Luận văn Nghiên cứu qui trình tổng hợp liên tục và tinh chế celecoxib

2.3.1. Tổng hợp hóa học và tinh chế 2.3.1.1. Tổng hợp hóa học - Nghiên cứu triển khai các bước tổng hợp liên tục celecoxib ở quy mô phòng thí nghiệm theo quy trình: Bước 1: Tổng hợp liên tục 1-(4-methylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion đi từ 4-methylacetophenon và este của axit trifluoroacetic theo mô hình dòng chảy quy mô phòng thí nghiệm. Hình 2.1: Sơ đồ tổng hợp chất (6) Thiết bị sử dụng: Thiết bị phản ứng dòng Vapourtec seri E của hãng Vapourtec, vương quốc Anh. Các bộ phận chính của thiết bị: + 02 bơm, tốc độ từ 0,1 đến 10 ml, áp suất đến 10 bar + 01 ống phản ứng dung tích 10 ml, có điều nhiệt lên đến 1500C, chính xác ±10C Bước 2: Tổng hợp celecoxib Celecoxib được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ diketon với phenylhydrazin theo sơ đồ phản ứng sau: Hình 2.2: Sơ đồ tổng hợp celecoxib 2.3.1.2. Tinh chế Lần 1: Khảo sát kết tinh celecoxib thô bằng 3 loại dung môi : metanol, aceton, acetonitril. Lần 2: Khảo sát kết tinh lại celecoxib bằng 3 hệ dung môi: aceton/nước, acetonitril/nước, metanol/nước. 2.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc 2.3.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết - Đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy và định lượng phương pháp HPLC. - Phân tích thành phần, hàm lượng sản phẩm chính và sản phẩm phụ regioisome trong sản phẩm tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa Học, Viện KH&CN Việt Nam. Qui trình chung và điều kiện phân tích mẫu celecoxib như sau: + Pha dung dịch mẫu: cân chính xác khoảng 0,1mg mẫu hòa tan trong 1ml methanol. + Pha động: Dung môi A: Nước + 0.1% acid formic Dung môi B: Methanol Tỷ lệ dung môi A/B: 40/60. + Cột: Sunfire C18 5µm, 4,6x150 mm. + Nhiệt độ cột: 350C + Bước sóng (UV): 254nm + Thể tích bơm mẫu: 8µl + Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút + Thời gian chạy một mẫu: 35 phút 2.3.2.1. Khẳng định cấu trúc Các phương pháp phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR sẽ được sử dụng để khẳng định cấu trúc của celecoxib cũng như các chất trung gian trong quy trình tổng hợp. Các dữ liệu phổ được biện giải phù hợp với công thức dự kiến, có so sánh với các dữ liệu đã công bố. 2.3.3. Kết quả Celecoxib tổng hợp được mang kiểm nghiệm và xác định độc tính cấp (LD50) 2.3.3.1. Kiểm nghiệm celecoxib TCCS của sản phẩm được xây dựng dựa theo tiêu chuẩn của Công ty Aarti Drugs Limited (Ấn Độ) đang thương mại hóa trên thế giới. (phụ lục 29). - Tính chất + Bột kết tinh màu trắng. + Lấy khoảng 3 đến 4 g mẫu dàn đều thành lớp mỏng trên đĩa petri, quan sát bằng mắt dưới ánh sáng thường. - Định tính + Phổ hồng ngoại của mẫu kiểm nghiệm có cực đại hấp thụ trong phổ hoàn toàn tương ứng về vị trí tương đối như phổ của chất chuẩn. - Mất khối lượng do làm khô + Tiêu chuẩn theo CoA: Không được quá 0,5%. + Dùng chén cân thủy tinh có nắp mài làm bì đựng mẫu. Sấy khô chén đến khối lượng không đổi ở điều kiện chân không, 105oC trong 3 giờ. - Nhiệt độ nóng chảy + Nhiệt nóng chảy của chất thử phải nằm trong khoảng 159-162oC. + Sấy khô chất thử ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy. + Cho