Luận văn Nghiên cứu sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính kháng hóa chất diệt côn trùng (pyrethroid) của muỗi aedes aegypti và muỗi aedes albopictus truyền bệnh sốt xuất huyết

biểu hiện của gen P.450 - Máy lắc Vortex có tốc độ tối đa 3000 vòng/phút - Máy li tâm thường, rotor sử dụng ống 2ml có tốc độ tối đa 12.000 vòng/phút - Máy li tâm lạnh, rotor sử dụng ống 2ml có thể điều khiển nhiệt độ từ 00C đến 990C, tốc độ tối đa 12,000 vòng/phút - Máy li tâm mini, rotor sử dụng ống 2ml tốc độ tối đa 10,000 vòng/phút - Máy lắc ủ nhiệt khô, block nhiệt sử dụng ống 2ml, có thể điều chỉnh nhiệt độ từ 00C đến 990C, có khả năng đặt thời gian chính xác đến phút, tốc độ lắc tối đa 3,000 vòng/phút 20 - Tủ lạnh thường ngăn mát nhiệt độ từ 00C đến 80C - Tủ lạnh sâu có nhiệt độ <-20°C - Máy luân nhiệt real-time (máy real-time PCR) - Bộ micropipette thể tích từ 0,1 đến 1000l - Giá đựng mẫu chứa được ống 1,5 ml, ống 0,5 ml và ống 0,2 ml - Ống Eppendorf 1,5 ml (sạch, không chứa DNase và RNase) - Ống có nắp vặn 1,5ml (sạch, không chứa DNase và RNase) - Ống Falcon 50ml (sạch, không chứa DNase và RNase) - Ống PCR 0,2 và 0,5ml (sạch, không chứa DNase và RNase) - Kìm cắt mẫu, có thể đục lỗ giấy thấm đường kính 5 mm - Giấy thấm Whatman 3M đã tiệt trùng - Đèn cồn. - Đầu tip có phin lọc hoặc sạch không chứa DNase và RNase - Bút đánh dấu. - Găng tay không bột tal. 2.4.4. Dụng cụ, vật liệu cho kỹ thuật giải trình tự xác định các đột biến điểm trên gen quy định tính kháng knock down Tương tự như của phương pháp Real-time Hệ thống giải trình tự thế hệ mới Giải trình tự bằng máy giải trình tự thế hệ mới (Illumina). Phân tích số liệu bằng phần mềm Sequence comparative analysis (SCAN). 2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.5.1.Thu thập muỗi tại các điểm nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang, tiến cứu điều tra muỗi và bọ gậy, thử nhạy cảm với các hóa chất diệt côn trùng, PCR xác định virút trong muỗi thu từ 21 thực địa. 2.5.1.1 Chọn mẫu, cỡ mẫu nghiên cứu - Đối với muỗi, bọ gậy Aedes thu thập ở thực địa: toàn bộ muỗi, bọ gậy thu được từ các hộ gia đình. - Số lượng hộ gia đình cần điều tra thu thập muỗi trong nghiên cứu tuân thủ theo quy định của Bộ y tế “QĐ số 3711/QĐ-BYT ngày 19 tháng 9 năm 2014 của Bộ Y tế về việc ban hành Hướng dẫn giám sát và phòng chống bệnh sốt xuất huyết Dengue”: Mỗi xã phường điều tra 100 hộ gia đình trong một lần điều tra. 2.5.1.2 Các bước tiến hành Thu thập muỗi trú đậu trong và ngoài nhà 100 hộ dân + Sử dụng máy hút muỗi Mospack để thu thập toàn bộ muỗi trong và ngoài nhà (xung quanh dụng cụ chứa nước, vườn cây). Mỗi hộ gia đình thu thập muỗi trong vòng 15 phút vào ban ngày. Muỗi được định loại, giữ sống nhân nuôi thành thế hệ F1. + Ghi chép thông tin muỗi thu được vào biểu mẫu điều tra. Thu thập bọ gậy trong các dụng cụ chứa nước trong và ngoài nhà khu vực điều tra: + Đối với các dụng cụ chứa nước lớn như bể nước, thùng phi, chum, vại lớn, giếng nông dùng vợt đường kính 22 cm để thu thập. + Đối với các dụng cụ chứa nước nhỏ như cây cảnh, bẫy kiến, máng ăn gia súc, hốc cây dùng pipet và gáo lọc để thu thập toàn bộ bọ gậy. Đối với các DCN là phế thải hay lốp xe, đổ toàn bộ nước ta khay chậu dùng pipet để thu thập toàn bộ bọ gậy. + Ghi chép thông tin các mẫu bọ gậy thu thậpvào biểu mẫu điều tra. + Nhân nuôi thành thế hệ F1. + Định loại muỗi, bọ gậy thu thập từ thực địa theo khóa định loại của Vũ 22 Đức Hương, 1997. 