Luận văn Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất saponin từ hoa tam thất panax pseudoginseng wall

gày nay, trong y học hiện đại chi Panax là nguồn nghiên cứu có giá trị, thu hút các nhà khoa học nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thƣ. Theo báo cáo của Yun, dịch chiết của củ P. ginseng ức chế sự tăng sinh của khối u do axit dimethylolbutanoic gây ra và kéo dài thời gian sống sót của chuột [13]. Sau nhiều năm nghiên cứu, các nghiên cứu chống ung thƣ của các hợp chất ginsenoside đã trở thành một điểm nóng với nhiều nghiên cứu chuyên sâu từ chuyển hóa ginsenoside, cơ chế chống ung thƣ và các khía cạnh khác. Một số lƣợng lớn các thí nghiệm in vivo và in vitro đã chứng minh rằng các hợp chất ginsenoside thể hiện các hoạt động chống ung thƣ đáng kể. Cơ chế chính của các hợp chất chống ung 18 thƣ có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sau: (1) bắt giữ chu kỳ tế bào, cảm ứng apoptosis và ức chế tăng sinh khối u; (2) tác dụng ức chế di căn tế bào ung thƣ; (3) kích hoạt hệ thống miễn dịch. Một nghiên cứu cho thấy rằng sự phát triển tế bào ung thƣ cổ tử cung ở ngƣời (HeLa) bị ức chế bởi ginsenoside Rd theo cách phụ thuộc vào thời gian và liều lƣợng, với giá trị IC50 là 150,5 ± 0,8 µg/ml sau 48 giờ ủ [14]. Các nghiên cứu sâu hơn đã chứng minh rằng ginsenoside Rb1 tác động đối kháng canxi để đảo ngƣợc quá trình sản sinh tế bào ung thƣ [15]. Notoginsenoside Ft1 hạn chế sự tăng sinh tế bào thông qua p38 kinase protein kích hoạt mitogen và protein kinase điều hòa ngoại bào. Nó đã đƣợc chứng minh là có hiệu quả điều trị tiềm năng đối với u nguyên bào thần kinh ở ngƣời [16]. Ngoài ra, trong một nghiên cứu của Li và cộng sự, polysaccharide P. notoginseng đã đƣợc thêm vào môi trƣờng nuôi cấy của các tế bào u gan H22 trong ống nghiệm và tiếp tục đƣợc sử dụng để thử nghiệm trên chuột mang tế bào ung thƣ. Kết quả cho thấy polysaccharide P. notoginseng ức chế sự phát triển của tế bào H22 và kéo dài thời gian sống của chuột mang tế bào ung thƣ. Việc phát hiện ra polysaccharide chống ung thƣ sẽ mở rộng việc lựa chọn các loại thuốc điều trị miễn dịch cho u gan [17]. Theo nghiên cứu của Lee và cộng sự cho thấy polysaccharide P. ginseng là một chất chống ung thƣ không độc hại, kích hoạt miễn dịch, có thể kích hoạt các đại thực bào để sản xuất nitơ hoạt động chất trung gian, do đó làm trung gian cho tác dụng tiêu diệt khối u [18]. 1.2.2.3. Tác dụng chống viêm P. ginseng là một trong những loại dƣợc liệu đƣợc sử dụng rộng rãi để điều trị chống viêm. Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy các hợp chất ginsenoside có nhiều tác dụng dƣợc lý chống các bệnh viêm nhiễm. Ginsenoside Rh2 làm giảm đáng kể tình trạng viêm đƣờng ruột ở chuột do dextran natri sulfat gây ra [19]. Ginsenoside F2 đƣợc kỳ vọng là thành phần thảo dƣợc tự nhiên thay thế với tác dụng phụ thấp để điều trị chứng viêm da do tetradecanoyl phorbol alcolhol acetate ở chuột [20]. Ginsenoside Rg5 có tác dụng dƣợc lý chống viêm thần kinh [21]. Ginsenoside Rh1 có thể kích thích hiệu quả hệ thống thần kinh trung ƣơng để