mẫu thử đã sấy khô vào mao quản thủy tinh có hàn một đầu cao khoảng 2,5 - 3,5 mm, và tiến hành đo nhiệt nóng chảy. - Định lượng + Không được nhỏ hơn 98,0% và không được lớn hơn 102% celecoxib tính theo chế phẩm khan. + Tiến hành bằng phương pháp HPLC. 2.3.3.2. Xác định độc tính cấp (LD50) * Phương pháp xác định độc tính cấp (LD50) Xác định LD50 trên đối tượng là chuột nhắt trắng trọng lượng từ 18 – 22g bằng đường uống hoặc đường tiêm. Chuột được nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm (thường là nhịn ăn qua đêm), uống nước bình thường. Cho chuột uống bằng kim cong đầu tù, đưa thuốc vào thẳng dạ dày chuột (trong trường hợp thử bằng đường uống). Thăm dò liều gây độc bằng cách cho uống liều tăng dần, theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết trong 72 giờ. Xác định liều tối đa không gây chết chuột và liều tối thiểu gây chết chuột 100%. Lập bảng số liệu thu được và tính LD50 theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon. Phương pháp này phải tiến hành vẽ đồ thị với trục hoành hiển thị liều dùng và trục tung hiển thị số chuột chết tương ứng với mỗi liều. Biểu diễn đường thực nghiệm và đường lý thuyết trên một đồ thị. Xác định phương trình tuyến tính bậc một và hệ số tương quan R. Nếu hệ số tương quan R > 0,9 thì có thể sử dụng phương trình này để xác định LD50. Tất cả việc tính toán và vẽ đồ thị trên đây được tiến hành trên phần mềm MS. Excel. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 3.1. Triển khai quy trình tổng hợp celecoxib ở quy mô phòng thí nghiệm . 4-methylacetophenone + isopropanol (IPA) NaOCH325%/CH3OH + isopropanol (IPA) Thiết bị phản ứng dòng liên tục Vapourtec Methyltrifluoroacetat + isopropanol (IPA) Sản phẩm ngưng tụ diketon (6) sạch (Dung dịch A) (Dung dịch B) 4-sulphonamidophenyl hydrazin hydroclorit Nhỏ từ từ, Khuấy đều 800C Sản phẩm celecoxib thô Sơ đồ chung: Hình 3.1: Sơ đồ tổng hợp Celecoxib Dựa vào các điều kiện thí nghiệm đã công bố và các hóa chất cho phép, tiến hành tổng hợp celecoxib theo một qui trình gồm hai giai đoạn để tổng hợp celecoxib. Bước 1, diketon (6) được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ Claisen giữa một keton và este trong môi trường bazơ. Bước 2, diketon (6) tạo thành trong dung dịch phản ứng được với 4-SAPH (7) để tạo thành celecoxib 3.1.1. Tổng hợp liên tục 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion 3.1.1.1. Thiết kế phản ứng tổng hợp liên tục 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion đi từ 4-metylacetophenon và este của axit trifluoroacetic theo mô hình dòng chảy quy mô phòng thí nghiệm. Tiến hành tổng hợp diketon (6) theo sơ đồ phản ứng sau: Hình 3.2: Sơ đồ tổng hợp chất (6) 4-metylacetophenone + isopropanol (IPA) NaOCH325%/CH3OH + isopropanol (IPA) Thiết bị phản ứng dòng liên tục Vapourtec Metyltrifluoroacetat + isopropanol (IPA) (Dung dịch A) Sản phẩm ngưng tụ diketon (6) Sơ đồ phản ứng chung: (Dung dịch B) (Dung dịch B) Hình 3.3: Phản ứng tổng hợp liên tục diketon 2 đi từ 4-metylacetophenon và este của axit trifluoroacetic trong mô hình phản ứng dòng chảy liên tục. Tiến hành thí nghiệm: Quy trình phản ứng sử dụng thiết bị