2.5.1.3 Biến số và đo lường biến số - Số lượng muỗi thu được của muỗi loài tại từng địa điểm điều tra - Số lượng bị gậy thu được tại từng địa điểm điều tra, nuôi theo từng địa điểm và định loại sau khi phát triển thành muỗi trưởng thành. 2.5.1.4. Các chỉ số đánh giá: Mật độ muỗi, nhà có muỗi, nhà có bọ gậy, Chỉ số các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: - Kỹ thuật thu thập muỗi - Kỹ thuật thu thập bọ gậy - Kỹ thuật định loại muỗi - Kỹ thuật nuôi muỗi 2.5.1.5 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu: Các kỹ thuật phải tuân thủ đúng theo hướng dẫn của quy trình chuẩn Số liệu thu thập được ghi vào biểu mẫu bằng giấy sau đó được nhập vào máy tính. Để tránh nhầm lẫn, số liệu được nhập 2 lần bởi 2 người khác nhau sau đó so sánh để có bộ số liệu chuẩn. 2.5.1.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: Mật độ muỗi: MĐM (con/nhà) = số muỗi cái từng loài muỗi/số nhà điều tra Nhà có muỗi: NCM (%): Số nhà có muỗi cái/số nhà điều tra x 100 Nhà có bọ gậy: NCBG: Số nhà có BG/số nhà điều tra x 100 Chỉ số BI: BI = DCCN có bọ gậy/số hộ điều tra x 100 2.5.2. Đánh giá độ nhạy cảm của muỗi với hóa chất diệt côn trùng Đánh giá độ nhạy cảm của muỗi thu thập từ các địa địa điểm nghiên cứu với 6 loại hóa chất thuộc 3 nhóm Chlo hữu co, phospho hữu cơ và pyrethoid. 23 - Giấy tẩm hóa chất theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới gồm các loại sau : Nhóm hóa chất Tên hóa chất Nồng độ tẩm trên giấy: Chlo hữu cơ DDT 4% Phospho hữu cơ Malathion 5% Pyrethroid Permethrin Deltamethrin Lambda cyhalothrin Alpha cypermethrin 0,75% 0,05% 0,05% 30 mg/m2 2.5.2.1. Mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu Muỗi cái Aedes thế hệ F1: 2-5 ngày tuổi, đủ chân cánh, khỏe mạnh. Tại mỗi địa điểm, với mỗi loại hóa chất cần tối thiểu 150 muỗi đủ tiêu chuẩn. 2.5.2.2. Các bước tiến hành Theo phương pháp của Tổ chức Y tế Thế giới, 2016 : Cho muỗi cái đủ tiêu chuẩn tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất 60 phút, theo dõi tỷ lệ muỗi ngã gục trong thời gian tiếp xúc và tính tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ. Thử nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 25±2oC, độ ẩm 70-80%. Mỗi hóa chất thử ít nhất với 150 muỗi cái, trong đó 100 muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất, 50 muỗi tiếp xúc với giấy đối chứng trong 1 giờ. Sau 24 giờ tính số muỗi chết và tỷ lệ muỗi chết. 24 Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm theo sơ đồ sau: Chuẩn bị ống nghỉ Cho muỗi vào ống nghỉ Muỗi nghỉ trước khi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất Chuẩn bị ống tiếp xúc Chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc Muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất Chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ Muỗi nghỉ sau tiếp xúc Đọc kết quả thử nghiệm Vệ sinh dụng cụ Bước 1. Chuẩn