Luận văn Nghiên cứu phương pháp động học huỳnh quang xác định tyrosin dựa trên phản ứng với phức ruteni(ii) polypiridin

thông tin liên lạc giữa các tế bào thần kinh tác động đến tâm trạng của con ngƣời [14,19,29]. Đồng thời Tyrosin ảnh hƣởng đến các hoạt động của tuyến thƣợng thận, tuyến giáp và tuyến yên, giữ nhiệm vụ sản xuất và điều chỉnh các nội tiết tố (melanin,). Trong thực tế, Tyrosin thƣờng đƣợc bổ sung vào cơ thể từ những loại thực phẩm nhƣ sữa, phô mai, trứng, đậu nành [42] Mặt khác, Tyrosin là một mắt xích quan trọng trong chu trình quang hợp (photosytem II - PS II) của cây xanh, nó đóng vai trò nhƣ một chất cho electron dẫn đến phản ứng tạo thành O2 và H2O. Định lƣợng axit amin rất quan trọng trong các nghiên cứu phân tích đánh giá thành phần dinh dƣỡng của thực phẩm. Định lƣợng một số axit amin nhƣ Tyrosin, Tryptophan, cũng rất quan trọng trong y sinh học khi nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng các tiền chất tham gia trong quá trình sinh tổng hợp và trong quá trình trao đổi chất ở cơ thể sống. Tyrosin có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp so màu [32], quang phổ đo quang [48], phổ huỳnh quang phân tử [43] và phổ biến nhất là phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ huỳnh quang (HPLC/FLD) [4,34,39]. Tuy nhiên, mỗi phƣơng pháp đều có những hạn chế riêng. Chẳng hạn nhƣ với HPLC/FLD, thƣờng phải tạo dẫn xuất axit amin để tăng độ nhạy của phép phân tích. Việc tạo dẫn xuất phải trải qua nhiều bƣớc để cho hợp chất huỳnh quang ổn định, tách tốt và có độ lặp lại cao. Nói chung, phƣơng pháp truyền thống trên có nhƣợc điểm là tốn thời gian để chuẩn bị mẫu và đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền. Mục tiêu của luận văn này nhằm nghiên cứu một phƣơng pháp mới đơn giản và tiết kiệm thời gian để định lƣợng amino axit Tyrosin. Do đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp động học huỳnh quang xác định Tyrosin dựa trên phản ứng với phức Ruteni(II) polypiridin”. 2 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Tyrosin Tyrosin (Tyr hoặc Y) hay còn gọi là 4-hydroxyphenylalanine là một trong 20 loại axit amin để tổng hợp protein [37]. Từ “tyrosine” trong tiếng Hy lạp đƣợc gọi là Tyros, có nghĩa là phô mai và đƣợc phát hiện lần đầu tiên năm 1846 bởi nhà hóa học ngƣời Đức tên là Justus Von Liebig trong protein casein. (a) (b) Hình 1.1. (a) Cấu trúc phân tử của Tyrosin; (b) Cấu trúc lập thể của Tyrosin  Đồng phân cấu trúc của Tyrosin Tyrosin có ba loại đồng phân cấu trúc đó là para-tyrosin, meta-tyrosin và ortho-tyrosin đều có trong tự nhiên. Tuy nhiên m-tyr và o-tyr ít xuất hiện hơn p-tyr nhƣng chúng có thể đƣợc tổng hợp [30]. m-tyrosin đƣợc ứng dụng khá rộng rãi trong cuộc sống đặc biệt là y học, m-tyr có thể dùng để chữa một số bệnh nhƣ Parkinson, Alzheimer và bệnh viêm khớp [21]. 