Vapourtec Dung dịch 1 được chuẩn bị bên ngoài theo quy trình sau: 10ml 4-metylacetophenon (74,8 mmol, d=1,004) trong 10,5 ml IPA cho từ từ vào dung dịch 20 ml NaOCH3 25%/CH3OH (92,6 mmol) và 21 ml IPA, khuấy trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (25-30°C). Chuẩn bị dung dịch 2 gồm 9 ml metyltrifluoroacetat (89,5 mmol, d=1,273) trong 52,5 ml IPA. Cài đặt phần Collection Valve ở dạng Waste Phần Priming the pumps: Cả 2 kênh A, B đều đặt ở dạng Solvent (Ở đây ta dùng IPA). Đặt nhiệt độ phản ứng 1000C Tốc độ kênh A, Kênh B = 25µl/min Sau khi chạy Solvent ta chuyển chạy phản ứng (Chuyển kênh A, B sang dạng Reagent) Sản phẩm thu được sau khi chạy phản ứng được hứng vào bình cầu chứa HCl 10%. Kết thúc phản ứng ta ấn vào Stop Reaction Chuyển kênh A, B sang Solvent Chờ nhiệt độ về dưới 600C ta ấn vào Stop All Tắt máy Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển sang bình chiết chứa sẵn 42 ml dung dịch HCl 3N, lắc kỹ. Lớp nước được chiết 3 lần với EtoAc, mỗi lần 10 ml. Gộp các lớp hữu cơ, rửa 2 lần bằng nước, mỗi lần 10 ml, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 40°C tới khô kiệt, để qua đêm thu được sản phẩm. Kết quả - Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt. - Độ tan: tan tốt trong methanol, tan trong ethanol, isopropanol, etylacetat, toluen, DMF, không tan trong H2O. - Hiệu suất tổng hợp của phản ứng: Phản ứng được tiến hành 3 lần để tính hiệu suất trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6). STT Nguyên liệu 4-metylacetophenon (mmol) Sản phẩm (6) (g) Hiệu suất (%) Hiệu suất TB (%) 1 74,8 11,83 68,8 68,4 2 74,8 11,91 69,2 3 74,8 11,54 67,1 Phản ứng tổng hợp diketon (6) trong dung môi isopropanol với tác nhân là NaOCH3/CH3OH xảy ra tương đối dễ dàng nhưng hiệu suất chưa cao, có thể do điều kiện nhiệt độ, tốc độ dòng chảy, nồng độ của 4-metylacetophenon, nồng độ của metyltrifluoroacetat và không khí ẩm hoặc dụng cụ phản ứng hoặc dung môi chưa được sấy khô, làm khan nên chứa nước và giảm tính bền vững của các anion hình thành trong quá trình tách loại proton làm giảm hiệu suất. Để nâng cao hiệu suất của phản ứng chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát nồng độ tối ưu của 4-metylacetophenon, nồng độ tối ưu của metyltrifluoroacetat, khảo sát nhiệt độ tối ưu và tốc độ dòng chảy tối ưu của phản ứng. Tổng hợp 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion (2). Xác định nồng độ tối ưu của chất 4-metylacetophenon tham gia phản ứng theo mô hình dòng chảy Quy trình tổng hợp chung: Dung dịch 1 được chuẩn bị bên ngoài theo quy trình sau: 4-metylacetophenon trong IPA cho từ từ vào dung dịch 20 ml NaOCH3 25%/CH3OH (92,6 mmol) và 21 ml IPA, khuấy trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (25-30°C). Chuẩn bị dung dịch 2 gồm 9 ml metyltrifluoroacetat (89,5 mmol, d=1,273) trong 52,5 ml IPA. Cài đặt phần Collection Valve ở dạng Waste. Phần Priming the pumps: Cả 2 kênh A, B đều đặt ở dạng Solvent (Ở đây ta dùng IPA). Đặt nhiệt độ phản ứng 1000C. Tốc độ kênh A, Kênh B = 25µl/min. Sau khi chạy Solvent ta chuyển chạy phản ứng (Chuyển kênh A, B sang dạng Reagent). Sản phẩm thu được sau khi chạy phản ứng được hứng vào bình cầu chứa HCl 10%. Kết thúc phản ứng ta ấn vào Stop Reaction. Chuyển kênh A, B sang Solvent. Chờ nhiệt độ về dưới 600C ta ấn vào Stop All. Tắt máy. Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển sang bình chiết chứa sẵn 42 ml dung dịch HCl 3N, lắc kỹ. Lớp nước được chiết 3 lần với EtOAc, mỗi lần 10 ml. Gộp các lớp hữu cơ, rửa 2 lần bằng nước, mỗi lần 10 ml; cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 40°C tới khô kiệt, để qua đêm thu được sản phẩm. Kết quả - Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt. - Độ tan: tan tốt trong methanol, tan trong ethanol, isopropanol, etylacetat, toluen, DMF, không tan trong H2O. - Hiệu suất tổng hợp của phản ứng : Phản ứng được tiến hành 5 lần để tính hiệu suất trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6) trong thiết bị phản ứng dòng STT Nguyên liệu 4-metylacetophenon (mmol/ml) Hiệu suất (%) 1 0,4 80,90 2 0,8 81,20 3 1,6 81,1 4 3,2 80,8 5 4,0 79,03 Từ hiệu suất tổng hợp của các thí nghiệm cho thấy khi tăng dần nồng độ 4-metylacetophenon đạt tới 1,6mmol/ml, hiệu suất đạt ổn định khoảng 80%, tuy nhiên hiệu suất có xu hướng giảm dần khi tiếp tục tăng nồng độ 4-metylacetophenon lên 3,2 mmol/ml và 4,0 mmol/ml. Bước đầu kết luận, hiệu suất tốt nhất đạt được với nồng độ 4-metylacetophenon >1,6mmol/ml và < 3,2mmol/ml. Tổng hợp 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion (6). Xác định nồng độ tối ưu của este của axit trifluoroacetic tham gia phản ứng theo mô hình dòng chảy. Quy trình tổng hợp chung: Dung dịch 1 được chuẩn bị bên ngoài theo quy trình sau: 10ml 4-metylacetophenon (74,8 mmol, d=1,004) trong 10,5 ml IPA cho từ từ vào dung dịch 20 ml NaOCH3 25%/CH3OH (92,6 mmol) và 21 ml IPA, khuấy trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (25-30°C). Chuẩn bị dung dịch 2 gồm metyltrifluoroacetat trong IPA. Cài đặt phần Collection Valve ở dạng Waste Phần Priming the pumps: Cả 2 kênh A, B đều đặt ở dạng Solvent (Ở đây ta dùng IPA). Đặt nhiệt độ phản ứng 1000C Tốc độ kênh A, Kênh B = 25µl/min Sau khi chạy Solvent ta chuyển chạy phản ứng (Chuyển kênh A, B sang dạng Reagent) Sản phẩm thu được sau khi chạy phản ứng được hứng vào bình cầu chứa HCl 10%. Kết thúc phản ứng ta ấn vào Stop Reaction Chuyển kênh A, B sang Solvent Chờ nhiệt độ về dưới 600C ta ấn vào Stop All Tắt máy Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển sang bình chiết chứa sẵn 42 ml dung dịch HCl 3N, lắc kỹ. Lớp nước được chiết 3 lần với EtoAc, mỗi lần 10 ml. Gộp các lớp hữu cơ, rửa 2 lần bằng nước, mỗi lần 10 ml; cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 40°C tới khô kiệt, để qua đêm thu được sản phẩm. Kết quả - Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt. - Độ tan: tan tốt trong methanol, tan trong ethanol, isopropanol, ethylacetat, toluen, DMF, không tan trong H2O. - Hiệu suất tổng hợp của phản ứng : Phản ứng được tiến hành 5 lần để tính hiệu suất trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6) trong thiết bị phản ứng dòng STT Nguyên liệu metyl trifluoroacetat (đương lượng tính theo 4-metylacetophenon) Hiệu suất (%) 1 1,0 79,18 2 1,1 80,54 3 1,2 81,04 4 1,3 81,24 5 1,4 81,17 Từ hiệu suất tổng hợp của