bị ống nghỉ: Lấy một tờ giấy trắng sạch có kích thước 12 x 15 cm, ghi trên tờ giấy tên hóa chất thử nghiệm, nồng độ hóa chất, loài muỗi thử, sau đó cuộn thành hình trụ và lồng vào bên trong ống nghỉ (chú ý quay mặt tờ giấy có ghi chữ ra phía ngoài), dùng kẹp bằng thép để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống. Lắp oongsn ghỉ vào tấm đế (tấm trượt) Bước 2. Cho muỗi vào ống nghỉ 25 Dùng ống hút hoặc tubes thủng hai đầu để bắt muỗi. Mỗi lần bắt muỗi không quá 10 con nếu sử dụng ống hút, nếu bắt bằng tubes thì mỗi lần bắt không quá 5 con. Muỗi được cho vào ống nghỉ qua lỗ tròn đường kính 20 mm trên phiến giữa của tấm đế. Cho 20 - 25 con muỗi vào một ống nghỉ. Hết sức cẩn thận trong khi hút bắt muỗi và chuyển muỗi vào ống nghỉ để tránh gây thương tích cho muỗi, vì nếu muỗi bị thương tổn sẽ dẫn đến tỉ lệ muỗi chết cao trong thử nghiệm. Bước 3. Muỗi nghỉ trước khi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất Sau khi đã cho đủ 20 - 25 con muỗi vào ống, để ống nghỉ ở tư thế thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên trên trong thời gian 1 giờ. Sau đó quan sát xem có muỗi nào bị thương (gẫy chân, gẫy cánh...) hoặc có vật kí sinh bám hay không. Nếu phát hiện thấy con muỗi nào bị thương hoặc có vật kí sinh thì dùng ống hút bắt ra khỏi ống và loại bỏ không dùng để thử nghiệm. Bước 4. Chuẩn bị ống tiếp xúc Cho vào mỗi ống tiếp xúc một tờ giấy tẩm hóa chất cần thử: cuộn tờ giấy tẩm thành hình trụ và lồng vào ống tiếp xúc. Chú ý khi cuộn tờ giấy cho vào óng tiếp xúc phải để mặt tờ giấy có in tên hóa chất và nồng độ háo chất quay ra ngoài, tức là có thể đọc được tên hóa chất và nồng độ háo chất in trên giấy qua thành ống. Dùng kẹp bằng đồng để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống. Bước 5. Chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc: Lắp ống tiếp xúc vào tấm đế của ống nghỉ (trong ống nghỉ đã có muỗi). Dịch chuyển phiến giữa của tấm đế đến vị trí mà ống nghỉ và ống tiếp xúc hoàn toàn thông với nhau (qua lỗ tròn đường kính 44 mm trên phiến giữa). Thổi hết sức nhẹ nhàng vào ống nghỉ để muỗi bay từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc. Sau khi muỗi đã bay hết sang ống tiếp xúc, dịch chuyển phiến giữa của tấm đế đến vị trí ngăn cách hoàn toàn ống nghỉ với ống tiếp xúc. Sau đó tháo ống nghỉ (lúc này không còn muỗi ở phía trong) ra khỏi tấm đế. Bước 6. Muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hóa chất: - Để ống tiếp xúc (có muỗi ở trong) ở vị trí thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên phía trên. Duy trì tư thế ống tiếp xúc như vậy trong suốt thời 26 gian tiếp xúc là 60 phút. Đặt ống tiếp xúc ở nơi có nhiệt độ ôn hòa, ánh sáng và độ ẩm thích hợp như đã nêu trong mục 4 “Điều kiện thử nghiệm”. - Quan sát, đếm và ghi số lượng muỗi ngã sau 60 phút kể từ lúc muỗi bắt đầu tiếp xúc với hóa chất. - Ghi nhiệt độ, độ ẩm nơi để ống tiếp xúc. Bước 7. Chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ: Ngay sau khi kết thúc thời gian tiếp xúc, chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ bằng các thao tác ngược lại với bước 5. Nếu có muỗi ngã (knock-down) trong quá trình tiếp