3 Hình 1.2. Một số cấu trúc đồng phân của Tyrosin Tyrosin là một amino axit kỵ nƣớc, và hòa tan kém trong nƣớc so với các phenylalanine do sự ƣa nhiệt động học của các liên kết hydro giữa nhóm hydroxyl của một phân tử Tyrosin và nhóm carboxyl của các phân tử khác. Tuy là một amino axit không thiết yếu, đƣợc tìm thấy từ protein Casein, nhƣng lại rất cần thiết cho cơ thể. Trong quang hợp, Tyrosin là một mắt xích rất quan trọng. Nó đóng vai trò nhƣ một chất cho electron dẫn đến phản ứng tạo thành O2 và H2O ở diệp lục. Hình 1.3: Sự vận chuyển electron trong pha sáng của quá trình quang hợp (sơ đồ hình chữ Z)  Quá trình tổng hợp Tyrosin Ở thực vật và hầu hết các vi sinh vật, Tyrosin đƣợc tổng hợp thông qua prephenate nhờ chất trung gian là axit shikimate [11]. Prephenate là chất oxi hóa để khử carboxyl với việc 4 giữ lại nhóm hydroxyl và tạo ra p-hydroxyphenylpyruvate, một chất chuyển hóa các axit amin tạo ra tyrosin và -ketoglutarate. Hình 1.4 : Quy trình tổng hợp tyrosin từ prephenate Ở động vật có vú, tyrosin đƣợc tổng hợp từ amino axit thiết yếu phenylalanine (phe) có nguồn gốc từ thực phẩm. Sự chuyển đổi phe thành Tyrosin nhờ chất xúc tác là ezyme phenylalanine hydroxylase.  Quá trình chuyển hóa của Tyrosin và phenylalanine [40]: 5 Hình 1.5: Quá trình chuyển hóa phenylalanine và tyrosin thành các chất dẫn xuất sinh học. Tyrosin còn là nguyên liệu nền cho một số chất dẫn truyền thần kinh trong não bộ [42], giúp cho quá trình truyền thông tin liên lạc giữa các tế bào thần kinh tác động đến tâm trạng của con ngƣời [14,19,29]. Trong hệ thống dopaminergic ở não bộ, tyrosin đƣợc chuyển thành L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) [11] nhờ ezyme tyrosine hydroxylase (TH). Ngoài ra, đối với các hormon ở tuyến giáp nhƣ triodothyronine ( và thyroxine ( cũng đƣợc tạo thành từ Tyrosin. 6 Hình 1.6: Con đường tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh catecholamines ở não bộ Tyrosin giúp cơ thể sản sinh ra melanine, là một sắc tố quy định màu da và tóc. Đồng thời Tyrosin ảnh hƣởng đến các hoạt động của tuyến thƣợng thận, tuyến giáp và tuyến yên, giữ nhiệm vụ sản xuất và điều chỉnh các nội tiết tố [19]. Nếu hàm lƣợng Tyrosin trong cơ thể thấp, chúng ta có thể mắc một số bệnh nhƣ huyết áp thấp, thân nhiệt giảm, tuyến giáp hoạt động kém hiệu quả. 7  Hàm lƣợng Tyrosin trong một số mẫu thực tế: Trong thực tế, Tyrosin đƣợc cung cấp vào cơ thể qua rất nhiều loại thực phẩm khác nhau, mỗi loại thực phẩm chứa hàm lƣợng Tyrosin nhất định. Hàm lƣợng Tyrosin trong một số mẫu thực tế đƣợc thể hiện ở bảng 1.1: Mẫu Hàm lƣợng Tyr/100g khẩu phần ăn đƣợc Mẫu Hàm lƣợng Tyr/100g khẩu phần ăn đƣợc Gạo nếp cái 111 mg Khoai lang 48 mg Gạo nếp máy 228 mg Khoai sọ 54 mg Cà rốt 22mg Khoai tây 47 mg Gạo tẻ máy 221mg Cùi dừa 103 mg Gạo nứt 281mg Đậu đen 608 mg Hạt kê 216 mg Đậu đũa 592 mg Ngô bắp tƣơi 140 mg Đậu Hà lan 711 mg Ngô vàng hạt khô 350 mg Đậu tƣơng 988 mg Bột mỳ 142 mg Đậu trắng hạt 631 mg Sắn 17 mg Đậu xanh 556 mg Hạt điều 508 mg Cải bắp 31 mg Lạc 669 mg Cải thìa 29 mg Vừng 712 mg Cải xanh 143 mg Sữa đậu nành 108 mg Củ cải trắng 12 mg Bí ngô 18 mg Dƣa chuột 18 mg Cà chua 12 mg Cà pháo 47 mg Bảng 1.1: Hàm lượng Tyrosin trong một số mẫu thực tế 1.2. Phƣơng pháp phân tích Tyrosin 1.2.1. Phương pháp so màu Tác giả Otto Folin và W. Denis [32] đã