các thí nghiệm cho thấy khi tăng dần nồng độ metyltrifluoroacetat đạt tới 1,2 đương lượng tính theo 4-metylacetophenon, hiệu suất đạt ổn định khoảng 80%, tuy nhiên khi tiếp tục tăng nồng độ nồng độ metyltrifluoroacetat, hiệu suất không có cải thiện gì đáng kể. Bước đầu kết luận, hiệu suất tốt nhất đạt được với nồng độ metyltrifluoroacetat đạt tới 1,2 đương lượng tính theo 4-metylacetophenon. Tổng hợp 1-(4-metylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion (6). Xác định nhiệt độ tối ưu của phản ứng ngưng tụ Claisen trong hệ phản ứng dòng chảy thực nghiệm. Qui trình tổng hợp chung: Dung dịch 1 được chuẩn bị bên ngoài theo quy trình sau: 10ml 4-methylacetophenon (74,8 mmol, d=1,004) trong 10,5 ml IPA cho từ từ vào dung dịch NaOCH3 25%/CH3OH (1,3 đương lượng) và 21 ml IPA, khuấy trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (25-30°C). Chuẩn bị dung dịch 2 gồm 9 ml methyltrifluoroacetat (89,5 mmol, d=1,273) trong 52,5 ml IPA. Cài đặt phần Collection Valve ở dạng Waste Phần Priming the pumps: Cả 2 kênh A, B đều đặt ở dạng Solvent (Ở đây ta dùng IPA). Đặt nhiệt độ phản ứng Tốc độ kênh A, Kênh B = 50µl/min Sau khi chạy Solvent ta chuyển chạy phản ứng (Chuyển kênh A, B sang dạng Reagent) Sản phẩm thu được sau khi chạy phản ứng được hứng vào bình cầu chứa HCl 10%. Kết thúc phản ứng ta ấn vào Stop Reaction Chuyển kênh A, B sang Solvent Chờ nhiệt độ về dưới 600C ta ấn vào Stop All Tắt máy Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển sang bình chiết chứa sẵn 42 ml dung dịch HCl 3N, lắc kỹ. Lớp nước được chiết 3 lần với EtOAc, mỗi lần 10 ml. Gộp các lớp hữu cơ, rửa 2 lần bằng nước, mỗi lần 10 ml; cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 40°C tới khô kiệt, để qua đêm thu được sản phẩm. Kết quả - Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt. - Độ tan: tan tốt trong methanol, tan trong ethanol, isopropanol, ethylacetat, toluen, DMF, không tan trong H2O. - Hiệu suất tổng hợp của phản ứng : Phản ứng được tiến hành 5 lần để tính hiệu suất trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6) trong thiết bị phản ứng dòng STT Nhiệt độ phản ứng (oC) Hiệu suất (%) 1 90 74,25 2 100 78,25 3 110 79,67 4 120 78,04 5 130 74,94 Từ hiệu suất tổng hợp của các thí nghiệm cho thấy khi tăng dần nhiệt độ phản ứng từ 900C lên 1100C, hiệu suất đạt ổn định khoảng 80%, tuy nhiên khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên đến 1300C, hiệu suất lại giảm dần. Bước đầu kết luận, hiệu suất tốt nhất đạt được ở nhiệt độ 1100C. Tổng hợp 1-(4-methylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion (6). Xác định tốc độ dòng của phản ứng ngưng tụ Claisen trong hệ phản ứng dòng chảy thực nghiệm. Qui trình tổng hợp chung: Dung dịch 1 được chuẩn bị bên ngoài theo quy trình sau: 4-methylacetophenon (1,0 đương lượng) trong 10,5 ml IPA cho từ từ vào dung dịch NaOCH3 25%/CH3OH (1,3 đương lượng) và 21 ml IPA, khuấy trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (25-30°C). Chuẩn bị dung dịch 2 gồm methyltrifluoroacetat (1,2 đương lượng) trong 52,5 ml IPA. Cài đặt phần Collection Valve ở dạng Waste Phần Priming the pumps: Cả 2 kênh A, B đều đặt ở dạng Solvent (Ở đây