xúc, thì trước khi chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ cần phải để ống tiếp xúc nằm ngang và gõ rất nhẹ vào ống để những con muỗi đã ngã rời khỏi phiến giữa của tấm đế. Lắp ống nghỉ vào tấm đế của ống tiếp xúc. Dịch chuyển phiến giữa của tấm đế đến vị trí mà ống nghỉ và ống tiếp xúc hoàn toàn thông với nhau. Thổi hết sức nhẹ nhàng vào ống tiếp xúc để muỗi di chuyển từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ. Sau khi muỗi đã di chuyển hết sang ống nghỉ, dịch chuyển phiến giữa của tấm đế đến vị trí ngăn cách hoàn toàn ống nghỉ với ống tiếp xúc. Sau đó tháo ống tiếp xúc (lúc này không còn muỗi ở phía trong) ra khỏi tấm đế. Bước 8. Muỗi nghỉ sau tiếp xúc: - Để ống nghỉ ở vị trí thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên trên. Đặt một miếng bông tẩm nước đường Glucose 10% lên trên lưới. Cần chú ý chỉ tẩm miếng bông với một lượng nước đường vừa phải để tránh không cho nước đường rơi vào trong ống nghỉ. - Giữ ống nghỉ trong 24 giờ ở nơi tách biệt, mát mẻ với nhiệt độ không quá 300C. Nếu điều kiện môi trường rất nóng và khô, thì phải cho oongsn ghỉ vào một chiếc hộp trong đó có treo khăn ẩm. - Ghi nhiệt độ tối đa và tối thiểu ở nơi để ống nghỉ trong khoảng thời gian theo dõi (24 giờ). - Cần có biện pháp đề phòng kiến ăn muỗi trong ống nghỉ. Cách phòng tránh kiến đơn giản là để các ống nghỉ lên một chiếc khay và đặt chiếc khay đó lên trên một chiếc khay khác có chứa nước. 27 Bước 9. Đọc kết quả thử nghiệm: - Tỷ lệ muỗi chết xác định sau 24 giờ. Những con muỗi được coi là còn sống nếu chúng bay được, bất kể chúng còn chân hay không. Vì vậy, không được coi những con muỗi nằm ở đáy ống nghỉ là những con muỗi chết, bởi vì muỗi thường rụng chân khi thử nghiệm với các hóa chất nhóm pyrethroid, và khi rụng chân thì muỗi sẽ nằm dưới đáy ống nghỉ mặc dù chúng vẫn còn sống. - Đề phòng những con muỗi còn sống bay mất, đặt một bát nhựa vào lồng muỗi 30 x 30 x 30 cm, sau đó cho ống nghỉ vào lồng, tháo ống nghỉ ra khỏi tấm đế và chuyển muỗi vào bát nhựa. Dùng panh côn trùng gõ nhẹ vào miệng bát, nếu con muỗi nào còn sống chúng sẽ bay lên. Sau đó dùng panh chạm nhẹ vào những con muỗi còn lại trong bát để kiểm tra xem có con nào còn sống hay không (nếu còn sống chúng sẽ bay lên khi panh chạm vào). Như vậy số lượng muỗi còn sống là những con bay lên khi bát được gõ nhẹ và khi đầu panh chạm vào cơ thể chúng. - Số muỗi còn lại không bay được thì coi là muỗi đã chết. Chuyển bát đựng muỗi chết ra khỏi lồng rồi đếm số lượng muỗi trong bát, và đếm số lượng muỗi còn sống ở trong lồng. Kết quả được ghi vào phiếu thử nghiệm. 2.5.2.3 Chỉ số đánh giá Tỷ lệ muỗi chết sau khi thử nghiệm 2.5.2.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu: Các kỹ thuật phải tuân thủ đúng theo hướng dẫn của quy trình chuẩn Số liệu thu thập được ghi vào biểu mẫu bằng giấy sau đó được nhập vào máy tính. Để tránh nhầm lẫn, số liệu được nhập 2 lần bởi 2 người khác nhau sau đó so sánh để có bộ số liệu chuẩn. 