cải thiện trí lực và hiệu suất trí tuệ [22]. Ngoài ra, ảnh hƣởng của hợp chất ginsenoside-K 19 (G-CK) trên tế bào T ở chuột bị viêm khớp do collagen cho thấy G-CK có thể là một loại thuốc đầy hứa hẹn để điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp [23]. Theo báo cáo của Dong, con đƣờng trao đổi chất của các hợp chất ginsenoside (ginsenoside Ra1, Rb1, Rb2, Rc) in vivo chủ yếu đƣợc chuyển thành ginsenoside đã đƣợc khử oxy hóa (ginsenoside Rd) thông qua hệ vi sinh đƣờng ruột [24]. Sau đó, nó đƣợc hấp thụ vào tuần hoàn máu để phát huy tác dụng chống viêm [25]. 1.2.2.4. Tác dụng bảo vệ gan Theo các nghiên cứu gần đây, chi Panax có tác dụng bảo vệ gan và cơ chế của nó bao gồm ngăn chặn xơ hóa, ức chế tạo khối u, loại bỏ vi rút và ức chế quá trình oxy hóa gây hại [26, 27]. Nghiên cứu của Qi cho thấy anthocyanin của quả P. ginseng có thể ngăn chặn tổn thƣơng thận do cisplatin gây ra [28]. Các oligopeptit trong P. ginseng có thể làm giảm đáng kể mức độ yếu tố hoại tử khối u-α, interleukin 1β và interleukin 6 trong huyết thanh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng oligopeptides trong P. ginseng có thể bảo vệ gan tế bào bằng cách cải thiện phản ứng viêm huyết thanh do rƣợu. 1.2.2.5. Tác dụng bảo vệ thần kinh Với sự gia tăng của già hóa dân số và áp lực cuộc sống xã hội, con ngƣời ngày càng và tiếp xúc nhiều hơn với nguy cơ mắc các bệnh về hệ thần kinh. Thần kinh rối loạn bao gồm bệnh Alzheimer (AD), bệnh Parkinson, động kinh và phiền muộn. Các hợp chất ginsenoside ngày càng đóng một vai trò quan trọng trong việc điều trị các bệnh hệ thần kinh, đặc biệt là ở hệ thần kinh trung ƣơng. Một số các cơ chế đã đƣợc xác định để biểu hiện hoạt động bảo vệ thần kinh bao gồm loại bỏ các gốc tự do để kích hoạt chức năng não, ức chế stress oxy hóa và viêm thần kinh. Các nghiên cứu cho thấy rằng ginsenoside Rb2 có tiềm năng trở thành một loại thuốc chống co giật [29]. Pseudoginsenoside F11 cũng là một lựa chọn để làm chậm quá trình thoái hóa thần kinh. Zhang và cộng sự phát hiện ra rằng pseudoginsenoside F11 có tác dụng có lợi đối với những thay đổi bệnh lý AD trong chuột [30]. 1.2.2.6. Tác dụng điều hòa miễn dịch Các nghiên cứu dƣợc lý hiện đại cho thấy một số hợp chất từ chi Panax có khả năng điều hòa miễn dịch thông qua nhiều cách, chẳng hạn nhƣ cơ quan 20 miễn dịch (tuyến ức, lá lách), tế bào miễn dịch (đại thực bào, tế bào đuôi gai,) và cytokine [31]. Các hợp chất ginsenoside và polysaccharide là những thành phần hoạt động chính của P. ginseng với một loạt các hoạt động trong điều hòa miễn dịch. Các saponin từ P. notoginseng sở hữu các hoạt động bổ trợ miễn dịch và tăng cƣờng miễn dịch dịch thể và tế bào đáp ứng với ovalbumin ở chuột khi dùng ovalbumin [32]. 