ta dùng IPA). Đặt nhiệt độ phản ứng 110oC Đặt tốc độ kênh A, Kênh B Sau khi chạy Solvent ta chuyển chạy phản ứng (Chuyển kênh A, B sang dạng Reagent) Sản phẩm thu được sau khi chạy phản ứng được hứng vào bình cầu chứa HCl 10%. Kết thúc phản ứng ta ấn vào Stop Reaction Chuyển kênh A, B sang Solvent Chờ nhiệt độ về dưới 600C ta ấn vào Stop All Tắt máy Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển sang bình chiết chứa sẵn 42 ml dung dịch HCl 3N, lắc kỹ. Lớp nước được chiết 3 lần với EtOAc, mỗi lần 10 ml. Gộp các lớp hữu cơ, rửa 2 lần bằng nước, mỗi lần 10 ml, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 40°C tới khô kiệt, để qua đêm thu được sản phẩm. Kết quả - Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt. - Độ tan: tan tốt trong methanol, tan trong ethanol, isopropanol, ethylacetat, toluen, DMF, không tan trong H2O. - Hiệu suất tổng hợp của phản ứng : Phản ứng được tiến hành 5 lần để tính hiệu suất trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3.5: Hiệu suất tổng hợp của phản ứng tổng hợp chất (6) trong thiết bị phản ứng dòng STT Tốc độ dòng phản ứng kênh A, B (µl/min) Hiệu suất (%) 1 25 74,25 2 50 76,04 3 100 73,94 4 150 73,02 5 250 70,7 Từ kết quả khảo sát ta thấy ở tốc độ dòng phản ứng 50µl/min hiệu suất đạt giá trị cao nhất nhưng khi tăng tốc độ dòng thì hiệu suất giảm. Bước đầu kết luận hiệu suất phản ứng tốt nhất ở tốc độ dòng là phản ứng 50µl/min 3.1.1.2. Tổng hợp 1-(4-methylphenyl)- 4,4,4-trifluorobutan-1,3-dion (6). Xác định hiệu suất tối ưu của phản ứng ngưng tụ Claisen trong hệ phản ứng dòng chảy thực nghiệm. Qui trình tổng hợp chung: Dung dịch 1 được chuẩn bị bên ngoài theo quy trình sau: 10ml 4-metylacetophenon (1,0 đương lượng) trong 10,5 ml IPA cho từ từ vào dung dịch NaOCH3 25%/CH3OH (1,3 đương lượng) và 21 ml IPA, khuấy trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (25-30°C). Chuẩn bị dung dịch 2 gồm 9 ml metyltrifluoroacetat (1,2 đương lượng) trong 52,5 ml IPA. Cài đặt phần Collection Valve ở dạng Waste. Phần Priming the pumps: Cả 2 kênh A, B đều đặt ở dạng Solvent (Ở đây ta dùng IPA). Đặt nhiệt độ phản ứng 110oC. Đặt tốc độ kênh A, Kênh B 50µl/min. Sau khi chạy Solvent ta chuyển chạy phản ứng (Chuyển kênh A, B sang dạng Reagent). Sản phẩm thu được sau khi chạy phản ứng được hứng vào bình cầu chứa HCl 10%. Kết thúc phản ứng ta ấn vào Stop Reaction. Chuyển kênh A, B sang Solvent . Chờ nhiệt độ về dưới 600C ta ấn vào Stop All. Tắt máy. Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển sang bình chiết chứa sẵn 42 ml dung dịch HCl 3N, lắc kỹ. Lớp nước được chiết 3 lần với EtoAc, mỗi lần 10 ml. Gộp các lớp hữu cơ, rửa 2 lần bằng nước, mỗi lần 10 ml; cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 40°C tới khô kiệt, để qua đêm thu được sản phẩm. Kết quả - Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt. - Độ tan: tan tốt trong methanol, tan trong ethanol, isopropanol, ethylacetat, toluen, DMF, không tan trong H2O. Từ kết quả trên cho thấy phản ứng tổng hợp 4,4,4-trifluoro-1-(4-methylphenyl)butan-1,3-dion đạt hiệu suất tương đương với kết quả chúng tôi đã công bố trước đó khi thực hiện phản ứng trong bình khuấy [8], nhưng