2.5.2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: - Nếu tỉ lệ muỗi chết trong lô đối chứng > 20% thì hủy bỏ thí nghiệm và làm lại. Cần xác định nguyên nhân gây ra tỷ lệ chết cao ở muỗi đói chứng và tìm giải pháp khắc phục. Một trong những lí do có thể dẫn đến tỷ lệ muỗi đối 28 chứng chết cao là muỗi đã được thu thập trong những ngôi nhà có sử dụng hóa chất diệt côn trùng (nhất là trong các nhà được phun tồn lưu). Trong trường hợp như vậy, cần phải tiến hành bắt muỗi ở những ngôi nhà không sử dụng hóa chất, hoặc tiến hành thử nghiệm với muỗi trưởng thành được nuôi lên từ bọ gậy. - Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng < 5% thì giữ nguyên tỷ lệ chết quan sát mà không cần điều chỉnh. - Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng nằm trong khoảng 5% - 20%, tỷ lệ muỗi chết ở lô tiếp xúc với hóa chất (tức muỗi thử nghiệm) được điều chỉnh theo công thức Abbott như sau: % muỗi chết thực nghiệm - % muỗi chết đối chứng  x 100 100 - % muỗi chết đối chứng + Đánh giá độ nhạy cảm với hoá chất diệt côn trùng - Tỷ lệ chết từ 98-100%: muỗi nhạy cảm với hoá chất - Tỷ lệ chết từ 80-97%: muỗi có thể kháng với hoá chất, cần thử nghiệm thêm để khẳng định. - Tỷ lệ chết dưới 80%: muỗi kháng với hoá chất. 2.5.3 Xác định biểu hiện của gen P450 bằng kỹ thuật real-time PCR 2.5.3.1 Mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu Mỗi quần thể muỗi tối thiểu 50 mẫu cho phân tích sinh học phân tử. Mỗi mẫu ít nhất 10 cá thể đã được thử nghiệm sinh học, muỗi tươi ngay sau khi thử nghiệm sinh học được bảo quản ở nhiệt độ tối thiểu -200C 2.5.3.2 Các bước tiến hành Tách chiết ARN Tách chiết ARN tổng số bằng RNeasy Mini Kit của hãng Qiagen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phân tích các quần thể muỗi bằng kỹ thuật real-time PCR để xác định mức độ biểu hiện của 4 locus gen P450 là CYP6BB2, CYP9M6, CYPJ26, CYP9J28 với locus gen RSP7 là locus chuẩn đối chứng + Tách chiết ARN Tách chiết ARN tổng số bằng RNeasy Mini Kit của hãng Qiagen theo hướng 29 dẫn của nhà sản xuất. + Kỹ thuật qRT-PCR dùng để xác định sự tồn tại và mức độ hoạt động của một số gen P450 ở dòng muỗi kháng so với dòng muỗi nhạy cảm. Sử dụng locus gen Ribosomal SP7 (RSP7) làm locus chuẩn đối chứng để xác định mức độ biểu hiện của các locus gen xác định tính kháng. Phản ứng RT-PCR được tiến hành với bộ kit Qiagen OneStep RT-PCR. Nghiện cứu đã sử dụng 5 cặp mồi, (1) CYP6BB2F và CYP6BB2R, (2) CYP9M6F và CYP9M6R; (3) CYPJ26F và CYPJ26R; (4) CYP9J28F và CYP9J28R; (5) RPS7-Aae F và RPS7-Aae R theo thiết kế của Reid và cs, IshakIntan và cs. 2.5.3.3 Chỉ số đánh giá Mức độ khuếch đại gen (2-∆∆CT) 2.5.3.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu: Các kỹ thuật phải tuân thủ đúng theo hướng dẫn của quy trình chuẩn Số liệu thu thập được ghi vào biểu mẫu bằng giấy sau đó được nhập vào máy tính. Để tránh nhầm lẫn, số liệu được nhập 2 lần bởi 2 người khác nhau sau đó so sánh để có bộ số liệu chuẩn. 2.5.3.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu Phân tích mức bộ biểu hiện và số lần khuếch đại của của các gen theo phương pháp của Schittegen T.D, 2008. Mức độ khuếch đại gen (2-∆∆CT) được tính theo công thức sau: 2-∆∆CT = (CT gen nghiên cứu - CT gen đối chứng) mẫu 1 - (CT gen nghiên cứu - CT gen đối chứng) mẫu 2 Trong đó CT là chu kỳ ngưỡng của phản ứng Real-time PCR. 2.5.4 Xác định các đột biến điểm trên kênh vận chuyển natri liên quan đến tính kháng hóa chất của Aedes aegypti và Aedes albopictus. 