sử dụng phƣơng pháp so màu để xác định Tyrosin trong tóc, móng, protein, Mẫu đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: cân chính xác một gam protein khô, chuyển vào bình Kjeldahl 50 ml và thêm 25 ml axit hydrochloric 20%. Mẫu đƣợc thủy phân trong 12 giờ, lấy mẫu, để nguội và chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml. Thêm 5 ml thuốc thử Tyrosin, sau 5 phút thêm 25 ml dung dịch Na2CO3. Hỗn hợp sau đó 8 đƣợc làm lạnh. Màu của mẫu rõ nhất sau khoảng 10 phút, vì vậy phải đo màu trong khoảng 10 phút này. Sử dụng thiết bị đo màu Duboscp để so sánh màu với dung dịch Tyrosin chuẩn và xác định nồng độ của Tyrosin trong mẫu. Kết quả phân tích hàm lƣợng Tyrosin trong một số mẫu nhƣ sau: lông cừu chứa 6,0 %, tóc ngƣời 4,3 %, đậu trắng 4,5 %, . Bằng việc sử dụng phƣơng pháp so màu, tác giả và cộng sự đã xác định đƣợc Tyrosin trong một số mẫu. Phƣơng pháp khá đơn giản tuy nhiên cho kết quả chƣa sát với phƣơng pháp truyền thống. Bên cạnh đó, khi sử dụng phƣơng pháp so màu, thuốc thử có thể phản ứng với các amino axit khác trong protein gây ảnh hƣởng đến quá trình phân tích. 1.2.2. Phương pháp quang phổ đo quang Năm 1985, C.S.P. Sastry và cộng sự đã nghiên cứu định lƣợng Tyrosin bằng phƣơng pháp quang phổ đo quang [38]. Phổ hấp thụ đƣợc đo trên máy quang phổ Systronics 105 (MKI). Phƣơng pháp phân tích nhƣ sau: - Xây dựng đƣờng chuẩn: Lấy 0,3 – 3 ml Tyrosin cho vào bình định mức 10 ml. Thêm 7,9 ml nƣớc cất, 0,1 ml NH4OH, 0,5 ml sodium metaperiodate, 1,5 ml 4-minophenazone. Đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng 470 nm, hàm lƣợng Tyrosin trong mẫu đƣợc xác định từ đƣờng chuẩn. - Thủy phân protein: Cân 0,2 g protein cho vào bình thủy phân, thêm 20 ml HCl 20 %. Mẫu đƣợc thủy phân theo phƣơng pháp của Udenfriend và Cooper (1952) trong 24 giờ. Hỗn hợp sau khi thủy phân đƣợc pha loãng ở tỷ lệ thích hợp ( 50 g tyrosin cho mỗi ml). Khoảng tuyến tính phân tích Tyrosin nằm trong khoảng 1,5-15 µg/ml. Hệ số hấp thụ mol và độ nhạy Sandell tƣơng ứng là 6,88 (l.mol-1.cm-1) và 0,026 µg.cm-2.. Khi phân tích trên 8 mẫu riêng biệt, độ lệch chuẩn tƣơng đối và sai số tƣơng đối lần lƣợt là 1,56 % và 1,2 %, độ thu hồi đạt 95,1 – 97%. Kết quả phân tích hàm lƣợng Tyrosin trong một số mẫu protein nhƣ sau: albumin từ trứng 2,78mg/100mg, vitellin 2,81mg/100mg, conalbumin 3,75mg/100mg. Phƣơng pháp này cho kết quả định lƣợng Tyrosin khá phù hợp với một số phƣơng pháp quang phổ đo quang nghiên cứu trƣớc đó. Phƣơng pháp có thể xác định Tyrosin mà không cần tách các amino axit khác tuy nhiên độ thu hồi của phƣơng pháp chƣa cao. 1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 9 Bảng 1.2: Tổng hợp các dẫn xuất xác định axit amin bằng HPLC TT Dẫn xuấta Detectơ LOD Thời gian phân tích Ƣu điểm Hạn chế 1 AQC Huỳnh quang (ex:250nm; em: 295nm) 160 fmol 35-50 phút dẫn xuất trƣớc cột Ổn định, tách tốt, độ nhạy, độ đúng, độ lặp lại cao 2 Dabsylclorid (4-4) Vis 436 nm < fmol 18-44 phút dẫn xuất trƣớc cột Ổn định, tách tốt, độ nhạy, độ lặp lại cao Nhiều sản phẩm phụ 3 Dabsylclorid (5-1) Huỳnh quang (ex:360-385 