1.2.2.7. Tác dụng bảo vệ tim mạch Khi bệnh tim mạch đang trở thành nguyên nhân chính gây tử vong và sự hạn chế của các loại thuốc sử dụng trong trị liệu, sự nghiên cứu và phát triển của hoạt chất mới từ cây thuốc là rất cần thiết trong lâm sàng và thực nghiệm hiện nay. Các nghiên cứu về các bệnh tim mạch chủ yếu tập trung vào các ginsenoside monome từ P. ginseng thay vì toàn bộ dịch chiết. Các ginsenoside đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là Rg1, Rb1, Rh1, Re và Rd. Ginsenoside Re có tác dụng điều trị rối loạn nhịp. Tuy nhiên, nó có thể gây ngộ độc hoặc tác dụng phụ khi lạm dụng quá nhiều [33]. P. notoginseng cũng là một loại thuốc chống đau thắt ngực hiệu quả. Nó đã đƣợc xác nhận trong nghiên cứu của Lei rằng dịch chiết nƣớc của P. notoginseng đã cải thiện chức năng tim mạch [34]. Nghiên cứu cho thấy P. notoginseng làm tăng lƣu lƣợng máu mạch vành và co bóp tim mà không làm thay đổi nhịp tim. 1.2.2.8. Cầm máu và hoạt huyết hóa ứ của P. notoginseng Củ của P. notoginseng đƣợc biết đến nhƣ một loại thảo dƣợc để tăng cƣờng lƣu thông hoạt huyết và cầm máu. Dencichine là một axit amin đặc biệt đƣợc phân lập từ rễ của P. notoginseng. Nó có thể rút ngắn thời gian chảy máu của chuột và giảm kích hoạt một phần thời gian thromboplastin và thời gian thrombin, trong khi nồng độ của fibrinogen trong huyết tƣơng sẽ tăng phụ thuộc vào liều lƣợng. Ngoài ra, các hoạt chất cầm máu chứa các ion canxi và quercetin [35]. 1.2.2.9. Các tác dụng sinh học khác Các nghiên cứu gần đây, chỉ ra rằng ginsenosides có thể làm dịu cơn đau do hóa chất độc hại gây ra trong thí nghiệm động vật. Ví dụ, ginsenoside Rf ức chế Ca2+ giảm bớt các phản ứng đau do kích thích hóa học gây ra [36]. Cơ chế giảm đau của glycopeptides trong nhân sâm có thể liên quan đến việc 21 điều chỉnh tiền viêm cytokine và sự cân bằng động của các cytokine chống viêm [37]. Ngoài ra, các bộ phận thân, lá và hoa của P. notoginseng có tác dụng kiềm chế hệ thống thần kinh trung ƣơng, đƣợc đặc trƣng bởi an thần, ổn định và cải thiện giấc ngủ. Ginsenoside Rb1 có tác dụng phối hợp với các loại thuốc trầm cảm. 22 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, MỤC TIÊU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thực vật: Đối tƣợng nghiên cứu là hoa của cây tam thất Panax pseudoginseng Wall. thu hái vào tháng 7/2019, tại Phó Bảng, Hà Giang và đƣợc TS. Nguyễn Thế Cƣờng (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) giám định tên khoa học. Mẫu tiêu bản đƣợc lƣu tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2.2. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Mục tiêu của luận văn Nghiên cứu một số thành phần saponin của hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall. 2.2.2. Các nội dung nghiên cứu Phân lập một số hợp chất saponin từ hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất bằng các phƣơng pháp hóa lý. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu hóa học 2.3.1.1. Hóa chất, thuốc thử Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích gồm có: - Các dung môi: Methanol, n-hexan, dichloroform, ethyl acetat, nƣớc cất, - Thuốc thử: Acid sufuric 10% trong nƣớc cất 2.3.1.2. Máy móc, thiết bị và dụng cụ - Sắc ký cột: Các loại cột có đƣờng kính 0,6-8cm, chiều dài từ 25-100 cm. 23 - Chất nhồi cột: Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), silicagel pha thuận 0,040-0,063 mm (240-430 mesh, Merck), silicagel pha đảo YMC (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.). - Bản mỏng tráng sẵn pha thuận DC-Alufolien 60 F254 (Merck) và bản kính pha đảo RP-18 F254S (Merck). - Hệ thống máy cất quay, làm lạnh EYELA (Nhật Bản) - Đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 và 365 nm. - Cân phân tích Ohaus, độ chính xác 0,1 mg. - Cân kỹ thuật Precisa (Thụy Sĩ), độ chính xác 0,01 g. - Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân BRUCKER AVANCE AM500 FT-NMR tại Viện Hóa học – Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Dụng cụ thủy tinh: Pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu 100ml, 250 ml, 500 ml, ống đong, phễu thủy tinh. 2.3.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết, phân lập các hợp chất 2.3.2.1. Phương pháp xử lý mẫu Các mẫu nghiên cứu đƣợc xử lý sơ bộ để ổn định hoạt chất sau đó tiến hành chiết mẫu với MeOH, tạo dịch chiết thô. Quy trình xử lý gồm các bƣớc sau: Bước 1: Mẫu đƣợc rửa sạch để loại tạp bẩn sau đó đƣợc sấy khô hoặc phơi khô. Bước 2: Cân lƣợng mẫu khô thu đƣợc và xay mẫu. Bước 3: Mẫu nghiên cứu đƣợc tiến hành chiết trên thiết bị chiết siêu âm (Ultrasonic 2010, 950W) ở nhiệt độ 40-50oC, thời gian chiết mỗi lần tối thiểu 60 phút, sử dụng dung môi MeOH. Bước 4: Dịch chiết của 3 lần chiết đƣợc lọc qua giấy lọc đƣợc gộp lại và tiến hành cất loại dung môi dƣới áp suất giảm ở nhiệt độ dƣới 50oC thu đƣợc dịch cô MeOH. Bước 5: Cân dịch chiết và bảo quản mẫu trong các lọ đựng cặn chiết để phục vụ nghiên cứu thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học. 24 2.3.2.2. Phương pháp tạo dịch chiết phân đoạn Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu hoa tam thất đƣợc lấy lƣợng 5 g mẫu khô, cho vào bình định mức 10 ml. Bước 2: Đánh số thứ tự và ký hiệu các bình chiết mẫu. Thêm dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực, dung môi đƣợc thêm đến vạch định mức. Bước 3: Toàn bộ các bình chiết đƣợc cho lên máy lắc ngang, lắc đều cho dung môi thấm đều mẫu. Để lắng trong khoảng 1-2 giờ. Bước 4: Lọc mẫu, phần dịch lọc đƣợc cất loại dung môi trên thiết bị cất quay, dịch thô thu đƣợc cho vào lọ nhỏ phục vụ cho việc kiểm tra lƣợng vết chất và khả năng hòa tan mẫu nghiên cứu. Bước 5: Sử dụng sắc ký bản mỏng TLC và hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với tỷ lệ thích hợp để đánh giá mẫu thô thu đƣợc. 2.3.2.3. Phương pháp phân lập chất - Sắc kí lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ đƣợc chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển trên lớp mỏng, theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu đƣợc một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ đến khi hiện màu. - Sắc kí cột: Nguyên lí tách của sắc kí cột cũng nhƣ của các loại sắc kí khác: một mẫu thử đƣợc nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thƣờng là silica gel, nhôm oxyt).Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh. Một 25 dung môi (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau. Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thƣờng và pha đảo. Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040- 0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 μm, FuJisilisa Chemical Ltd.). - Hệ thống sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Hệ thống bao gồm Detector UV-vis bƣớc sóng từ 200-900 nm, bộ lấy mẫu tự động (fraction collector) kèm theo với các dãy ống nghiệm kích thƣớc thay đổi tùy theo lƣợng mẫu, hệ thống bơm với khả năng điều chỉnh áp từ 1 đến 10 bar, tốc độ dòng từ 1ml/phút đến 200 ml/phút. Cột tách SNAP loại C8, C18 với dung lƣợng từ 100g đến 450g mẫu đầu vào. Các thiết bị sử dụng nêu trên thuộc Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sử dụng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR - Nuclear Magnetic Resonance) là một phƣơng pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, nó có ý nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo các phân tử phức tạp nhƣ các hợp chất thiên nhiên. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân, một chiều và hai chiều đƣợc đo trên máy Bruker Advance AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn đƣợc sử dụng là TMS (tetramethyl silane). Các kỹ thuật phổ cộng hƣởng từ hạt nhân sử dụng: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều: 1H-1H COSY, NOESY, HSQC, HMBC. 26 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ HOA Panax pseudoginseng Wall. 3.1.1. Phân lập các hợp chất Mẫu Hoa tam thất (Panax pseudoginseng Wall.) sau khi thu hái về đƣợc rửa sạch, sấy khô dƣới nhiệt độ 50oC sau đó xay nhỏ thành bột mịn. Bột khô của mẫu Hoa tam thất (Panax pseudoginseng Wall.) đƣợc đem chiết 3 lần với metanol có dùng siêu âm, dịch chiết sau đó đƣợc cô quay dƣới áp suất giảm thu đƣợc cặn chiết metanol (500 g). Cặn chiết metanol đƣợc hòa vào nƣớc, sau đó chiết phân lớp lần lƣợt với các dung môi là n-hexan, diclometan thu đƣợc các cặn chiết n-hexan (80g), cặn chiết diclometan (10g), dịch nƣớc và một phần cặn không tan. Hình 3. 1. Sơ đồ chiết mẫu hoa Panax pseudoginseng Wall. Qua tổng quan tài liệu và nghiên cứu đánh giá sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy các hợp chất saponin nằm tập trung ở phân đoạn nƣớc (W). Do đó, luận văn chỉ tập trung phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất từ phân đoạn W. Phân đoạn nƣớc đƣợc cô quay dƣới áp suất giảm để thu đƣợc cặn nƣớc (W, 160g), sau đó đƣợc đƣa lên cột silicagel pha thƣờng chạy gradient từ hệ 27 dung môi diclometan:metanol (20:1), tăng dần độ phân phân cực của hệ dung môi thu đƣợc 5 phân đoạn từ W1→W5. Phân đoạn W2 (750mg) tiếp tục đƣợc phân tách bằng cột sắc ký silicagel pha đảo YMC RP-18 với hệ dung môi axeton:nƣớc (1:2) thu đƣợc phân đoạn W2B, tinh chế phân đoạn này bằng cột sắc ký silicagel pha thƣờng hệ dung môi diclometan:axeton:nƣớc (1:2:0,05) thu đƣợc hợp chất 1 (40mg). Phân đoạn W3 (13g) đƣợc phân tách bằng hệ thống sắc ký lỏng trung áp với cột pha đảo YMC RP-18, sử dụng pha động là axeton:H2O (1:2) thu đƣợc 5 phân đoạn ký hiệu W3A-W3E (hình 3.2). Phân đoạn W3C (2.5g) đƣợc phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha đảo YMC RP-18 rửa giải bằng hệ dung môi axeton:H2O (1:3) thu đƣợc phân đoạn