Luận văn Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất steroid từ cây lá đắng (vernonia amygdalina)

side (50), 3,4-dicaffeoylquinic acid (117), Et 3,4- dicaffeoylquinate (118), chlorogenic acid (119), esculetin (120), caffeic acid (121), protocatechuic acid (122) [49]. Sau đó, Hira và cộng sự cũng đã phân lập được 5 hợp chất, incaspitolide D (123), (S)-N-benzoylphenylalanine-(S)- 2-benzamido-3-phenyl-Pr ester (124), indole-3-carboxylic acid (125), apigenine (80), diosmetin (126) [50]. Dịch chiết ethanol từ phần trên mặt đất 17 của V. pulata cũng được thông báo có tác dụng kháng viêm tương đương indomethacin trên chuột bị phù do histamine và hoạt tính chống oxi hóa với giá trị IC50 = 36,59 μg/mL [51]. 1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY LÁ ĐẮNG (Vernonia amygdalina) Cho đến nay, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài V. amygdalina (cây lá đắng). Các kết quả nghiên cứu cho thấy, loài này thường chứa các hợp chất steroid glucoside, sesquiterpene lactone và flavonoid. Một số hợp chất phân lập từ V. amygdalina có tác dụng chữa bệnh đái tháo đường, kháng khuẩn, sốt rét, kháng nấm, chống oxy hóa, bảo vệ gan. Năm 1992, Mitsuo Jisaka và cộng sự phân lập được 4 hợp chất gồm vernonioside A1 (127), vernonioside A2 (128), vernonioside A3 (129), là các hợp chất góp phần tạo nên vị đắng của lá cây. Đặc biệt, hợp chất 130, với sự 18 mất đi nhóm OH ở vị trị C-16 và thêm nhóm OH ở C-23, không có tính chất này [52]. Jisaka và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất mới: vernonioside A4 (131) và aglycone của nó, cũng như hai glucoside không liên quan đến vị đắng, vernonioside B2 (132) và vernonioside B3 (133) [53]. Năm 2006, Erasto cùng cộng sự đã phân lập được hai hợp chất sesquiterpene lactone mới là vernolide (134) và vernodalol (135). Cả hai hợp chất đều có hoạt tính đối kháng đối với các chủng B. cereus, S. epidermidus, S. aureus, M. kristinae và S. pyrogens [54]. Trong nghiên cứu của Atangwho và cộng sự năm 2013, nhóm tác giả đã phát hiện ra hoạt tính chống oxy hóa và chống tiểu đường từ cao chiết của V. amygdalina. Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết được đánh giá bằng khả năng quét gốc tự do 2,20-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) hay còn gọi là khả năng chống oxy hóa tương đương Trolox (TEAC), khả năng chống oxy hóa khử sắt (FRAP), và khả năng quét gốc tự do 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính chống oxi hóa của các cao chiết phụ thuộc vào liều lượng: cao chiết nước > cao chiết methanol > cao chiết chloroform > cao chiết ether. Trong thử nghiệm dung nạp glucose bằng đường uống, cao chiết chloroform cho hiệu quả chống tiểu đường tốt nhất (33,3%), tương tự như metformin (27,2%), sau 19 2 giờ so với đối chứng (50,8%). Sau 14 ngày chuột bị tiểu đường được cho uống cao chiết, cao chiết chloroform thể hiện tác dụng hạ đường huyết trong máu (23,5%) và huyết thanh (21,4%) tốt nhất. Kết quả phân tích GC-MS cao chiết chloroform cho thấy hàm lượng cao của các axit linoleic (4,72%), axit α-linolenic (10,8%) và phytols (12,0%), cũng như các hợp chất khác [55]. Năm 2016, Quasie và cộng sự đã phân lập được 4 saponin steroid loại D7 (136 – 139) mới từ lá của V. amygdalina thu được tại Châu Phi. Các hợp chất này có hoạt tính kháng viêm thông qua tác dụng ức chế sản xuất NO được kích hoạt bởi lipopolysacarit trong các tế bào RAW-264.7[56]. Năm 2017, Adefisayo và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ dạ dày từ cao chiết methanol của lá V. amygdalina đối với dạ dày bị loét do aspirin gây ra ở chuột. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng aspirin làm gia tăng đáng kể điểm và chỉ số loét dạ dày, giảm pH dạ dày, axit dạ dày, giảm hoạt động superoxide dismutase (SOD) và mức glutathione GSH, đồng thời làm tăng mức lipid peroxidation (LPO), từ đó gây ra hoại tử các mô dạ dày. Trong khi đó cao chiết methanol của V. amygdalina có tác dụng làm tăng pH của dạ dày, giảm bài tiết acid dạ dày và thay đổi các thông số huyết học. Ngoài ra, cao chiết methanol của cây lá đắng cũng làm tăng đáng kể hoạt động SOD và mức GSH, trong khi đó làm giảm mức LPO. Các kết quả nghiên cứu này cho thấy V. amygdalina có các tác dụng bảo vệ dạ dày chống lại bệnh loét dạ dày do aspirin gây ra [57]. 20 Vai trò của dịch chiết V. amygdalina trong phòng ngừa nhiễm độc thận gây ra bởi chế độ ăn uống ô nhiễm dầu thô ở chuột cũng đã được Achuba và cộng sự nghiên cứu. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol từ lá V. amygdalina có thể bảo vệ, chống lại các tác động tiêu cực gây ra bởi dầu thô, cải thiện và khôi phục các chức năng thận bị mất bằng cách bảo vệ cấu trúc siêu mô [58]. Năm 2018, Wu và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác dụng giảm tổn thương gan từ cao chiết ethanol của V. amygdalina. Kết quả cho thấy cao chiết ethanol V. amygdalina có tác dụng làm giảm FBG và cải thiện đáng kể khả năng dung nạp glucose và kháng insulin (HOMA-IR) ở chuột gây ra bởi STZ. Cao chiết ethanol cũng có tác dụng ức chế sự biểu hiện cao của các enzyme glucoseogenesis chính (PEPCK và G6Pase) và tăng hoạt động AMPK trong gan. Trong các tế bào HepG2 được kích hoạt bởi axit palmitic (PA), cao chiết V. amygdalina có tác dụng làm giảm sản xuất glucose và biểu hiện của các protein PEPCK và G6Pase, cũng như kích hoạt con đường chuyển hóa AMPK. Những kết quả này cho thấy cao chiết ethanol của V. amygdalina có tác dụng ức chế sự phát sinh glucose gan ít nhất một phần thông qua kích hoạt AMPK [59].Năm 2019, Liu và cộng sự đã phân lập được 14 hợp chất steroid loại stigmastane từ cây lá đắng (140 – 153) [60]. 21 Ở Việt Nam, loài lá đắng mới chỉ có một vài nghiên cứu về đặc điểm thực vật và sơ bộ thành phần hóa và hoạt tính sinh học. Năm 2016, Lê Thị Mi Chi và công sự đã tiến hành khảo sát sơ bộ thành phần hóa học, đặc điểm vi phẫu và hình thái của cây lá đắng[61]. Đặc điểm thực vật của cây lá đắng được Hồ Thị Dung và công sự nghiên cứu (2018), nghiên cứu nhằm làm rõ thêm đặc điểm và nâng cao giá trị sử dụng của loài lá đắng[62]. Gần đây, nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cộng sự về tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết lá đắng trên chuột trắng chỉ ra rằng: Các lô chuột uống dịch chiết lá đắng đều có nồng độ glucose giảm dần giảm về gần mức đường huyết ban đầu sau đợt điều trị. Mức liều 200mg/kg cho kết quả giảm đường huyết mạnh nhất (50,3%) và gần tương đương mức giảm của lô dùng insulin (52,7%)[63]. Tổng quan sơ bộ các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Vernonia cho thấy các lớp chất chính được phân lập từ chi này chủ yếu là steroid, steroidal glycoside, sesquiterpenoid, và triterpenoid. Ngoài ra, một số lớp chất khác như flavonoid, phenolic, cũng được phân lập từ chi này. Dịch chiết và các hợp chất phân lập được từ chi Vernonia có nhiều hoạt tính thú vị như gây độc tế bào, kháng viêm, hạ đường huyết, chống oxi hóa, kháng vi sinh vật, bảo vệ gan, kháng nấm,... 