nm; em: 460- 495nm) < pmol 60-90 phút dẫn xuất trƣớc cột Ổn định Nhiều sản phẩm phụ 4 Fluorescamin Huỳnh quang (ex:390nm; em: 475nm) 20-100 pM 30-90 phút dẫn xuất trƣớc cột Ổn định, tách tốt Loại amin bậc 2, nhiễu nền 5 FMOC Huỳnh quang (ex:265nm; em: 320nm) 1 pM 20-45 phút dẫn xuất trƣớc cột Ổn định, tách tốt Nhiều sản phẩm phụ, phải loại bỏ thuốc thử dƣ 6 Ninhydrin Vis 440 nm (amin bậc 1), 570nm (amin bậc 2) 100 pM 30 phút dẫn xuất sau cột Độ lặp lại cao Độ nhạy kém, độ phân giải thấp 7 OPA Huỳnh quang (ex:340nm; em: 455nm) 50 fmol 17-35 phút dẫn xuất trƣớc cột, 90 phút dẫn xuất sau cột Tách tốt, độ nhạy, độ lặp lại cao Loại amin bậc 2, phản ứng dẫn xuất chậm, không bền, nhiễu nền 8 PITC UV 254nm 1 pM 15-27 phút dẫn xuất trƣớc cột Tách tốt, độ lặp lại cao Ảnh hƣởng bởi muối a AQC: 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamate 4-4: 4-N,N-dimethylaminoazobenzen-4’-sulfonylchloride 5-1: 5-N,N-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonylchloride FMOC: 9-fluorenylmethylchloroformate OPA: ortho-phthalaldehyde FITC: phenylisothiocyanate Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ huỳnh quang (HPLC/FLD) đƣợc dùng phổ biến để định lƣợng axit amin [4,34,39], tuy nhiên phải tạo dẫn xuất trƣớc khi phân tích (bảng 1.2). Việc tạo dẫn xuất phải trải qua nhiều bƣớc để cho hợp chất huỳnh quang ổn định, tách tốt, có độ nhạy và độ lặp lại cao. Do đó tốn nhiều thời gian chuẩn bị mẫu và đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền. 10 1.2.4. Phương pháp phổ huỳnh quang T.P. Waalkes và cộng sự đã nghiên cứu phƣơng pháp phổ huỳnh quang để xác định Tyrosin trong huyết tƣơng và mô [43]. Mẫu phân tích đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: lấy 1 ml mẫu, pha loãng bằng 4 ml nƣớc và 1 ml trichloroacetic 30%. Để hỗn hợp trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm. Lấy ra 2 ml dung dịch vào ống nghiệm, thêm 1 ml nitrosonaphthol và 1 ml axit nitric. Đặt ống nghiệm trong bể điều nhiệt ở 550C trong 30 phút, sau đó làm lạnh, thêm 10 ml ethylene dichloride và rung siêu âm. Mẫu tiếp tục đƣợc ly tâm, lọc lấy phần dung dịch và đo phổ: ex = 460 nm, em = 570 nm. Kết quả phân tích có độ thu hồi 91-100%. Độ nhạy của phƣơng pháp là 1 g/ml. 1.3. Tổng quan về phƣơng pháp phổ huỳnh quang phân tử 1.3.1. Hiện tượng huỳnh quang Một chất khi hấp thụ năng lƣợng ở giới hạn nào đó sẽ làm kích thích hệ electron phân tử. Ở trạng thái kích thích phân tử chỉ tồn tại s, nó lập tức trở về trạng thái cơ bản ban đầu và giải tỏa năng lƣợng dƣới dạng ánh sáng, hiện tƣợng này gọi là phát quang. Khi tác nhân kích thích là các tia tử ngoại hoặc phần có bƣớc sóng ngắn của ánh sáng khả kiến ta có hiện tƣợng phát quang quang học hay còn gọi là huỳnh quang [6, 8]. 1.3.2. Sự tạo thành phổ huỳnh quang - cơ chế của sự phát quang Theo thuyết lƣợng tử, mỗi hạt sơ cấp (ion, nguyên tử, phân tử) có một hệ thống duy nhất các trạng thái năng lƣợng. Trạng thái năng lƣợng thấp nhất gọi là trạng thái cơ bản ( ). Khi bị kích thích, nhƣ đƣợc hấp phụ photon ánh sáng thì năng lƣợng của photon sẽ đƣợc truyền sang hạt và hạt sẽ đƣợc chuyển sang năng lƣợng cao hơn gọi là trạng thái kích thích , ,......