đã rút ngắn được thời gian phản ứng từ 24h xuống còn 3 – 6 h, và với nồng độ cơ chất cao hơn. Ngoài ra thiết bị sử dụng ổn định, an toàn và có độ lặp lại tốt. Phản ứng tổng hợp chất diketon(6) là phản ứng ngưng tụ, ở giai đoạn đầu tách proton là phản ứng thuận nghịch (hình 3.3), để phản ứng xảy ra theo hướng thuận thì môi trường phải không có chất cung cấp proton (ví dụ: H2O,), do đó phải tiến hành trong các dung môi khan. Ở đây chúng tôi sử dụng IPA và tất cả dụng cụ phải được sấy khô trước khi sử dụng. Hình 3.3: Cơ chế phản ứng ngưng tụ tạo chất (6). Qua quá trình thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng phản ứng tương đối dễ thực hiện và để có hiệu suất cao cần lưu ý một số điều kiện như sau: Base phải đủ mạnh để có thể tách proton của 4-methylacetophenon. Môi trường tiến hành phản ứng phải hạn chế sự có mặt của các chất có thể cung cấp proton (đặc biệt là nước). Các nguyên liệu và dung môi cần giữ khan nước tuyệt đối. Nhiệt độ phản ứng đủ cao. Kết luận: Nghiên cứu này đã tổng hợp thành công 4,4,4-trifluoro-1-(4-methylphenyl) butan-1,3-dion với thiết bị phản ứng dòng liên tục Vapourtec cho hiệu suất tối ưu của phản ứng đạt 81% tương ứng với điều kiện nhiệt độ 110oC, tốc độ dòng 50 µl/min, (tương ứng thời gian lưu 3,3 giờ), tỷ lệ mol methyltrifluoroacetat / 4-methylacetophenon là 1,2 đương lượng tính theo 4-methylacetophenon và nồng độ 4-methylacetophenon ≤ 3,2 mol/l. 3.1.2. Tổng hợp celecoxib Celecoxib được tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ diketon với phenylhydrazin theo sơ đồ phản ứng sau: Hình 3.5: Phản ứng tổng hợp celecoxib Nhằm nâng cao hiệu suất của phản ứng tổng hợp và hạn chế tỉ lệ sản phẩm phụ regioisomer (8), trong đó khảo sát một số điều kiện phản ứng như dung môi, nhiệt độ, tỉ lệ số mol 4-SAPH.HCl : diketon, nghiên cứu sự ảnh hưởng của các điều kiện trên đến hiệu suất, sự tạo thành celecoxib và sản phẩm phụ (8). 3.1.2.1. Khảo sát điều kiện dung môi trong phản ứng tổng hợp celecoxib. Các dung môi phản ứng được khảo sát bao gồm: - Metanol (MeOH): CH3OH - Etanol (EtOH): C2H5OH - Isopropanol (IPA): (CH3)2CHOH Quy trình tổng hợp chung: Cho vào bình cầu 1,5g (6,5 mmol) 4,4,4-trifluoro-1-(4-methylphenyl)butan-1,3-dion; 1,6g (7,15 mmol) 4-sulphonamidophenyl hydrazin hydroclorid; 20 ml dung môi. Hỗn hợp phản ứng được khuấy đều và đun hồi lưu ở 550C. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là n-hexan/etylacetat (6:4), dung môi hòa tan là CH3OH. Sau khi phản ứng kết thúc hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến 0-5° C. Lọc lấy kết tủa, rửa với H2O và sấy khô thu được sản phẩm. Kết quả - Cảm quan: Chất rắn màu trắng hoặc hơi vàng. - Độ tan: Tan tốt trong methanol, tan trong ethanol, ispropanol, ethylacetat, không tan trong nước. - Hiệu suất tổng hợp của phản ứng : Phản ứng được tiến hành 9 lần để tính hiệu suất trung bình. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 Bảng 3.6: Hiệu suất và thời gian của phản ứng tổng hợp celecoxib trong một số dung môi. Dung môi Lần thí nghiệm Nguyên liệu (g) Sản phẩm (5) (g) Hiệu suất (%) Hiệu suất TB (%) Thời gian phản ứng (giờ) (6) (g) (7) (g) MeOH 1 1,5 1,6 2,04 82,37 83,05 3,5 2 1,5 1,6 2,06 83,18 3 1,5 1,6 2,07 83,59 EtOH 1 1,5 1,6 2,11 85,20 84,66 5 2 1,5 1,6 2,08 83,99 3 1,5 1,6 2,10 84,80 IPA 1 1,5 1,6 2,21 89,24 88,97 5,5 2 1,5 1,6 2,17 87,62 3 1,5 1,6 2,23 90,05 Bên cạnh việc ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng, các dung môi khác nhau cũng ảnh hưởng tới độ tinh khiết của sản phẩm tạo thành. Hàm lượng celecoxib trong sản phẩm được định lượng bằng phương pháp HPLC. Kết quả được thể hiện ở phụ lục 1:3 bảng 3.7 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của dung môi lên sự tạo thành celecoxib. Mẫu Dung môi Celecoxib (%) Sản phẩm phụ (%) 3a MeOH 96,22 3,78 3b EtOH 97,10 2,90 3c IPA 98,81 1,19 Như vậy dung môi phản ứng có ảnh hưởng đến hiệu suất, thời gian phản ứng và sự tạo thành sản phẩm phụ, từ bảng 3.6 và 3.7 cho thấy hiệu suất phản ứng, tỉ lệ sản phẩm phụ khi tiến hành tổng hợp trong các dung môi MeOH, EtOH, IPA là khác nhau không nhiều, trong dung môi isopropanol cho hiệu suất cao hơn đáng kể, tỷ lệ sản phẩm phụ cũng thấp hơn, do vậy có thể lựa chọn isopropanol làm dung môi để tổng hợp celecoxib. 3.1.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol của 4-SAPH/diketon đến sự tạo thành celecoxib và sản phẩm phụ regioisomer Quy trình tổng hợp: Cho vào bình phản ứng 1,5g (6,5 mmol) 4,4,4-trifluoro-1(methylphenyl)butan-1,3-dion; 4-sulphonamidophenylhydrazin hydroclorit được cho vào theo tỷ lệ ở bảng 3.8; 20 ml isopropanol. Hỗn hợp phản ứng được khuấy đều và đun hồi lưu ở 550C. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là n-hexan/ethylacetat (6:4), dung môi hòa tan là CH3OH. Sau khi phản ứng kết thúc hỗn hợp phản ứng được đem đi phân tích HPLC để xác định tỷ lệ sản phẩm tạo thành giữa celecoxib và đồng phân regioisomer. Kết quả phân tích HPLC ở 3 tỷ lệ khác nhau được trình bày ở phụ lục 4÷7 và bảng 3.8. Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tỷ lệ 4-SAPH/diceton lên sự tạo thành celecoxib và sản phẩm phụ regioisomer. Mẫu Nguyên liệu Tỷ lệ mol (7)/(6) Celecoxib (%) Regioisomer (%) (6) (g) (7) (g) 3d 1,5 1,6 1,1:1 98,62 1,38 3e 1,5 2,18 1,5:1 95,97 4,03 3f 1,5 2,9 2:1 95,78 4,22 Như vậy tỷ lệ số mol giữa chất (6) và (7) là có ảnh hưởng đến sự tạo thành sản phẩm phụ, từ bảng 3.8 cho thấy ở tỷ lệ 2:1 thì sản phẩm phụ tạo ra nhiều nhất, ở tỷ lệ 1,1:1 sản phẩm phụ tạo ra là ít nhất, do đó có thể sơ bộ kết luận tỷ lệ càng gần đến 1:1 thì càng hạn chế được sự tạo thành sản phẩm phụ. Do đó, tỷ lệ 4-SAPH/diceton 1,1:1 được lựa chọn để tiến hành tổng hợp celecoxib. 3.1.2.3. Khảo sát điều kiện nhiệt độ Phản ứng tổng hợp celecoxib cũng được tiến hành ở các nhiệt độ khác nhau nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng, tỷ lệ tạo thành celecoxib và sản phẩm phụ. Quy trình tổng hợp: Cho vào bình cầu 1,5g (6,5 mmol) 4,4,4-trifluoro-1-(4-methylphenyl) butan-1,3-dion; 1,6g (7,15 mmol) 4-sulphonamidophenyl hydrazin hydroclorid; 20 ml IPA. Hỗn hợp phản ứng được khuấy đều và đun hồi lưu ở 3 điều kiện nhiệt độ khác nhau. Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là n-hexan/ethylacetat (6:4), dung môi hòa tan là CH3OH. Sau khi phản ứng kết thúc hỗn hợp phản ứng được làm lạnh đến 0-50 C. Lọc lấy kết tủa,