Luận văn Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam

nấm, chống đông máu hoặc là kháng trùng sốt rét Những hợp chất này sẽ trở thành nguồn dược phẩm quan trọng để chữa bệnh trong tương lai. G. Vijaya Baskara Sethubathi và V. Ashok Prabu (Đại học Annamalai) đã phân lập được 12 chủng tảo biển ở bờ biển Adirampattinam, tây nam vịnh Palk. Dựa trên đặc điểm sinh trưởng có 3 chủng được phân loại đó là Oscillatoria sp., Phirmidium sp. và Lyngbya majuscule. Ba loài này đều có khả năng kháng một số loài vi khuẩn gây bệnh ở người như S. mutants, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, B. subtilis và Klebsiella pneumoniae. Trong đó Oscillatoria sp. có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất và Lyngbya majuscule có hoạt tính yếu nhất [35]. M. Krishnaraj và N. Mathivanan (Ấn Độ - 2009) đã phân lập được 137 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật từ 40 địa điểm khác nhau ở vịnh Bengal. Trong tất cả 137 chủng xạ khuẩn đều có khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh ở người như S. aureus, P. aeruginosa, Bacillus spp. và 10 chủng có khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani và Fuzarium oxysporum gây bệnh ở thực vật [23]. Năm 2010, Rofiq Sunaryanto và Bambang Marwoto đã phân lập ở Anyer, Banten (Indonesia) được 29 chủng vi khuẩn trong đó có một chủng A11 có đặc tính kháng được các chủng vi khuẩn G- và G+ (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, B. subtilis). Bằng phương pháp giải trình tự gene 16S-rRNA và so sánh trình tự với dữ liệu của Genbank đã xác định được chủng A11 chính là xạ khuẩn Streptomyces sp. Bằng phương pháp sắc ký đã tách được một hợp chất kháng sinh có khả năng kháng khuẩn với nồng độ ức chế tối thiểu thấp hơn nhiều so với chất kháng sinh tetracyline (đối chứng) [28]. Valli S, Suvathi Sugasini S, Aysha OS, Nirmala P, Vinith Kumar P và Reena A (trường ĐH Khoa học công nghệ Mohamed Sathak-Ấn Độ) phân lập được 20 chủng xạ khuẩn từ bờ biển Royapuram, Muttukadu, Mahabalipuram và ở cửa biển Adyar vào năm 2011. Trong đó có 2 chủng xạ khuẩn (ký hiệu C11 và C12) có khả năng kháng khuẩn. Chủng C11 có chuỗi bào tử dài, bề mặt khuẩn lạc trắng và là vi khuẩn G+, chúng kháng được Staphylococcus, Pseudomonas, V. harveyi. Chủng C12 cũng là vi khuẩn G+, có chuỗi bào tử hình cầu, bề khuẩn lạc mầu kem và C12 ngoài kháng được 3 loài vi khuẩn gây bệnh trên còn kháng cả B. subtilis. Bằng phương pháp phân loại phân tử giải trình tự gene 16S-rRNA và so sánh với cơ sở dữ liệu ở Genbank đã phân loại được 2 chủng C11 và C12 đều là xạ khuẩn Streptomyces [34]. Năm 2011, Sumei Li và cộng sự đã phân lập được một chủng xạ khuẩn (SCSIO-01299) từ biển Đông (Việt Nam) ở độ sâu 3258 m. Bằng phương pháp quan sát hình thái học và giải trình tự gene 16S-rRNA, chủng SCSIO-01299 được phân loại là Pseudonocardia sp. SCSIO-01299. Các nhà khoa học này đã tách được 4 hợp chất có hoạt tính sinh học cao đó là deoxynyboquinone và Pseudonocardian A-C. Deoxynyboquinone và Pseudonocardian A và B có khả năng kháng khuẩn (S. aureus, E. faecalis, B. thuringensis) và kháng tế bào ung thư phổi, ung thư vú và ung thư não. Bằng phương pháp khối phổ đã phân tích được deoxynyboquinone có công thức phân tử C15H12O4N2; pseudonocardian A có thành phần C18H18O5N2; pseudonocardian B công thức là C19H20O5N2; pseudonocardian C công thức là C21H24O8N2 [32]. Hình 1.3. Cấu trúc của deoxynyboquinone (1) và pseudonocardian A-C (2-4) [32] CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu Các mẫu nước và bùn lấy ở ven bờ tại các vị trí khác nhau ở các vùng biển Việt Nam, các mẫu được ký hiệu theo tên từng địa phương lấy mẫu. Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm: Bacillus subtilis ATCC 6633; Bacilus cereus ATCC 11778; Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Enterobacter aerogenes ATCC 23048; Salmonella typhi IFO 14193; Candida albicans ATCC10, E. coli ATCC 11105, Alcaligenes faecallis, Pseudomonas auroginosa nhận từ bộ sưu tập giống của phòng Công nghệ lên men, viện Công nghệ sinh học. 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất Các loại đường gồm: glucose; arabinose; raffinose; fructose; saccarose; xylose; myo-inositol; mannitol; lactose; mannose; galactose; dextrose... (Merck). Các nguồn nitơ: L-histidinemonohy-drodorid monohydrate; L-phenylalanine; Leucine; L-triptophan; L-asparagine monohydrate; L-arginine monodo; L-isoleucine; L-valine; L-methionine; L-lysine; L-threonine; L-cystein; 2-amino-2 hydroxy-methyl 1,3 prom (Merck). Các hóa chất khác dùng trong nuôi cấy và lên men: CaCO3; K2HPO4.3H2O; KH2PO4; FeSO4.7H2O; (NH4)2SO4; NH4Cl; NaCl; bột đậu tương; trypton; pepton; cao ngô; casein thủy phân; agar và một số hóa chất cần thiết khác là sản phẩm của Việt Nam hoặc nước ngoài có độ tinh khiết cao, đáp ứng yêu cầu nghiên cứu. Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử gồm: Tris-base, EDTA, axit acetic, CTAB, NaCl, propanol, chloroform, phenol, isoamin alcohol, etanol, bromophenol blue, Ethidium bromide, glycerol, dNTP các loại, MgCl2, cặp mồi FC27/RC1492, kít PureLinkTM - DNA Purification (Invitrogen), DNA Marker (Fermentas), agarose 2.1.2.2. Thiết bị Bảng 2.1. Các thiết bị chính sử dụng trong đề tài Tên thiết bị Nơi sản xuất Tên thiết bị Nơi sản xuất Cân phân tích ADNHR- 20000 Thụy Sỹ Máy ly tâm Đức Nồi hấp thanh trùng Nhật Bản Kính hiển vi quang học Olympus CHD -2 Nhật Bản Tủ cấy vô trùng Pháp Máy đo pH 320 Toledo Anh Tủ ấm Trung Quốc Tủ khử trùng khô dụng cụ Trung Quốc Máy lắc Hàn Quốc Kính hiển vi quét Viện 69, Bộ tư lệnh lăng Chủ tịch HCM Cân điện tử Startorius Đức Máy PCR GeneAmp PCR system 9700 Mĩ Máy điện di DNA Mupid Nhật Bản Máy xác định trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Mĩ 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu phụ thuộc vào tính chất của mẫu (đất mùn, bùn, nước....) mà có phương pháp thu thập mẫu thích hợp. Dụng cụ dùng lấy mẫu phải vô trùng để tránh nhiễm chéo. Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích. Mẫu nước Dụng cụ lấy mẫu như gáo có tay cầm hoặc các ống nghiệm, chai nhựa đã được khử trùng bằng cồn. Lấy nước cách bề mặt 0,2 – 5,0 m mẫu nước được đựng trong các ống nghiệm nút cao su, chai nhựa có ghi rõ đặc điểm và địa điểm lấy mẫu. Mẫu đất, bùn Dùng dao hay xẻng sạch đã lau cồn để lấy mẫu đất. Đầu tiên loại bỏ lớp đất dày 2-5 cm trên bề mặt, sau đó lấy phần đất tiếp theo cho vào túi đã được khử trùng, gài cẩn thận. Túi được dán nhãn ghi rõ đặc điểm, địa điểm lấy mẫu. 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu Để xác định thành phần và số lượng nhóm vi sinh vật có trong các mẫu, sử dụng phương pháp pha loãng tới hạn và nuôi trên các môi trường đặc trưng cho từng nhóm vi sinh vật. Các mẫu được pha loãng bằng nước muối sinh lý 0,85% trong điều kiện vô trùng, nồng độ pha loãng theo cơ số 10. Quá trình thực hiện như sau: Đối với mẫu bùn: Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,85%. Cân chính xác 1 gam mẫu bùn hoặc đất chuyển vào bình thủy tinh đã chứa 100 ml nước cất khử trùng, lắc trên máy lắc khoảng 1 giờ với tốc độ 150-200 vòng/phút, sau đó để lắng trong 