22 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Mẫu lá loài lá đắng (Vernonia amydalina) được thu hái vào tháng 6 năm 2017 tại Phú Thượng, Phú Vang, Thừa Thiên Huế. Mẫu được định danh bởi TS. Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản của cây lá đắng (số MTB062017) được lưu tại Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hình 2.1. Cây lá đắng (V. amygdalina) 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất - Sắc ký lớp mỏng (TLC) 23 Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu. - Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Pha đảo RP-18 (30-50 µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind. Co., Ltd.). 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: - Phổ khối lượng (MS) Phổ khối lượng phun mù điện ESI-MS được đo trên máy Agilent 1260 của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy FT-ICR-Mass spectrophotometer tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Phổ NMR được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan). Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm: + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. 24 + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY và NOESY. + Các dung môi được sử dụng bao gồm DMSO-d6, CD3OD, CDCl3, pyridine-d5. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, trên nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử. - Độ quay cực [α]D: Độ quay cực được đo trên máy JASCO2000 Polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế các enzyme α-amylase và α-glucosidase - Nguyên liệu Nguyên liệu gồm 03 chất sạch phân lập được (2, 3 và 5). - Hóa chất + (Sulfanilamide) (BDH Chemical, Anh); pNPG), enzyme α- glucosidase, enzyme α-amylase, starch azure (Sigma, Mỹ). + Tris hydroxymethyl aminomethane (Bio Basic, Canada); KH2PO4, K2HPO4, DMSO, MeOH, acetic acid (Merck, Đức). 2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase Nguyên tắc: hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa trên phản ứng thủy phân 4- nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành đường glucose và p-nitrophenol, hợp chất có màu vàng dưới xúc tác của enzyme α-glucosidase. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế enzyme α- glucosidase, sự tạo thành hợp chất p-nitrophenol sẽ giảm, do vậy mật độ quang (OD) của p-nitrophenol so với mẫu đối chứng, không bị ức chế sẽ giảm theo. Mật độ quang (OD) của p-nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo ở bước sóng 405 nm và được dùng để đánh giá hoạt động ức chế enzyme của mẫu thử. Tiến hành: trong mỗi giếng (đĩa 96 giếng) chứa: 50μL mẫu thử và 100 μL dung dịch enzyme α-glucosidase được ủ 25oC trong 5 phút, tiếp 25 tục bổ sung 50 μL 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG). Mật độ quang của phản ứng được đo trên máy ELISA ở bước sóng 405 nm [8]. Chất đối chứng dương (acarbose) được dùng để kiểm soát độ ổn định và đánh giá hoạt tính ức chế tương đương. Các phép thử được lặp lại 3 lần. 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-amylase Nguyên tắc: hoạt tính ức chế enzyme α-amylase được thực hiện dựa vào phản ứng tạo màu của tinh bột với dung dịch đệm Tris dưới xúc tác của enzyme α-amylase. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế enzyme α- amylase, sự phân cắt liên kết α-1.4 của thành phần amilose và amilopectin trong tinh bột bị cản trở, dẫn đến sự tạo thành các polysaccharide nhỏ, disaccharide glucose và chất mang màu xanh giảm. Tiến hành: trong mỗi giếng (đĩa 96 giếng) chứa 100 μL mẫu, 100 μL tinh bột xanh và 50 μL enzyme α-amylase. Hỗn hợp được ủ tại 37oC trong 15 phút, sau đó 250 μL axit axetic được thêm vào để dừng phản ứng, ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Mật độ quang của phản ứng được đo bằng máy ELISA ở bước sóng 595 nm. 2.3. PHÂN LẬP CÁC CHẤT 2.3.1. Phân lập các hợp chất từ mẫu dược liệu Lá loài lá đắng (V. amygdalina) được sấy khô, xay nhỏ thu được 1,2 kg. Bột khô này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 3 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (ở 500C, mỗi lần 1 giờ). Dịch chiết được thu lại, lọc qua giấy lọc rồi tiến hành cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 200 g cặn thiết methanol. Cặn chiết này được phân bố đều trong 2 lít nước cất rồi đem chiết lần lượt với n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate. Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn n-hexane (VAH, 52 g), cặn dichloromethane (VAD, 42 g), cặn ethyl acetate (VAE, 31 g) và cặn nước (VAW, 75 g). Kiểm tra vết chất của các cặn chiết trên sắc ký bản mỏng pha thường, pha đảo. Kết quả cho thấy, các cặn VAH, VAD chứa nhiều diệp lục, các vết chất ít và không rõ ràng. Các vết chất chính của loài đều có mặt ở cặn VAE nên chúng tôi lựa chọn cặn VAE để tập trung phân lập các hợp chất. 26 Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. amygdalina Cặn ethyl acetate (VAE, 31 g) được tẩm với silica gel rồi đưa lên cột sắc ký pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient dichloromethane/methanol (100/1 → 1/1, v/v) thu được 5 phân đoạn, VAE1- VAE5. Phân đoạn VAE1 được phân tách trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (4/1, v/v/) thu được phân đoạn nhỏ hơn VAE1.1. Tiếp tục tinh chế phân đoạn VAE1.1 trên cột sắc ký pha thường với dung môi rửa giải dichloromethane/methanol/nước (20/1/0,05, v/v) thu được hợp chất VA1 (2 mg). Hợp chất VA6 (2 mg) thu được khi phân tách phân đoạn VAE2 trên sắc ký cột RP-18 với hệ dung môi methanol/nước (3/1, v/v). Tiếp tục phân tách phân đoạn VAE3 trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải ethyl acetate/methanol (20/1, v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn VAE3.1-VAE3.3. Hợp chất VA2 (9 mg) thu được khi tinh chế phân đoạn VAE3.2 trên cột sắc ký pha đảo RP-18 với dung môi rửa giải methanol/nước (2/1, v/v). Tương tự, các hợp chất VA3 (15 mg), VA4 (2 mg) và VA5 (17 mg) 2.3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ các hợp chất 2.3.2.1. Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11- tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane Chất bột màu trắng, vô định hình. 27 Độ quay cực  25D : +78,1 (c = 0,12, MeOH) Công thức phân tử: C30H46O7. Khối lượng phân tử: 518 ESI-MS: m/z 553.4 [M + Cl]- Số liệu phổ 1H và 13C-NMR xem bảng 3.1 2.3.2.2. Hợp chất VA2: vernoniacum B Chất bột màu trắng, vô định hình. Độ quay cực  25D : +39,3 (c = 0,1, MeOH) Công thức phân tử: C38H58O13. Khối lượng phân tử: 722 Số liệu 1H và 13C-NMR xem bảng 3.2 2.3.2.3. Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới) Chất bột màu trắng, vô định hình Độ quay cực  25D : +27,4 (c = 0,15, MeOH) Công thức phân tử: C36H56O11. Khối lượng phân tử: 664 HR-ESI-MS: m/z 687,3708 [M+Na]+ Số liệu 1H và 13C-NMR xem bảng 3.3 2.3.2.4. Hợp chất VA4: vernonioside B1 Chất bột màu trắng, vô định hình Độ quay cực  25D : +32,1 (c = 0,11, MeOH) Công thức phân tử: C35H52O10. Khối lượng phân tử: 632 Số liệu 1H và 13C-NMR xem bảng 3.4 2.3.2.5. Hợp chất VA5: vernonioside B2 Chất bột màu trắng, vô định hình Độ quay cực  25D : +38,4 (c = 0,15, MeOH) Công thức phân tử: C36H50O12. Khối lượng phân tử: 674 Số liệu 1H và 13C-NMR xem bảng 3.5 2.3.2.6. Hợp chất VA6: (23S,24R,28S)-3β,22α-dihydroxy-7,8,9,11- tetradehydro-24,28-epoxy-5α-stigmastane-21,23-carbolactone Chất bột màu trắng, vô định hình 28 Độ quay cực  25D : +57,0 (c = 0,14, MeOH) Công thức phân tử: C29H42O5. Khối lượng phân tử: 470 Số liệu 1H và 13C-NMR xem bảng 3.6 29 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 3.1.1. Hợp chất VA1: (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11- tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α- stigmastane Hình 3.1. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VA1 Hợp chất VA1 thu được dưới dạng chất bột, màu trắng. Độ quay cực  25D : +78,1 (c = 0,12, MeOH). Trên phổ 1H-NMR (Bảng 3.1) của VA1 xuất hiện tín hiệu của ba nhóm methyl singlet tại δH 0,61 (3H, s, H-18), 0,93 (3H, s, H-19), 1,45 (3H, s, H-29); hai nhóm methyl doublet tại δH 0,95 (6H, d, J = 6,5 Hz, H-26, H-27); một nhóm methoxy tại δH 3,22 (3H, s, 28-OCH3); hai proton olefin tại δH 5,44 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-7) và 5,57 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-11) và tín hiệu multiplet đặc trưng của H-3 tại δH 3,53 (1H, m, H-3). Trên phổ 13C-NMR (Bảng 3.1) của VA1 quan sát thấy tín hiệu của 30 carbon, bao gồm một nhóm methoxy (δC 48,5) và 29 carbon thuộc phần khung chất. Các tín hiệu của hai carbon bậc bốn tại δC 136,5 (C-8), 145,1 (C-9), hai carbon bậc ba tại δC 122,1 (C-7), 119,4 (C-11) và hai nhóm methyl tại δC 12,9 (C-18), 19,8 (C-19) cùng với tín hiệu của hai proton olefin tại δH 5,43 (H-7), 5,53 (H- 11) cho phép xác định sự có mặt của hai nối đôi liên hợp tại C-7/C-8/C-9/C- 11 ở phần khung chất [47, 64]. Từ các bằng chứng phổ trên, hợp chất VA1 được xác định có cấu trúc Δ7,9(11) dienstigmanstane [47, 65]. Bên cạnh đó, các tương tác HMBC giữa H-21 (δH 5,46) với C-20 (δC 48,8)/ C-22 (δC 81,6)/ C-23 30 (δC 91,9), giữa H-22 (δH 4,57) với C-21 (δC 100,0)/ C-23 (δC 91,9), giữa H-23 (δH 4,58) với C-21 (δC 100,0)/ C-24 (δC 83,1) cho thấy phần chuỗi bên cạnh có mặt hai vòng furan được nối với nhau tại C-22 và C-23. Các tín hiệu proton tại δH 0,95 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-26), 0,95 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27), 1,45 (3H, s, H-29) và 2,06 (1H, m, H-25) cùng với giá trị độ dịch chuyển hóa học của ba nhóm methyl tại δC 17,4 (C-26), 18,1 (C-27), 17,4 (C-29) và nhóm methine tại δC 33,1 (C-25) cho thấy sự có mặt của một nhóm isopropyl và một nhóm methyl. Vị trí của hai nhóm này tại C-24 và C-28 lần lượt được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa H-26/H-27 (δH 0,95) với C-24 (δC 83,1) và H-29 (δH 1,45) với C-28 (δC 114,1). Ngoài ra, tương tác HMBC proton của nhóm methoxy (δH 3,22) với C-28 (114,1) xác định vị trí của nhóm methoxy tại C-28. Từ những phân tích trên hợp chất VA1 được xác định là 28- methoxy-7,8,9,11-tetradehydro-3,16,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28- diepoxystigmastane. So sánh số liệu phổ NMR của VA1 với phần aglycone của hợp chất vernonioside B2 [66] cho thấy số liệu phổ hoàn toàn phù hợp. Điều này cho phép khẳng định VA1 là (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy- 7,8,9,11-tetradehydro-3β-16α,21,24-tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α- stigmastane. Theo nghiên cứu của Mitsuo Jisaka và cộng sự, hợp chất này thu được khi thủy phân vernonioside B2[66]. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên hợp chất (22R,23S,24R,28S)-28-methoxy-7,8,9,11-tetradehydro-3β-16α,21,24- tetrahydroxy-21,23:22,28-diepoxy-5α-stigmastane được phân lập từ tự nhiên. Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất VA1 và hợp chất tham khảo C δC# δCa,b δHa,c (mult., J in Hz) 1 35,2 35,3 1,81 (m); 1,93(m) 2 32,5 32,4 1,50 (m); 1,87 (m) 3 70,2 71,4 3,54 (m) 4 38,8 38,5 1,31(m); 1,72 (brd 12,0) 5 39,6 40,6 1,45(m) 6 30,4 31,0 1,92(m) 31 7 121,5 122,1 5,45 (d, 5,0) 8 135,0 136,7 - 9 144,2 145,1 - 10 36,2 37,0 - 11 118,6 119,4 5,56 (d, 6,5) 12 41,8 42,5 2,04 (m); 2,28 (dd, 4,0; 10,5) 13 43,7 44,3 - 14 49,2 49,7 2,58 (m) 15 35,3 36,0 1,37 (dd, 3,0; 13,5); 2,00 (dd, 3,0; 13,5) 16 76,3 77,3 4,34 (t, 7,0) 17 56,1 56,3 2,07 (dd, 2,5, 6,5) 18 14,6 14,5 0,61 (s) 19 19,7 19,8 0,93 (s) 20 48,6 48,8 2,23 (t, 5,0) 21 99,2 100.0 5.46 (brs) 22 81,0 81.6 4.57 (t, 5.5) 23 91,2 91,9 4,58 (brs) 24 82,0 83,1 - 25 32,4 33,1 2,06 (m) 26 17,5 17,4 0,95 (d, 6,5) 27 18,5 18,1 0,95 (d, 6,5) 28 113,4 114,1 - 29 17,5 17,4 1,45 (s) OCH3 48,5 48,5 3,22 (s) a) đo trong CD3OD, b) đo tại 125 MHz, c) đo tại 500 MHz, #)δC của hợp chất tham khảo [66]. 32 3.1.2. Hợp chất VA2: vernoniacum B Hình 3.2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất VA2 Hợp chất VA2 thu được dưới dạng chất bột, màu trắng. Độ quay cực  25D : +39,3 (c = 0,1, MeOH). Trên phổ 1H-NMR của VA2 xuất hiện tín hiệu của ba nhóm methyl singlet tại δH 0,64 (3H, s, H-18), 0,94 (3H, s, H-19), 1,42 (3H, s, H-29); hai nhóm methyl doublet tại δH 0,93 (3H, d, J = 4,0 Hz, H-26), 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27); một nhóm methoxy tại δH 3,16 (3H, s, 28-OCH3); hai proton olefin tại δH 5,44 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-7) và 5,57 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-11); một proton anome tại δH 4,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′) và tín hiệu multiplet đặc trưng của H-3 tại δH 3,53 (1H, m, H-3). Trên phổ 13C-NMR của VA2 quan sát thấy tín hiệu của 38 carbon, bao gồm sáu carbon của một phân tử đường, hai carbon của một nhóm acetyl (δC 172,7, 21,9), một nhóm methoxy (δC 48,5) và 29 carbon thuộc phần khung chất. Số liệu phổ NMR của VA2 khá giống với VA1 ngoại trừ sự có mặt nhiều hơn các tín hiệu của một phần đường O-β-D-glucopyranosyl tại C-3 và một nhóm acetyl tại C-16. Vị trí của hai nhóm này được xác định dựa vào tương tác HMBC giữa proton anome H-1′ (δH 4,42) với C-3 (δC 78,9) và H-16 (δH 5,27) với nhóm acetyl (δC 172,7). Từ những phân tích trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo cho phép khẳng định VA2 là vernoniacum B. Hợp chất này được phân lập lần đầu tiên từ loài V. cumingiana[67]. Tuy nhiên đây là lần đầu tiên hợp chất vernoniacum B được phân lập từ loài V. amygdalina. 