(ở mỗi trạng thái phân tử có thể tồn tại ở các phân mức năng lƣợng khác nhau 0, 1, 2, 3,....) sau một thời gian rất ngắn ( - giây) các hạt ở trạng thái kích thích sẽ trở về trạng thái cơ bản ban đầu theo một trong các hiện tƣợng dƣới đây [6, 8]: - Hiện tƣợng bất hoạt: Các phân tử ở mức năng lƣợng cao của trạng thái này trở về mức năng lƣợng thấp nhất của trạng thái và giải phóng ra năng lƣợng dƣới dạng nhiệt do va chạm giữa các phân tử làm tăng nhiệt độ môi trƣờng, gọi là hiện tƣợng phục hồi không bức xạ (thời gian phục hồi thƣờng nhỏ hơn giây). - Hiện tƣợng chuyển nội: Các nguyên tử từ mức thấp nhất của trạng thái kích thích chuyển về trạng thái cơ bản giải phóng ra năng lƣợng bằng cách bức xạ ra các photon 11 ánh sáng, gọi là sự phục hồi có bức xạ. Ánh sáng có bức xạ này gọi là huỳnh quang (kéo dài - giây). - Hiện tƣợng vƣợt nội hệ: Các phân tử ở trạng thái kích thích không chuyển về trạng thái cơ bản mà chuyển sang trạng thái siêu bền , sau đó từ T1 chuyển về S0 và bức xạ các photon ánh sáng làm cho quá trình phát quang chậm gọi là huỳnh quang chậm hoặc lân quang ( - 10giây). Trong hiện tƣợng phát quang, một phần năng lƣợng của ánh sáng kích thích bị tiêu tốn chuyển thành nhiệt năng do hiện tƣợng bất hoạt vì vậy năng lƣợng ánh sáng kích thích bao giờ cũng lớn hơn năng lƣợng ánh sáng bức xạ, hay nói cách khác bƣớc sóng của ánh sáng bức xạ luôn dài hơn bƣớc sóng của ánh sáng kích thích, tạo ra sự dịch chuyển cực đại phát quang về phía bƣớc sóng dài hơn so với cực đại hấp thụ, đó là sự dịch chuyển Stokes. Chất nào có độ dịch chuyển Stokes càng lớn thì phép đo huỳnh quang càng chính xác (vì ít bị ảnh hƣởng của phổ hấp thụ). 1.3.3. Cường độ huỳnh quang - Phƣơng pháp huỳnh quang dựa trên nguyên tắc [1, 6]: Khi chiếu một chùm tia tử ngoại (bức xạ kích thích) vào một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn thấy có bƣớc sóng xác định tùy thuộc từng chất và có cƣờng độ phụ thuộc vào hàm lƣợng của chúng. - Nếu ta chiếu xạ mẫu bằng một dòng bức xạ đơn sắc chứa photon có năng lƣợng ứng với hiệu năng lƣợng cần thiết cho quá trình hấp thụ thì một phần của cƣờng độ bức xạ tới sẽ bị hấp thụ và cƣờng độ bức xạ truyền qua I sẽ nhỏ hơn cƣờng độ bức xạ tới . Trong điều kiện nhất định cƣờng độ bức xạ huỳnh quang Ih sẽ tỷ lệ thuận với cƣờng độ bức xạ hấp thụ ( - I) theo: =k( - I) (1.1) Hằng số k phụ thuộc vào chất phân tích, môi trƣờng và có quan hệ với hiệu suất phát ra photon của nguyên tử hay phân tử khi từ trạng thái kích về trạng thái cơ bản. Cƣờng độ bức xạ truyền qua có quan hệ với nồng độ chất phân tích theo định luật Lambert – Beer: I= . (1.2) Thế phƣơng trình 1.2 vào phƣơng trình 1.1 ta có: =k(1- ) (1.3) 12 Phƣơng trình 1.3 có thể triển khai thành chuỗi Taylor cho kết quả là: = k [2,303 lC – + - ] (1.4) Nếu lC < 0,01 thì các số hạng bậc cao có giá trị không đáng kể (<1%) nên có thể bỏ qua và: = 2,303k lC = KC (1.5) Trong đó: I0 : Cƣờng độ bức xạ tới I : Cƣờng độ bức xạ truyền qua Ih : Cƣờng độ bức xạ huỳnh quang : Hệ số hấp thụ mol của chất phân tích l : Chiều dày của lớp dung dịch (cm) C: Nồng độ chất phát quang trong dung dịch ( mol/l) Tóm lại, trong điều kiện nồng độ bé (tức là có độ hấp thụ nhỏ, lC < 0,1), thì cƣờng độ bức xạ huỳnh quang sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích và với cƣờng độ bức xạ tới I0. Đây là cơ sở của phƣơng pháp huỳnh quang phân tử dùng xác định nồng độ C của chất phân tích theo cƣờng độ huỳnh quang Ih. Nếu dung dịch C có nồng độ lớn ( lC > 0,1) thì sẽ xảy ra sự tắt huỳnh quang, khi đó không còn sự tuyến tính giữa nồng độ và cƣờng độ huỳnh quang nữa. 1.3.4. Phổ huỳnh quang - Phổ kích thích: Là đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc của cƣờng độ phát quang tƣơng đối theo bƣớc sóng của ánh sáng kích thích [1,6]. - Phổ phát xạ: Là đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc của cƣờng độ phát quang tƣơng đối (cƣờng độ huỳnh quang của chất đã đƣợc hoạt hóa) theo bƣớc sóng của ánh sáng phát xạ. Lƣu ý: Khi ghi phổ huỳnh quang của một số chất ta thu đƣợc ngoài phổ huỳnh quang còn một số phổ khác nhƣ ánh sáng tán xạ của giải Raman, của dung môi và cốc đo, của ánh sáng tán xạ thứ cấp hay ánh sáng phản xạ nhƣng phổ huỳnh quang của mẫu vẫn thể hiện rõ rệt nhất và dựa vào phổ này ta có thể xác định đƣợc cực đại bức xạ của chất đó. 13 1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành huỳnh quang 1.3.5.1. Ảnh hưởng của cấu trúc phân tử đến hiệu suất huỳnh quang  Cấu tạo phân tử: - Các chất có dây nối đôi liên hợp thì có khả năng phát quang. Càng nhiều dây nối đôi liên hợp thì khả năng phát quang càng cao. Ví dụ: Các chất vô cơ hay các chất hydrocacbon no hầu nhƣ không phát quang. Các hợp chất thơm có khả năng phát quang và càng nhiều vòng thơm ngƣng tụ thì hiệu suất huỳnh quang càng lớn. - Các nhóm chức có khả năng cho điện tử thì làm tăng hiệu suất huỳnh quang. Ví dụ: -OH, - , ........ - Các nhóm chức có khả năng nhận điện tử thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang. Ví dụ: - , -COOH, -CHO,...... - Vị trí các nhóm thế trên nhân thơm có thể làm tăng hoặc làm giảm hiệu suất huỳnh quang. Ví dụ: Vị trí para và ortho làm tăng sự không định vị của điện tử trên nhân thơm, cũng làm tăng hiệu suất huỳnh quang. Ngƣợc lại vị trí meta thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang. - Đồng phân cis làm tăng khả năng phát quang và đồng phân trans làm giảm khả năng phát quang của hợp chất.  Độ cứng nhắc của phân tử. Các chất có cấu tạo cứng nhắc thì khả năng phát quang cao và ngƣợc lại. Ví dụ: Flourene, Flourescein: Phát quang mạnh Biphenyl, Malachite, phenophtalein: Không phát quang  Chất tạo dẫn: Có những hợp chất bình thƣờng phát quang yếu nhƣng khi tạo dẫn chất thì phát quang mạnh. Ví dụ: 14 Không phát quang Phát quang mạnh Tetracyclin Tetracyclin + + Barbiturat Hydrocortison Hydrocortison + + ethanol Vitamin B1 Thiocrom Adrenalin Adrenochrom 1.3.5.2. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang  Sự có mặt của các chất tan khác nhau: Có thể gây ra hiện tƣợng sau: - Hiệu ứng lọc nội: Các chất khác nhau có thể không phát quang nhƣng lại hấp thụ ánh sáng của chất phát quang làm giảm cƣờng độ huỳnh quang. - Sự làm tắt hóa học: Các chất khác làm tắt một phần hay toàn bộ cƣờng độ phát quang do va chạm hay làm biến đổi cấu trúc hóa học của chất phát quang. Cơ chế: F + h   F + h Trong đó F là chất phân tích có khả năng phát huỳnh quang ( ). Do va chạm nên: + Q  F + Khi đó Q đóng vai trò là chất làm tắt hóa học (quencher). Ví dụ: là Q của Quinin cho nên trong môi trƣờng HCl thì Quinin không phát quang. ADN là Q của Acridin nên trong các xét nghiệm sinh hóa có thể sử dụng Acridin trong định lƣợng.  Nồng độ ion , vai trò của pH: - pH có ảnh hƣởng lớn đến cƣờng độ phát quang. Một số chất có tính axit yếu hay bazơ yếu thì cƣờng độ phát quang phụ thuộc nhiều vào pH. Ví dụ: Ta có axit AH, trong nƣớc AH phân ly theo phƣơng trình: 15 AH  + Nếu dạng phát quang là AH thì khi tăng, phản ứng xảy ra theo chiều nghịch, khi đó F tăng. Nếu dạng phát quang là thì F sẽ giảm trong môi trƣờng axit và tăng trong môi trƣờng kiềm.  Ảnh hƣởng của dung môi: Cƣờng độ phát quang và bƣớc sóng cực đại thay đổi theo dung môi và những tác động khác nhau. Ví dụ: - Sự tắt huỳnh quang hóa học do dung môi: Quininsulfat phát quang mạnh trong môi trƣờng , nhƣng không phát quang trong môi trƣờng HCl. - Oxi hòa tan trong dung môi làm biến đổi hóa học chất phát quang, do đó oxi có ảnh hƣởng đến cƣờng độ phát quang. - Độ nhớt làm tăng cƣờng độ phát quang. - Độ tinh khiết của dung môi: Dung môi có tạp huỳnh quang làm sai lệch kết quả của phép đo.  Ảnh hƣởng của nhiệt độ: Nhiệt độ tăng làm giảm cƣờng độ phát quang do làm tăng tần số va chạm của phân tử làm cho hiện tƣợng bất hoạt tăng lên. Do vậy trong máy quang phổ huỳnh quang, đèn nguồn có công suất lớn nên phải có kính cách nhiệt hoặc có bộ phận làm mát đèn. 1.3.6. Máy quang phổ huỳnh quang Máy quang phổ huỳnh quang cũng có các bộ phận chính nhƣ: nguồn sáng, bộ phận đơn sắc hóa, buồng đo và bộ phận phát hiện. 16 Hình 1.7. Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang - Nguồn sáng trong máy quang phổ huỳnh quang có nhiệm vụ tạo ra bức xạ kích thích cần thiết. Nguồn sáng thƣờng dùng là đèn xenon có khả năng phát ra bức xạ trong khoảng rộng 200 – 800nm nhƣng phổ bức xạ không đều, các tia UV mạnh hơn các tia Vis. Ngoài ra ngƣời ta còn dùng nguồn cảm ứng laser. - Bộ đơn sắc hóa gồm 2 phần đơn sắc hóa bức xạ kích thích và đơn sắc hóa bức xạ huỳnh quang. Hai bộ phận này đƣợc bố trí trƣớc và sau buồng đo. - Buồng đo đƣợc bố trí sao cho phƣơng nguồn sáng và phƣơng thu tín hiệu vuông góc với nhau. Do đó cuvet sử dụng phải là cuvet có hai mặt trong suốt vuông góc với nhau hay cả 4 mặt trong suốt. Để tăng tín hiệu đến bộ phận thu ngƣời ta có thể bố trí thêm gƣơng phía đối diện. Nguyên tắc hoạt động: Nguồn sáng phát ra ánh sáng ở bƣớc sóng kích thích của chất phân tích có trong mẫu. Ánh sáng trƣớc khi truyền đến mẫu phải đi qua bộ phận đơn sắc kích thích, chỉ cho phép bƣớc sóng nhất định trong phổ kích thích của chất phân tích đi qua, còn các bƣớc sóng khác sẽ bị cản lại. Ánh sáng từ bộ đơn sắc kích thích đi qua