển vi điện tử (Nikon, Nhật) - Pipetman 10 µl, 200 µl, 1000 µl - Máy li tâm (Eppendof, Đức) - Nồi khử trùng (Tommy, Nhật) - Tủ ấm nuôi cấy VSV (Esco, Singapore) - Lò vi sóng (Electrolux, Nhật) 32 . 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi nấm 2 2 1 1 ươ á ô y Nuôi cấy lỏng: - Môi trường nuôi cấy được chuẩn bị trong các bình tam giác 500ml chứa 150ml môi trường lỏng, khử trùng 121OC, 1 atm trong 30 phút. - Các sợi nấm thuần được cấy chuyển sang các bình tam giác đựng các môi trường lỏng. - Sau khi cấy xong, các bình tam giác được nuôi lắc 150 vòng phút, 28 O C trong thời gian -5 ngày. Nuôi cấy trên đĩa thạch: - Chuẩn bị các môi trường có bổ sung thêm agar, khử trùng 121OC, 1 atm trong 30 phút. - Cấy chuyển chủng sang các đ a peptri chứa thạch môi trường. - Sau khi cấy xong, các đ a thạch được nuôi trong tủ ấm 2 OC trong thời gian 3-5 ngày. Bảng 2.1. Các môi trường nuôi cấy Môi trường Thành phần (g L) PDA 200g Khoai tây; 10g Glucose; 16g Agar; 1L Nước cất PDB 200g Khoai tây; 10g Glucose; 1L Nước cất 2 2 1 2 ươ á b q Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: Sau khi phân lập riêng rẽ trên các đ a petri chứa môi trường PDA, chủng vi nấm được cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng thích hợp đã được khử trùng. Các ống thạch nghiêng sau khi cấy được nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 2 OC trong thời gian 3-5 ngày. Các ống giống sau khi phát triển sẽ được bảo quản 4OC. 33 Khoảng -6 tháng, các ống giống được lấy ra và cấy truyền lại vào môi trường mới. Phương pháp bảo quản giống lâu dài: Chủng vi nấm sau khi phân lập riêng rẽ được bảo quản lâu dài trong môi trường glycerol 20% nhiệt độ lạnh sâu -86 O C. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu một số đ c điểm sinh h c của chủng nấm [38] Chủng vi nấm được nuôi cấy trên 6 môi trường khác nhau (đặc trưng của chi Penicillium) để quan sát đặc điểm hình thái và vi hình thái. Thành phần dinh dưỡng của các môi trường được thể hiện bảng 2.2. Bảng 2.2. Môi trường khảo sát đặc điểm hình thái Môi trường Nguồn Carbon (g l) Nguồn Nitơ (g l) Nguyên tố khoáng (g l) CYA 3g Sucrose 0,5g Yeast extract 0,1g K2HPO4 3mg NaNO3 5mg KCl 5mg MgSO4.7H2O 5mg FeSO4.7H2O 5mg ZnSO4.7H2O 5mg CuSO4.5H2O CYA+ NaCl 5% 3g Sucrose 0,5g Yeast extract 0,1g K2HPO4 3mg NaNO3 0,5g NaCl 5mg KCl 5mg MgSO4.7H2O 5mg FeSO4.7H2O 5mg ZnSO4.7H2O 5mg CuSO4.5H2O Oat meal agar 6g Oat meal Yeast Extract 0,3g Yeast extract 34 Sucrose 0,5g Peptone CREA 5mg KCl 5mg MgSO4.7H2O 5mg FeSO4.7H2O 5mg ZnSO4.7H2O 5mg CuSO4.5H2O Malt Extract Agar 2g Dextrose 2g Malt Extract 0,6g Peptone Các bước tiến hành: i. Nuôi cấy nấm trên đ a peptri chứa các môi trường. Theo dõi hằng ngày thời gian phát triển, hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc trên các môi trường nuôi cấy khác nhau. ii. Nuôi cấy, quan sát vi hình thái: Dùng que cấy lấy một miếng thạch có sợi nấm phát triển kích thước khoảng 0,5 cm x 0,5 cm đặt lên lam kính rồi lấy lamen đậy lên bề mặt miếng thạch. Sau đó đặt lam kính chứa lamen đó vào trong đ a peptri. Nuôi 2 OC trong khoảng thời gian -7 ngày cho đến khi sợi nấm mọc lan đều bề mặt lamen. Soi dưới kính hiển vi quang học; quan sát hệ sợi, bào tử, cuống bào tử, vách ngăn, của chủng nấm. 35 2.2.3. Các phương pháp gây đột biến chủng 2.2.3 1 ươ á y đ b ế bằ UV [39] 1 ml dịch nuôi cấy chủng Penicillium sp. LĐL 4.4 (pha loãng nồng độ 10-6) được chuyển vào các đ a peptri khử trùng, gạt đều dịch nuôi cấy trên đ a để tế bào phân bố đều, bật tia UV (50W – 254 nm), khoảng cách từ nguồn UV đến đ a là 15 cm. Sau 5, 10, 15, 20 và 0 phút chiếu UV, các đ a được chuyển vào bóng tối để 1 giờ đồng hồ nhiệt độ phòng. 100 µl dịch đã chiếu được trang lên đ a PD