33 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất VA2 và hợp chất tham khảo C δC# δCa,b δHa,c (mult., J in Hz) 1 35,3 35,4 1,35 (m); 2,01 (m) 2 30,5 30,6 1,53 (m); 1,99 (m) 3 77,4 78,9 3,53 (m) 4 38,4 35,0 1,33 (m); 1,88 (m) 5 39,5 40,5 1,41 (m) 6 30,5 31,0 1,31 (m); 1,95 (m) 7 122,1 122,4 5,44 (d, 4,5) 8 135,4 136,3 - 9 144,3 145,0 - 10 36,5 37,1 - 11 119,1 119,6 5,57 (d, 5,5) 12 42,4 42,8 2,03 (m); 2,15 (m) 13 43,5 43,8 - 14 49,3 49,5 2,19 (m) 15 35,2 36,0 1,38 (m); 2,01 (m) 16 78,8 79,8 5,27 (m) 17 48,6 48,6 3,17 (m) 18 14,7 14,5 0,64 (s) 19 19,8 19,8 0,94 (s) 20 49,4 49,5 2,51 (m) 21 99,4 100,0 5,44 (d, 4,5) 22 80,4 80,7 4,31 (t, 6,0) 23 92,1 92,4 4,53 (d, 6,0) 24 82,3 83,0 - 25 32,8 33,1 2,02 (m) 26 17,7 17,5 0,93 (d, 4,0) 27 18,9 18,2 0,96 (d, 6,5) 28 113,1 113,4 - 34 29 17,9 17,4 1,42 (s) 1 102,7 102,4 4,42 (d, 8,0) 2 75,7 75,2 3,17 (m) 3 79,0 78,1 3,34 (m) 4 72,1 71,7 3,38 (m) 5 78,9 77,9 3,29 (m) 6 63,3 62,8 3,57 (dd, 5,0; 11,5) 3,87 (brd, 11,5) 16-OCOCH3 170,9 172,7 - 16-OCOCH3 22,2 21,9 2,06 (s) OCH3 51,6 48,5 3,16 (s) a) đo trong CD3OD, b) đo tại 125 MHz, c) đo tại 500 MHz, #)δC của hợp chất vernoniacum B [67]. 3.1.3. Hợp chất VA3: vernoamyoside E (chất mới) Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất VA3 và hợp chất tham khảo (VA2) Hợp chất VA3 thu được dưới dạng chất bột, màu trắng. Độ quay cực  25D : +27,4 (c = 0,15, MeOH). Công thức phân tử của VA3 được xác định là C36H56O11 bởi sự xuất hiện của píc ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 687,3708 trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho công thức [C36H56O11Na]+: 687,3720). 35 Hình 3.4. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất VA3 Trên phổ 1H-NMR (Bảng 3.3) của VA3 xuất hiện tín hiệu của ba nhóm methyl singlet tại δH 0,57 (3H, s, H-18), 0,93 (3H, s, H-19), 1,42 (3H, s, H- 29); hai nhóm methyl doublet tại δH 0,94 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-26), 0,95 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-27); một nhóm methoxy tại δH 3,21 (3H, s, 28-OCH3); hai proton olefin tại δH 5,43 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-7), 5,53 (1H, d, J = 5,5 Hz, H- 11); một proton anome tại δH 4,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′) và một proton tín hiệu multiflet đặc trưng của H-3 tại δH 3,71 (m). Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của hợp chất VA3 36 Phân tích các tính hiệu trên phổ 13C-NMR, HSQC của VA3 quan sát thấy tín hiệu của 36 carbon bao gồm 29 carbon thuộc phần khung steroid, lớp chất chính trong thành phần hóa học của loài V. amygdalina; một carbon thuộc nhóm methoxy và sáu carbon đặc trưng của phần đường glucopyranosyl (Bảng 3.3). Các tín hiệu của hai carbon bậc bốn tại δC 137,2 (C-8), 144,8 (C- 9) và hai carbon bậc ba tại δC121,4 (C-7), 119,5 (C-11) cùng với tín hiệu của hai proton olefin tại δH 5,43 (H-7), 5,53 (H-11) cho phép xác định sự có mặt của hai nối đôi liên hợp tại C-7/C-8/C-9/C-11 ở phần khung chất [47, 64]. Bên cạnh đó, phần khung của VA3 còn có mặt hai nhóm methyl tại δC 12,9 (C-18), 19,8 (C-19). Từ các bằng chứng phổ trên, cấu trúc hóa học của hợp chất VA3 được dự đoán là Δ7,9(11) dienstigmanstane glycoside [47, 65]. Hình 3.6. Phổ 13C-NMR của hợp chất VA3 37 Hình 3.7. Phổ HSQC của hợp chất VA3 Hình 3.8. Các tương tác HMBC chính của hợp chất VA3 Vị trí của hai nhóm methyl ở phần khung chất tại C-10 và C-13 khẳng định lại dựa vào tương tác HMBC giữa H-19 (δH 0,93) với C-1 (δC 35,8)/ C-5 (δC 40,1)/ C-12 (δC 41,9)/ C-10 (δC 36,8) và H-18 (δH 0,57) với C-12 (δC 41,9)/ C-13 (δC 42,7)/ C-14 (δC 51,9)/ C-17 (δC 45,4). Bên cạnh đó, tương tác HMBC giữa H-20 (δH 1,95) với C-21 (δC 100,0)/ C-22 (δC 81,0), giữa H-21 (δH 5,43) 38 với C-22 (δC 81,0)/ C-23 (δC 91,3), giữa H-22 (δH 4,26) với C-21 (δC 100,0)/ C-23 (δC 91,3), giữa H-23 (δH 4,45) với C