2.5.4.1 Mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu Mỗi quần thể muỗi tối thiểu 50 mẫu cho phân tích sinh học phân tử. Mỗi mẫu 1cá thể đã được thử nghiệm sinh học, muỗi tươi ngay sau khi thử nghiệm sinh học được bảo quản ở nhiệt độ tối thiểu- 200C 30 2.5.4.2 Các bước tiến hành Tách chiết ADN từ chân muỗi theo phương pháp sau: - Cắt chân của muỗi cho vào ống ly tâm 1,5 ml vô trùng, - Thêm 50 μl dung dịch tách chiết (5 M NaCl, 1mM Tris-HCl pH 8,6, 0,5 mM EDTA, pH 8,0). - Nghiền nát chân muỗi bằng chày nhựa chuyên dụng. - Ly tâm nhanh. - Ủ ở nhiệt độ 65° C trong 30 phút. - Ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng / phút trong 2 phút. - Thêm 7 μl Kac 8 M và ống được giữ ở -20 ° C trong 30 phút. - Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 20 phút - Hút dung dịch nổi sang ống mới. - Thêm 100 μl ethanol lạnh đã được thêm vào ống mới - Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng / phút trong 20 phút. - Loại bỏ dịch nổi và hòa tan kết tủa trong 50 μl TE (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0). Để xác định các đột biến kdr tiềm năng, sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại hai đoạn của vùng mã hóa của gen VGSC kéo dài từ exon 19 đến exon 31 (bao gồm các vị trí mã hóa 989, 1011, 1016 và 1534) và sau đó giải trình tự trực tiếp các mẫu để xác định các đột biến. Phản ứng PCR sử dụng 10 pmol của mỗi loại mồi (Kawada et al. 2014) và 20 ng ADN mẫu làm khuôn trong tổng phản ứng 25 μl chứa 1X Dream Taq , 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl2 và 1đơn vi Dream Taq (Thermo, Hoa Kỳ). Điều kiện chu kỳ là 95 °C trong 1 phút và 35 chu kỳ 95 ° C trong 10 giây, 55 ° C trong 30 giây và 72 ° C trong 30 giây, cuối cùng là 72 ° C trong 10 phút. Phản ứng PCR được thực hiện trên gradient EP Eppendorf Mastercycler. Xây dựng thư viện cDNA bằng kit mRNA-Seq Sample Prep (Part 1004898 Rev D, Illumina, USA), gắn adapter và tinh sạch trên gel agarose 2%. Làm giàu thư viện bằng PCR với cặp mồi gắn adapter đặc hiệu và tinh sạch bằng kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN, Germany). 31 Giải trình tự bằng máy giải trình tự thế hệ mới (Illumina). 2.5.4.3 Chỉ số đánh giá Các đột biến điểm giữa các exon từ 19 đến 21: tập trung vào các đột biến Ser989Pro, Ile1011Met, Val1016Gly và Phe1534Cys. 2.5.4.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu: Các kỹ thuật phải tuân thủ đúng theo hướng dẫn của quy trình chuẩn Số liệu thu thập được ghi vào biểu mẫu bằng giấy sau đó được nhập vào máy tính. Để tránh nhầm lẫn, số liệu được nhập 2 lần bởi 2 người khác nhau sau đó so sánh để có bộ số liệu chuẩn. 2.5.4.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: Để xác định các đột biến trên gen VGSC, kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự gen VGSC mã số XM019696519 trên Ngân hàng gen quốc tế GenBank bằng phần mềm BioEdit 7.0.9.0. 