W3C2. Tiếp tục sử dụng cột sắc ký silicagel pha thƣờng hệ dung môi diclometan:metanol:nƣớc (6:1:0,1) thu đƣợc 2 phân đoạn C2B và C2C. Tinh chế C2C (200mg) bằng cột sắc ký silicagel pha thƣờng hệ dung môi diclometan:metanol:nƣớc (4:1:0,1) thu đƣợc hợp chất 2 (20mg). Phân đoạn W3D (6,5g) đƣợc phân tách trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi axeton: nƣớc (1:3) thu đƣợc 3g W3D4. Phân tách tiếp phân đoạn này trên cột sắc ký silicagel pha thƣờng với hệ dung môi diclometan:metanol:nƣớc (4:1:0,1) thu đƣợc phân đoạn D4B và D4C. Phân tách phân đoạn D4B (100mg) bằng cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi axeton: nƣớc (1:1,5) thu đƣợc hợp chất 3 (15mg). Phân đoạn W3E (2g) đƣợc phân tách trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi axeton: nƣớc (1:1) thu đƣợc 5 phân đoạn từ W3E1 – W3E5. Từ phân đoạn W3E1 (500mg) phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thƣờng với hệ dung môi diclometan:metanol:nƣớc (4,5:1:0,1) thu đƣợc E1C (100mg), tiếp tục tinh chế phân đoạn này trên cột sắc ký silicagel pha đảo hệ dung môi metanol:nƣớc (2,5:1) thu đƣợc hợp chất 4 (4,5mg). 28 Hình 3. 2.Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn nƣớc của mẫu hoa tam thất Panax pseudoginseng Wall. 3.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc  Hợp chất 1 Hợp chất 1 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng, công thức phân tử: C36H62O9 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 0.93 (1H, dd, J = 11.0 Hz, H-5), 4.06 (1H, dd, J = 4.0, 10.5 Hz, H-6), 1.11 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-19), 1.39 (3H, s, H-21), 1.70 (3H, s, H-26), 1.65 (3H, s, H-27), 1.31 (3H, s, H-28), 0.98 (3H, s, H-29), 0.98 (3H, s, H-30), 4.62 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹ), 3.65 (1H, dd, J = 5.0, 12.0 Hz, Ha-6ʹ), 3.80 (1H, dd, J = 2.0, 12.0 Hz, Hb-6ʹ). 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 40.12 (C-1), 27.18 (C-2), 79.52 (C-3), 40.47 (C-4), 62.12 (C-5), 68.86 (C-6), 47.19 (C-7), 42.00 (C-8), 50.54 (C-9), 40.47 (C-10), 31.60 (C-11), 71.77 (C-12), 49.0 (C-13), 52.33 (C-14), 30.90 (C-15), 27.74 (C-16), 53.09 (C-17), 17.69 (C-18), 17.68 (C-19), 84.87 (C-20), 22.83 (C-21), 36.59 (C-22), 24.19 (C-23), 125.82 (C-24), 132.28 (C-25), 25.86 (C- 26), 17.95 (C-27), 31.47 (C-28), 16.13 (C-29), 17.26 (C-30), 98.26 (C-1ʹ), 75.34 (C-2ʹ), 78.23 (C-3ʹ), 71.19 (C-4ʹ), 77.88 (C-5ʹ), 62.53 (C-6ʹ). 29  Hợp chất 2 Hợp chất 2 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng, công thức phân tử: C42H72O14 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.12 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, s, H-19), 1.37 (3H, s, H-21), 1.70 (3H, s, H-26), 1.65 (3H, H-27), 1.35 (3H, s, H-28), 1.02 (3H, s, H-29), 0.98 (3H, s, H-30), 4.62 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹ), 4.37 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹʹ). 