30 phút. Dịch thu được đã có độ pha loãng 10-2 (1:100). Hút 1 ml dịch này chuyển vào ống nghiệm sạch, được độ pha loãng 10-3. Từ ống pha 10-3 hút 1ml chuyển sang ống tiếp theo, lặp lại các bước để thu được độ pha loãng tiếp theo cơ số 10. Đối với mẫu nước: hút 1 ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất khử trùng, lắc đều. Dịch trong ống tương đương với độ pha loãng 10-1. Hút 1 ml từ ống nghiệm có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 2, lắc đều. Dịch trong ống tương đương với độ pha loãng 10-2. Làm tương tự với các ống nghiệm khác tới 10-6. Dịch đã pha loãng được cấy trên đĩa petri có chứa các môi trường tương ứng. Hút 0,2 ml dịch trong ống nhỏ lên các hộp petri có chứa môi trường đặc trưng cho mỗi loại vi sinh vật điển hình để xác định số lượng vi sinh vật. Dùng que gạt đều lên trên mặt thạch. Các đĩa thạch sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28-30oC trong vòng 24-96 giờ tùy theo từng nhóm vi sinh vật. Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch và tính toán số lượng vi sinh vật có trong 1ml mẫu theo công thức: CFU/ml (g) = a x 1/K x 1/V. a: Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên đĩa petri có cùng độ pha loãng. V: Thể tích dịch pha loãng trang trên mỗi đĩa (ml) K: Độ pha loãng của dịch được cấy. 2.2.3. Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập được kiểm tra khả năng sinh kháng sinh bằng các phương pháp sau: 2.2.3.1. Phương pháp thỏi thạch Vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp trong đĩa petri. Sau 7-14 ngày, khi mọc tốt, dùng ống đục lỗ thạch, lấy các thỏi thạch đặt lên đĩa petri đã cấy vi sinh vật kiểm định. Để các đĩa cấy ở nhiệt độ 4-8oC trong khoảng 4-8 giờ để chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường thạch, sau đó nuôi cấy ở 37oC với vi sinh vật kiểm định và đọc kết quả sau 24 giờ [3]. Khả năng đối kháng được xác định theo kích thước vòng kháng khuẩn VKK= D-d (mm), trong đó D: Đường kính vòng kháng khuẩn d: Đường kính thỏi thạch. Giữ lại các chủng có hoạt tính kháng sinh nuôi cấy trên môi trường lỏng để xác định khả năng sinh kháng sinh. 2.2.3.2 Phương pháp đục lỗ thạch Môi trường thạch dinh dưỡng sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt dộ 40 - 45oC. Hút dịch vi khuẩn kiểm định cho vào bình môi trường, trộn đều và đổ vào các khay hoặc đĩa petri. Sau khi thạch nguội dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra. Vi sinh vật sau khi nuôi lắc đem ly tâm ở 6000 - 8000 vòng/phút, lấy dịch nhỏ vào lỗ thạch. Sau đó cho vào tủ lạnh 6-8 giờ để dịch tế bào khuếch tán vào môi trường rồi chuyển ra nuôi ở 28 - 30oC sau 14 - 18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn [3]. Chọn và giữ các chủng có vòng kháng khuẩn để nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại. 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn Nghiên cứu định tên các chủng xạ khuẩn đã chọn theo đặc điểm phân loại của Waskman, 1961; Krasilnikov, 1970; Gause, 1983; Sổ tay phân loại vi sinh vật của Bergey, 1989 và tham khảo các bản mô tả xạ khuẩn của chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP), 1966 và 1970 [27, 30, 31] Để quan sát các đặc điểm hình thái như hình dáng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ti khí sinh, khuẩn ti cơ chất, sắc tố tan, sự hình thành melanin, cuống sinh bào tử, bề mặt bảo tử... các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Gause 1, ISP 1, ISP 2, ISP 3, ISP 4, ISP 5, ISP 6, ISP 7, môi trường Bennet và khoai tây ở nhiệt độ 28-30oC. Sau 7, 14 và 21 ngày quan sát màu sắc khuẩn ti khí sinh, khuẩn ti cơ chất và sắc tố tan trên môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb và sử dụng bảng màu của Tresner và Barkus (1963). Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của chủng được mô tả dựa vào khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nitơ, khả năng ức chế các vi sinh vật, khả năng mẫn cảm với các chất kháng sinh... và sự sinh trưởng của xạ khuẩn ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau (pH, nhiệt độ, sự có mặt các chất ức chế). 2.2.4.1. Đặc điểm hình thái 2.2.4.1.1. Các đặc điểm nuôi cấy Màu sắc khuẩn lạc (khuẩn ti khí sinh): Màu sắc của khuẩn ti khí sinh được so với 7 nhóm màu của Tresner và Backus (1963): xanh da trời, sẫm, xám, xanh lá, đỏ, tím, trắng, vàng. Màu sắc của khuẩn ti cơ chất: chia vào 5 nhóm vàng- nâu (gồm cả các loại không tiết sắc tố); xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím... Khả năng sinh sắc tố tan: khả năng sinh sắc tố tan được xác định trên môi trường ISP2-5. Sắc tố tan được xếp vào 5 nhóm giống màu của khuẩn ti khí sinh và khuẩn ti cơ chất: vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím. Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin, nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp. Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu, đen [30]. 2.2.4.1.2. Các đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP3 và ISP 4 có đặt lamen trên mặt đĩa. Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28 - 30oC xạ khuẩn sinh trưởng tốt lấy ra quan sát hình dạng chuỗi bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi quét. Hình dạng chuỗi bào tử được kí hiệu: RF: thẳng hay hơi lượn sóng; RA: hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn; S: dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn; SRF: dạng xoắn lượn sóng; SRA: dạng xoắn có móc câu. Bề mặt bào tử: Bề mặt của khuẩn ti khí sinh có bào tử được phủ platin trong 30 giây sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quét (Viện 69-Bộ tư lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh) để xác định đặc điểm bề mặt bào tử: + Bào tử hình tròn, ovan, hình que. + Bề mặt bào tử được ký hiệu: sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ha (tóc). 2.2.4.2. Các đặc điểm sinh lí, sinh hoá 2.2.4.2.1. Khả năng sử dụng nguồn đường Quan sát khả năng đồng hoá nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn trên môi trường ISP9 có bổ sung 1% các nguồn đường glucose, fructose, sacarose, arabinose, xenlobiose, myo-inositol, manitol, xylose, raffinose, rhamnose, tinh bột, dextrose. Các ống thạch đã cấy được ủ 5 - 7 ngày ở nhiệt độ thích hợp, so sánh với đối chứng dương là môi trường ISP9 bổ sung glucose, đối chứng âm là môi trường ISP9 cơ sở (môi trường khoáng) [30]. 2.2.4.2.2. Khả năng sử dụng nguồn nitơ Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP8 bổ sung nguồn nitơ (0,1% w/v). Kết quả sinh trưởng được xác định sau 15 ngày, so sánh với ống đối chứng âm và đối chứng dương (môi trường có L-Asparagine monohydrate) [30]. 2.2.5. Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 2.2.5.1. Phương pháp tách DNA tổng số từ xạ khuẩn bằng đệm CTAB Nguyên tắc: Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn bằng lysozym sau đó loại bỏ protein khỏi DNA nhờ protease K. Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ bằng phức hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1). Sau đó dịch có chứa DNA được tủa bằng Isopropanol và rửa bằng etanol. Cặn DNA được hòa tan trong đệm TE. Bảo quản ở -20oC [29]. Quy trình: Lấy 2 ml dịch nuôi cấy đem li tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn tế bào. Hòa tan cặn trong 510 µl TE, pH = 8. Đảo đều bằng voltex. Bổ sung thêm 60 µl EDTA (nồng độ cuối 45mM). Sau đó thêm 60 µl lysozym (50 mg/ml), ủ trong 2 giờ ở 65OC. Bổ sung thêm 5 µl protease K, 30 µl SDS 10%. Đảo nhẹ, ủ 1 giờ ở 37OC. Thêm 110 µl NaCl 5M, 90 µl CTAB, đảo nhẹ. Bổ sung thêm 700 µl Chloroform : Isoamin alcohol (24:1), đảo đều sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf mới. Bổ sung thêm 700 µl hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), đảo nhẹ sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới (lặp lại 3 lần). Kết tủa DNA với propanol, để qua đêm ở -20oC. Li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch. Rửa tủa 2 lần với 500 µl cồn tuyệt đối. Làm khô ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Thêm 1 µl TE/RNase, sau đó ủ ở 37oC trong 2 giờ Hòa tan lại tủa với 40 µl TE, pH 8 Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Bảo quản ở 4oC. * Tinh sạch DNA bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260 và 280 nm. Tính hệ số A = l260/l280. Nếu hệ số chỉ từ 1,8 – 2,0 là đạt yêu cầu. 2.2.5.2. Phản ứng PCR và giải trình tự gene [29] DNA tổng số sau khi được tinh sạch sẽ được chạy PCR để tách đoạn gene 16S-rRNA với thành phần phản ứng như sau: DNA template 1 µl H2O 11 µl dNTP (mỗi loại 0,2 mM) 0,8 µl Primer F 1 µl Primer R 1 µl MgCl2 1 µl Buffer 10x 4 µl Taq polymerase 0,2 µl Tổng thể tích 20 µl Hỗn hợp phản ứng được chạy PCR với chương trình như sau: 940C 5 phút 940C 1 phút 30 giây Lặp lại 30 lần 510C 1 phút 30 giây 720C 2 phút 720C 10 phút 40C ¥ Sử dụng cặp mồi FC27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và RC1492 (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′) (hãng GENSET- Singapore BioTech pte, Ltd) để nhân gene mã hóa 16S rRNA. Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Sản phẩm sau khi giải trình tự được so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI. Cây phát sinh chủng loại được thiết lập trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Kimura, bằng việc sử dụng phương pháp Neighbor-joining. Phân tích Bootstrap của cây phát sinh chủng loại được tính với 1000 mẫu thử [10, 19]. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh Từ 39 mẫu nước, bùn, đất thu thập được ở các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, chúng tôi đã tiến hành phân lập và thu được 23 mẫu có xạ khuẩn với tổng cộng 40 chủng. Các chủng xạ khuẩn xuất hiện chủ yếu ở các mẫu đất và bùn với màu sắc và hình dạng phong phú. Trong các mẫu nước hầu như không tìm thấy xạ khuẩn hoặc có thì cũng rất ít và mức độ khác nhau của chúng không nhiều do các mẫu đều lấy ở ven bờ trong độ sâu từ 0,2 – 5 m. Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập được nuôi cấy trên môi trường Gause 1 và một số môi trường đặc trưng cho sinh kháng sinh khác, có bổ sung nước biển. Các chủng sau khi nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC được thử hoạt tính đối kháng vi sinh vật bằng phương pháp thỏi thạch trên các môi trường có bổ sung các vi sinh vật kiểm định S. epidermidis ATCC 12228, B. cereus ATCC 11778, B. subtilis ATCC 6633, C. albicans ATCC 10231. Sau 14 – 18 giờ, đo vòng đối kháng (D-d, mm). Kết quả được thể hiện trên bảng 3.1. Bảng 3.1. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn TT Chủng xạ khuẩn Vòng kháng khuẩn (D-d, mm) S. epidemids ATCC 12228 B. cereus ATCC 11778 B. subtilis ATCC 6633 C. albicans ATCC 10231 1 NA115 22 21 24 15 2 NA118 10 0 13 0 3 NA114 0 20 0 0 4 NA119 18 9 10 0 5 NA113 26 14 25 9 6 NA1132 10 19 14 17 7 NA1134 10 12 14 18 8 NA116 0 0 12 0 9 NA117 0 0 12 0 10 M415 9 0 15 11 11 HP112 0 13 23 0 12 HP12 0 18 22 0 13 HP411 0 18 40 14 14 HPN11 0 14 0 0 15 HP 11 0 13 20 0 16 HP412 0 0 15 0 17 HP31 0 0 18 0 18 HP22 0 7 0 0 19 CB12 0 0 0 0 20 CB13 0 0 0 0 21 CB11 0 0 16 0 22 CB14 0 0 0 0 22 VK1-1 0 12 17 0 23 VK1-2 0 18 19 0 24 VK2-2 0 0 0 0 25 VK3-1 0 0 17 0 26 VK4-1 0 0 16 0 27 VD2-1 0 8 10 0 28 VD2-2 0 10 11 0 29 VD311 0 0 13 0 30 VD321 0 0 0 0 31 VD111 0 10 15 0 32 VD112 22 16 23 18 33 VD114 0 0 20 0 34 VD115 0 14 13 0 35 BB11 0 0 0 0 36 BB12 0 0 0 0 37 BB13 0 0 0 0 38 BB14 0 0 0 0 39 HPT13 0 0 0 0 40 HPX12 0 0 20 0 Tổng số chủng có hoạt tính 8 19 28 7 Qua bảng 3.1 ta thấy, có 10 chủng không có khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định, 30 chủng có khả năng sinh chất kháng sinh; chiếm 75% số chủng xạ khuẩn phân lập được. Điều này cho thấy, vi sinh vật biển có tiềm năng lớn đối với ngành hóa dược, đặc biệt là xạ khuẩn, đòi hỏi chúng ta cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để khai thác nguồn lợi này. Trong 30 chủng có hoạt tính kháng sinh, có 5 chủng sinh chất kháng sinh kháng cả 4 chủng vi sinh vật kiểm định (NA113, NA1132, NA1134, NA115 và VD112); có 3 chủng kháng 3 loại vi sinh vật kiểm định; 10 chủng có khả năng kháng 2 loại vi sinh vật kiểm định và 12 chủng chỉ kháng được 1 loại vi sinh vật kiểm định. Hình 3.1. Tỉ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định S. epidermidis ATCC 12228, B. cereus ATCC 11778, B. subtilis ATCC 6633, C. albicans ATCC 10231. Trong 30 chủng sinh chất kháng sinh thì có 8 chủng có khả năng kháng S. epidermidis ATCC 12228, chiếm tỉ lệ 20%. Chủng có hoạt tính mạnh nhất là NA113 với vòng kháng khuẩn là 24 mm, sau đó là chủng NA115 và VD112 với vòng kháng khuẩn là 22 mm; chủng có hoạt tính yếu nhất là M415 với vòng kháng khuẩn có đường kính 9 mm. Có 32 chủng không có khả năng đối kháng với vi khuẩn S. epidermidis ATCC 12228; 19 chủng (chiếm 47,5%) có khả năng kháng vi khuẩn B. cereus ATCC 11778. Trong đó chủng có hoạt tính mạnh nhất là NA115 có VKK 21 mm, chủng có hoạt tính yếu nhất là HP22 với VKK là 7 mm. Có 28 chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng B. subtilis ATCC 6633 (chiếm 70%). HP411 là chủng có hoạt tính mạnh nhất (40 mm) tiếp theo đó là NA113 (25 mm), NA115 (24 mm) và VD112 (23 mm); chủng có hoạt tính kháng B. subtilis ATCC 6633 yếu nhất là NA119 (10 mm) và VD2-1 (10 mm); 12 chủng không có khả năng đối kháng với vi khuẩn B. subtilis ATCC 6633. VD112 và NA1134 là 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm men C. albicans ATCC 10231 mạnh nhất (18 mm); NA113 là chủng có hoạt tính yếu nhất (9 mm) và có tới 33 chủng không có khả năng sinh kháng sinh kháng C. albicans ATCC 10231 và chỉ có 17,5% số chủng có khả năng sinh kháng sinh kháng chủng nấm men này. Hình 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn 3.2. Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn 3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy Từ 30 chủng có hoạt tính kháng sinh chúng tôi đã chọn ra 2 chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn bao gồm NA113 và NA115. Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên các môi trường ISP khác nhau; sau đó xác định đặc điểm hình thái, màu sắc, khả năng sinh sắc tố và melanin trên môi trường theo chương trình phân loại xạ khuẩn quốc tế ISP. Màu sắc của khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh được so với bảng màu của Tresner và Backus (1963). Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Màu sắc của các chủng xạ khuẩn trên các môi trường ISP khác nhau Kí hiệu chủng Môi trường Khuẩn ti Sắc tố KTKS KTCC Săc tố tan Melanin NA113 ISP1 Xám 5fe Đỏ 5gc - - ISP2 Xám 3ge Xám nâu 7ih - ISP3 Xám 2fe Đỏ nâu 4ea Đỏ nâu 4ge ISP4 Trắng a Trắng a - ISP5 Trắng b Xám 41i Xanh 18ec ISP6 Đỏ 4ea Đỏ 5gc - - ISP7 Xám 2dc Xám 3ig - - NA115 ISP1 Xám 4ig Đỏ 7ca - - ISP2 Xám 5fe Xám 3ih - ISP3 Xanh 11/2ge Đỏ 4ge - ISP4 Xám d Tím 11ac Đỏ 6ec ISP5 Đỏ 5dc Đỏ 5gc Xanh 19ge ISP6 Đỏ 7ca Đỏ 4ie - - ISP7 Trắng a Vàng 2fe - - Qua bảng 3.2 ta thấy cả 2 chủng NA113 và NA115 đều thuộc nhóm xám (Gray), đều sinh sắc tố tan trên các môi trường khác nhau. Chủng NA113 sinh sắc tố nâu đỏ trên môi trường ISP3 và xanh tím than trên môi trường ISP5. Chủng NA115 sinh sắc tố cam trên môi trường ISP4 và sắc tố xanh trên môi trường ISP5. Qua quan sát cho thấy cả 2 chủng đều không sinh melanin, không làm thay đổi màu sắc của môi trường ISP1, ISP6 và ISP7. Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của chủng NA113 trên môi trường ISP2, ISP3 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của chủng NA115 trên môi trường ISP2, ISP3 3.2.2. Đặc điểm hình thái Để nghiên cứu đặc điểm hình thái của xạ khuẩn, nuôi cấy các chủng trên môi trường ISP2 trong thời gian 14-28 ngày ở 37oC. Sau đó quan sát hình thái cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi quang học và hiển vi điện tử quét. Đối với xạ khuẩn, đặc điểm của cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử là đặc điểm phân loại rất quan trọng. A B Hình 3.5. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA113 Qua quan sát cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn đều có bề mặt bào tử trơn, nhẵn. Chủng NA113 có cấu trúc chuỗi bào tử chùm 2 - 4 nhánh, đầu hơi xoắn móc câu (RF), trên mỗi chuỗi bào tử có từ 3 - 15 bào tử. Chủng NA115 có chuỗi bào tử dài, xoắn nhiều vòng (RFS), số lượng từ 10 – 50 bào tử trên mỗi chuỗi. A B Hình 3.6. Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA115 3.3. Đặc điểm sinh lí - sinh hóa 3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn nitơ Để đánh giá khả năng sử dụng nguồn nitơ, chúng tôi nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP8 có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau với tỉ lệ 1%. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Khả năng sử dụng các nguồn nitơ của các chủng xạ khuẩn Nguồn nitơ Chủng xạ khuẩn NA113 NA115 L-Asparagin monohydrat + + L-Histidine monohydrat - - L- Phenylalanin ± - L-Leucin ++ + L-Tryptophan + + L-Arginin monodo - - L-Isoleucin + ++ L-Valin - - L-Methionin - ± L-Lysin - + L-Threonin + + L-Cystein - + 2 Amino 2 hydroxy-methyl 1,3 promo - + (NH4)2SO4 - ± NH4Cl - + Yeast extract (cao nấm men) ++ ++ Trypton ++ ++ Casein + + Pepton ++ ++ Bột đậu tương + + Đối chứng âm (ISP8) ± ± Ghi chú: - Không sinh trưởng, ± Sinh trưởng yếu, + Sinh trưởng bình thường, ++ Sinh trưởng tốt Qua bảng 3.3 ta thấy, chủng NA113 có khả năng sinh trưởng tốt trên các nguồn nitơ L-leucin, cao nấm men, pepton, trypton. Không sinh trưởng trên môi trường sử dụng nguồn nitơ L-histidine monohydrat, L-arginin monodo, L-valin, L-methionin, L-lysin, L-cystein, 2 amino 2 hydroxy-methyl 1,3 promo và trên môi trường có nguồn nitơ vô cơ. Chủng NA115 không có khả năng sinh trưởng khi sử dụng nguồn nitơ L- phenylalanin, L-arginin monodo và L-valin. Sinh trưởng mạnh nhất trên môi trường có L-isoleucin, cao nấm men, trypton và pepton. Cả hai chủng đều sinh trưởng yếu trên môi trường đối chứng âm