mẫu chứa trong cuvet và kích hoạt chất phân tích. Sau khi kích thích, chất phân tích hấp thụ và phát ra ánh sáng ở bƣớc sóng phát xạ dài hơn bƣớc sóng kích thích. Ánh sáng phát xạ sẽ đi qua bộ lọc đơn sắc phát xạ ở vị trí góc bên phải so với ánh sáng kích thích. Bộ đơn sắc phát xạ giảm thiểu tán xạ ánh sáng và sẽ quét ánh sáng phát xạ trƣớc khi đến đƣợc bộ phận phát hiện (detector). Bộ phận phát hiện đo ánh sáng phát ra, hiển thị giá trị huỳnh quang và tạo ra các Nguồn sáng Khe chắn Khe chắn Cách từ nhiễu xạ Đơn sắc phát xạ Đơn sắc kích thích 17 tín hiệu huỳnh quang của chất phân tích. Giá trị huỳnh quang là tỷ lệ thuận với nồng độ của các chất phân tích trong mẫu. 1.3.7. Thiết bị đo quang phổ huỳnh quang theo thời gian Sơ đồ khối thiết bị quang phổ huỳnh quang theo thời gian time-domain đƣợc biểu diễn nhƣ ở hình 1.8. Hình 1.8. Sơ đồ khối hệ thiết bị quang phổ huỳnh quang phân giải thời gian (1) Nguồn sáng LED kích thích: Kích thích phổ huỳnh quang của chất nghiên cứu. (2) Bộ tạo xung – Function generator: Bật và ngắt xung để theo dõi cƣờng độ phát xạ huỳnh quang của chất nghiên cứu theo thời gian. (3) Nguồn cấp cho nguồn sáng LED (4) Cuvet chứa mẫu (5) Kính lọc sáng – long pass filter: Tránh ánh sáng tán xạ ảnh hƣởng tín hiệu phát xạ huỳnh quang. (6) PMT - ống nhân quang: Bộ phận thu nhận và chuyển đổi tín hiệu quang phát xạ thành tín hiệu điện. (7) Nguồn cấp cho PMT (8) Bộ hiện sóng- Oscilloscope: thu tín hiệu phát xạ huỳnh quang theo thời gian. Bộ hiện sóng Kính lọc sáng Cuvet chứa mẫu Nguồn sáng LED kích thích Bộ tạo xung 1 4 5 6 7 8 9 18 (9) Máy tính điều khiển: Xử lý số liệu, tính toán kết quả phân tích. 1.3.8. Ứng dụng của quang phổ huỳnh quang - Định tính: Có thể dựa vào bƣớc sóng kích thích và bƣớc sóng huỳnh quang để định tính các hợp chất. - Định lƣợng: Do phƣơng pháp huỳnh quang có độ nhạy và độ đặc hiệu cao:  Có thể đo cƣờng độ huỳnh quang và dùng phƣơng pháp so sánh để định lƣợng các hợp chất có khả năng phát huỳnh quang lớn.  Với những chất không có huỳnh quang có thể tác dụng với thuốc thử không huỳnh quang để tạo ra dẫn chất có huỳnh quang hay dùng thuốc thử có huỳnh quang để đo và sử dụng các cách xử lý thích hợp. - Phân tích động học – động học huỳnh quang: Phản ứng làm tắt huỳnh quang của phân tử chất phát quang S* bởi sự tƣơng tác với phân tử Q nhƣ sau: S* + Q  S + Q Vận tốc phản ứng: vQ = kq[S*][Q] Trong đó, kq là hằng số tốc độ phản ứng giữa S* và Q. Theo Stern-Volmer, kq đƣợc xác định theo phƣơng trình:  ⁄  (1.6) Trong đó:  và  tƣơng ứng là thời gian tồn tại hay thời gian “sống” (lifetime) của chất phát quang S* khi không có và khi có tƣơng tác với Q. Do đó, giá trị kq đƣợc tính từ hệ số góc của đƣờng thẳng biểu diễn mối quan hệ giữa đại lƣợng  ⁄ và [Q]. 19 Ngoài ra ghi phổ huỳnh quang còn đƣợc sử dụng trong bộ phận phát hiện của sắc ký lỏng, vì tính đặc hiệu cao và độ nhạy của nó với nguồn sáng laser nên giới hạn phát hiện có thể tới g. 1.3.9. Động học các quá trình phát quang Một chất khi hấp thụ bức xạ, phân tử đƣợc chuyển từ mức năng lƣợng này lên mức năng lƣợng khác cao hơn [