2.5.5. Đánh giá mối tương quan giữa 3 phương pháp đánh giá độ nhạy cảm, tính kháng hóa chất của các quần thể nghiên cứu. Sử dụng hệ số tương quan (r2) để phân tích mối tương quan giữa kết quả đánh giá độ nhạy kháng của 3 phương pháp. Công thức tính hệ số r như sau: Trong đó: r: là hệ số tương quan x và y: là các biến số x và y là giá trị trung bình của biến số x và y. 32 Bảng 2.1. Giá trị của hệ số tương quan và ý nghĩa TT Giá trị tuyệt đối của r Giá trị R 2 Ý nghĩa 1 0,01 đến 0,1 0,0001 đến 0,03 Mối tương quan quá thấp 2 0,2 đến 0,3 0,04đến 0,15 Mối tương quan thấp 3 0,4 đến 0,5 0,16đến 0,35 Mối tương quan trung bình 4 0,6 đến 0,7 0,36đến 0,63 Mối tương quan chặt chẽ 5 0,8 đến 1,0 0,64đến 1,0 Mối tương quan rất chặt 33 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ THU THẬP MUỖI TỪ CÁC ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.1.1. Số lượng muỗi Aedes aegypti và Aedes albopictus thu thập tại các điểm nghiên cứu Tiến hành thu thập mẫu tại 4 điểm nghiên cứu vào tháng 5 năm 2016 và tháng 10 năm 2017 nuôi muỗi thế hệ F1 phục vụ cho thử nghiệm sinh học và phân tích mức độ biểu hiện của gen kháng, kết quả được thể hiện tại bảng 3.1 và bảng 3.2. Bảng 3.1. Kết quả thu thập và nuôi muỗi Aedes aegypti TT Địa điểm thu thập Muỗi trưởng thành Bọ gậy Thế hệ F1 1 Trương Định, Hai Bà Trưng, Hà Nội 52 500 1510 2 Hưng Lộc, TP. Vinh, Nghệ An 75 743 1780 3 Hải Bình, Tĩnh Gia, Thanh Hóa 95 931 1975 4 Diên Phú, huyện Diên Khánh, tỉnh Khánh Hòa 125 1225 2082 Bảng 3.2. Kết quả thu thập và nuôi muỗi Aedes albopictus TT Địa điểm thu thập Muỗi trưởng thành Bọ gậy Thế hệ F1 1 Trương Định, Hai Bà Trưng, Hà Nội 15 57 308 2 Hưng Lộc, TP. Vinh, Nghệ An 71 174 380 3 Hải Bình, Tĩnh Gia, Thanh Hóa 43 31 217 4 Diên Phú, Diên Khánh, Khánh Hòa 23 75 302 Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loài muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus có mặt tại các điểm nghiên cứu của cả bốn tỉnh Hà Nội, Nghệ An, Thanh Hóa và Khánh Hòa. 34 Tuy nhiên phân bố giữa các điểm nghiên cứu không đồng đều, muỗi có số lượng lớn tại Khánh Hòa và Thanh Hóa trong khi đó số lượng muỗi nhỏ hơn được thu thập tại Hà Nội và Nghệ An. 3.1.2. Chỉ số muỗi và bọ gậy của Ae. aegypti và Ae. albopictus tại các điểm nghiên cứu Phân tích các chỉ số muỗi, bọ gậy của muỗi Ae. aegypti và Ae. albopictus trong hai đợt điều tra tại các điểm nghiên cứu được trình bày ở bảng 3 và bảng 4. Bảng 3.2. Chỉ số muỗi, bọ gậy Ae. aegypti tại các điểm nghiên cứu năm 2015 và 2016 TT Địa điểm Thời gian MĐM NCM BI NCBG DCBG P 1 Trương Định, Hai Bà Trưng, Hà Nội 5/2015 0,25 50 32 15 27,5 >0,05 10/2016 0,27 43 28 20 25,1 2 Hưng Lộc, TP. Vinh, Nghệ An 5/2015 0,38 32 20 18 17,3 >0,05 10/2016 0,37 37 18 17 16,8 3 Hải Bình, Tĩnh Gia, Thanh Hóa 5/2015 0,48 28 24 47 21,3 >0,05 10/2016 0,47 32 27 45 23,8 4 Diên Phú, Diên Khánh, tỉnh Khánh Hòa 5/2015 0,45 48 37 51 43,2 <0,05 10/2016 0,80 55 39 54 34,6 Ghi chú: MĐM: Chỉ số mật độ muỗi (con/nhà); NCM: Chỉ số nhà có muỗi (%), BI: Chỉ số Breteau; NCBG: Nhà có bọ gậy (%); DCBG: chỉ số dụng cụ chứa nước có bọ gậy Chỉ số muỗi và bọ gậy của Ae aegypti tại các điểm nghiên cứu vào tháng 5/2015 và tháng 10/2016 có mật độ muỗi > 0,25. Riêng khu vực xã Diên Phú, huyện Diên Khánh, tỉnh Khánh Hòa chỉ số mật độ muỗi cao tương 35 ứng 0,45 và 0,80 con/nhà, và chỉ số Breteau có >30 theo quy định của Bộ Y tế với các chỉ số này là ngưỡng cảnh báo dịch. Tại các điểm nghiên cứu khác chỉ Breteau cũng tương đối cao hầu hết > 20%, ngưỡng cảnh báo dịch so với miền Bắc. Dựa vào vị trí thu thập muỗi thấy 87,5% muỗi thu thập tại các điểm nghiên cứu trú đậu trong nhà, 78% bọ gậy sống ở các dụng cụ chứa nước nhân tạo trong nhà như bể nước, chum vại, chậu cây cảnh, lọ hoa. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cũng tương đồng với các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng muỗi Ae. aegypti sống gần người, thường có mật độ cao ở các khu vực đô thị đông dân cư Bảng 3.3. Chỉ số muỗi, bọ gậy Ae. albopictus tại các điểm nghiên cứu năm 2015 và 2016 TT Địa điểm Thời gian MĐM NCM BI NCBG DCBG P 1 Trương Định, Hai Bà Trưng, Hà Nội 5/2015 0,07 5 2 5 3,2 > 0,05 2 10/2016 0,08 7 5 6 4,3 3 Hưng Lộc, TP. Vinh, Nghệ An 5/2015 0,31 16 5 9 5,7 > 0,05 4 10/2016 0,40 23 7 12 4,8 5 Hải Bình, Tĩnh Gia, Thanh Hóa 5/2015 0,20 12 11 4 6,1 > 0,05 6 10/2016 0,23 15 9 2 5,8 7 Diên Phú, Diên Khánh, tỉnh Khánh Hòa 5/2015 0,10 11 3 3 5,2 < 0,05 8 10/2016 0,13 16 4 2 4,8 Ghi chú: MĐM: Chỉ số mật độ muỗi (con/nhà); NCM: Chỉ số nhà có muỗi (%), BI: Chỉ số Breteau; NCBG: Nhà có bọ gậy (%); DCBG: chỉ số dụng cụ chứa nước có bọ gậy 36 Các chỉ số muỗi và bọ gậy của Ae. albopictus tại các điểm nghiên cứu thu thập được thấp hơn rất nhiều so với các chỉ số này của Ae. aegypti. Muỗi được thu thập chủ yếu ngoài nhà, bọ gậy sống trong các dụng cụ chứa nước ngoài tự nhiên, và nhân tạo ở ngoài nhà như hốc cây, dụng cụ phế thải đọng nước. Muỗi Ae. aegypti có nguồn gốc từ Châu Phi nhưng do tập tính ưa sống gần người, quá trình di cư, nhập cư trên toàn thế giới, sự gia tăng đi lại, buôn bán, giao lưu giữa các khu vực đã đóng góp đáng kể vào sự lan truyền và phổ biến của muỗi Ae. aegypti sang các châu lục khác trên toàn thế giới. Hiện tại nó phân bố rất phổ biến ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới và được xác định là vectơ chính truyền bệnh SXHD. Muỗi Ae. albopictus hay dân gian còn gọi là muỗi hổ Châu Á tuy có nguồn gốc tại châu Á, nhưng với tập tính ưa trú đậu và đẻ ngoài nhà khả năng cạnh tranh phân bố không rộng như Ae. aegypti. Tuy nhiên , thực tế thời gian gần đây với sự phát triển đô thị hóa một cách nhanh chóng, Ae. albopictus đã có những thích nghi mở rộng vùng phân bố có xu hướng lan tới các vùng ngoại thành và cả nội thành của các thành phố lớn như Hà Nội, Nha Trang, Vinh Tại các khu vực thu thập mẫu khác nhau trong nghiên cứu ghi nhận tại Thanh Hóa và Khánh Hòa chỉ số mật độ muỗi trung bình khá cao cho cả hai loài muỗi Aedes. Không có sự khác biệt về các chỉ số muỗi và bọ gậy của Ae. aegypti trong hai đợt thu thập mẫu tại 3 điểm nghiên cứu phường Trương Định, quận Hai Bà Trưng, thành phố Hà Nội ; phường Hưng Lộc, thành phố Vinh, Tỉnh Nghệ An và xã Hải Bình, huyện Tĩnh Gia, tỉnh Thanh Hóa nhưng có sự khác biệt tại xã Diên Phú, huyện Diên Khánh, tỉnh Khánh Hòa. Không có sự khác biệt các chỉ số muỗi, bọ gậy của Ae. albopictus tại cả 4 điểm nghiên cứu. 37 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ NHẠY CẢM VỚI H