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 40.19 (C-1), 27.59 (C-2), 79.87 (C-3), 40.47 (C-4), 62.79 (C-5), 80.91 (C-6), 45.30 (C-7), 41.88 (C-8), 50.60 (C-9), 40.37 (C-10), 31.53 (C-11), 71.85 (C-12), 49.20 (C-13), 52.43 (C-14), 30.96 (C-15), 27.24 (C-16), 53.12 (C-17), 17.65 (C-18), 17.81 (C-19), 84.92 (C-20), 22.84 (C-21), 36.63 (C-22), 24.22 (C-23), 125.85 (C-24), 132.29 (C-25), 25.85 (C- 26), 17.95 (C-27), 31.40 (C-28), 16.11 (C-29), 17.15 (C-30), 98.29 (C-1ʹ), 75.49 (C-2ʹ), 77.90 (C-3ʹ), 71.22 (C-4ʹ), 77.63 (C-5ʹ), 62.55 (C-6ʹ), 105.55 (C- 1ʹʹ), 75.37 (C-2ʹʹ), 79.06 (C-3ʹʹ), 71.72 (C-4ʹʹ), 78.25 (C-5ʹʹ), 62.94 (C-6ʹʹ).  Hợp chất 3 Hợp chất 3 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng, công thức phân tử: C42H72O14 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.09 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-19), 1.39 (3H, s, H-21), 1.71 (3H, s, H-26), 1.65 (3H, H-27), 1.31 (3H, s, H-28), 0.98 (3H, s, H-29), 0.98 (3H, s, H-30), 4.60 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹ), 3.22 (1H, dd, J = 8.0, 9.0 Hz, H-3ʹ), 3.67 (1H, dd, J = 5.0, 12.0 Hz, Ha-6ʹ), 3.88 (1H, dd, J = 2.0, 12.0 Hz, Hb-6ʹ), 4.37 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹʹ). 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 40.10 (C-1), 27.77 (C-2), 79.58 (C-3), 40.17 (C-4), 62.15 (C-5), 68.92 (C-6), 47.23 (C-7), 42.01 (C-8), 50.51 (C-9), 40.49 (C-10), 31.47 (C-11), 71.59 (C-12), 49.85 (C-13), 52.28 (C-14), 30.73 (C-15), 27.22 (C-16), 52.90 (C-17), 17.75 (C-18), 17.62 (C-19), 84.92 (C-20), 22.49 (C-21), 36.74 (C-22), 23.88 (C-23), 126.02 (C-24), 132.25 (C-25), 25.93 (C- 26), 18.02 (C-27), 31.47 (C-28), 16.12 (C-29), 17.40 (C-30), 98.11 (C-1ʹ), 30 75.14 (C-2ʹ), 78.55 (C-3ʹ), 71.56 (C-4ʹ), 76.79 (C-5ʹ), 70.26 (C-6ʹ), 104.98 (C- 1ʹʹ), 75.30 (C-2ʹʹ), 77.96 (C-3ʹʹ), 71.69 (C-4ʹʹ), 77.92 (C-5ʹʹ), 62.83 (C-6ʹʹ).  Hợp chất 4 Hợp chất 4 thu đƣợc dƣới dạng bột màu trắng, công thức phân tử: C47H80O19 HR-ESI-MS: m/z: 971.5210 [M+Na] +, tính toán lý thuyết [C47H80O19Na] + : 971.5186 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ 1.05 (3H, s, H-18), 0.95 (3H, s, H-19), 1.35 (3H, s, H-21), 1.32 (9H, H-26, 27, 28), 0.88 (3H, s, H-29), 0.94 (3H, s, H- 30), 4.45 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1ʹ), 4.69 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1ʹʹ), 4.54 (1H, H-1ʹʹʹ). 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): δ 40.25 (C-1), 27.02 (C-2), 91.30 (C-3), 40.48 (C-4), 57.57 (C-5), 19.25 (C-6), 35.87 (C-7), 41.04 (C-8), 51.05 (C-9), 37.92 (C-10), 31.00 (C-11), 71.63 (C-12), 49.85 (C-13), 52.52 (C-14), 31.41 (C-15), 27.25 (C-16), 53.00 (C-17), 16.37 (C-18), 16.69 (C-19), 84.38 (C-20), 23.27 (C-21), 40.25 (C-22), 127.36 (C-23), 138.24 (C-24), 82.40 (C-25), 25.18 (C- 26), 25.23 (C-27), 28.40 (C-28), 16.74 (C-29), 17.24 (C-30), 105.39 (C-1ʹ), 81.22 (C-2ʹ), 78.31 (C-3ʹ), 71.05 (C-4ʹ), 78.53 (C-5ʹ), 63.12 (C-6ʹ), 104.57 (C- 1ʹʹ), 76.34 (C-2ʹʹ), 78.53 (C-3ʹʹ), 72.80 (C-4ʹʹ), 67.20 (C-5ʹʹ), 98.86 (C-1ʹʹʹ), 75.20 (C-2ʹʹʹ), 77.91 (C-3ʹʹʹ), 71.95 (C-4ʹʹʹ), 77.69 (C-5ʹʹʹ), 62.87 (C-6ʹʹʹ). 31 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 4.1.1. Hợp chất 1: Ginsenoside F1 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC chính của hợp chất 1 Hợp chất 1 thu đƣợc dƣới dạng dầu, phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu của 8 nhóm metyl dạng singlet tại độ chuyển dịch δH 0.98, 1.11, 1.31, 1.37, 1.65, 1.70 ppm, tín hiệu của một proton anome tại δH 4.62 (1H, d, J = 9.0 Hz) và tín hiệu của một proton olefin tại δH 5.13 (1H, t, J = 7.0 Hz). Hình 4. 2. Phổ 1H NMR của hợp chất 1 32 Phổ 13C NMR xuất hiện tín hiệu của 36 nguyên tử cacbon trong đó các tín hiệu tại δC 98.26 (C-1ʹ), 75.34 (C-2ʹ), 78.23 (C-3ʹ), 71.19 (C-4ʹ), 77.88 (C- 5ʹ), 62.53 (C-6ʹ) rất đặc trƣng cho đƣờng glucose, hằng số tƣơng tác của proton anome lớn chứng tỏ cấu hình dạng β-glucose. Phần aglycon với sự xuất hiện tín hiệu của 30 nguyên tử cacbon, trong đó có 8 nhóm metyl tại δC 17.69 (C-18), 17.68 (C-19), 22.83 (C-21), 25.86 (C-26), 17.95 (C-27), 31.47 (C-28), 16.13 (C-29), 17.26 (C-30), 3 nhóm oxymetin tại δC 79.52 (C-3), 68.86 (C-6), 71.77 (C-12), và tín hiệu của một nối đôi thế 3 vị trí tại δC 125.82 (CH, C-24)/132.28 (C, C-25). Kết hợp với phổ 1H NMR và phổ HSQC cho phép nhận định đây là một triterpen khung dammaran, một dạng khung rất phổ biến trong các loài thuộc chi Panax. Hình 4. 3. Phổ 13C NMR của hợp chất 1 Tƣơng tác trên phổ HMBC giữa H3-28, H3-29 với C-3 (δC 79.52), C-4 (δC 40.47), C-5 (δC 62.12) và giữa H-5 (δH 0.93) với C-6 (δC 68.86), C-7 chứng tỏ có sự xuất hiện của các nhóm thế hydroxy tại C-3, C-6. Cấu hình của các nhóm thế đƣợc xác định là 3β-OH và 6α-OH dựa vào độ chuyển dịch hóa học tại C-3 (δC 79.52) và hằng số tƣơng tác tại Hax-6 (dt, J = 4.0, 10.5 Hz). 33 Hình 4. 4. Phổ HSQC của hợp chất 1 Vị trí của đơn vị đƣờng đƣợc xác định tại C-20 dựa trên tƣơng tác HMBC giữa H3-21 với C-17, C-20, C-22, giữa H-1ʹ với C-20 và giữa H-17 với C-13, C- 16, C-20. Ngoài ra vị trí của nối đôi tại C-24/C-25 cũng đƣợc xác định dựa trên tƣơng tác giữa H3-26, H3-27 với C-24, C-25, giữa H2-22 với C-20, C-23, C-24. 34 Hình 4. 5. Phổ HMBC của hợp chất 1 So sánh số liệu phổ của hợp chất 1 với hợp chất Notoginsenoside U [38] cho thấy hợp chất 1 ít hơn một đơn vị đƣờng glucose. Tra cứu tài liệu DNP nhận thấy 1 là một hợp chất có tên gọi là Ginsenoside F1, một hợp chất đã từng đƣợc phân lập từ loài Panax notoginseng. Bảng 4. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và chất so sánh Position 1δC δC a,b DEPT δH a,c,d mult. (J= Hz) HMBC(HC) 1 39.4 40.12 CH2 1.06/1.74 2 26.8 27.18 CH2 1.43/1.96 3 78.0 79.52 CH 3.15 4 40.2 40.47 C - 5 61.4 62.12 CH 0.93 d (11.0) 4, 6, 7 6 67.4 68.86 CH 4.06 dt (4.0, 10.5) 7 47.3 47.19 CH2 1.56/1.67 8 41.3 42.00 C - 9 49.8 50.54 CH 1.50 10 40.0 40.47 C - 11 31.1 31.60 CH2 1.10/1.63 12 70.0 71.77 CH 3.78 13 49.1 49.0 CH 1.76 14 51.6 52.33 C - 15 30.9 30.90 CH2 1.20/1.87 16 28.0 27.74 CH2 1.65 35 17 51.6 53.09 CH 2.31 13, 16, 20 18 18.0 17.69 CH3 1.11 s 7, 8, 9, 14 19 18.2 17.68 CH3 0.98 s 1, 5, 9, 10 20 83.3 84.87 C - 21 22.7 22.83 CH3 1.37 s 17, 20, 22 22 36.4 36.59 CH2 1.63/1.82 23 23.3 24.19 CH2 2.10 24 126.2 125.82 CH 5.13 26, 27 25 131.3 132.28 C - 26 26.6 25.86 CH3 1.70 s 24, 25, 27 27 18.8 17.95 CH3 1.65 s 2