Luận văn Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn geobacillus stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa

ng kháng sinh bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử [25], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [9,21,62], 1.4.1. Phương pháp khẳng định (lý hoá) Phương pháp này cho phép có thể nhận diện chất kháng sinh tồn dư, định lượng chính xác và đối chiếu MRL (dư lượng tối đa cho phép). 1.4.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Sắc ký lỏng hiệu năng cao (còn được gọi là Sắc ký lỏng áp suất cao) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Hiện nay, HPLC đang ngày càng phát triển và được ứng dụng rất nhiều trong các ngành phân tích định tính và định lượng đặc biệt được ứng dụng trong phân tích dư lượng kháng sinh sữa, phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu , các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường Khả năng phát hiện dư lượng kháng sinh: HPLC có khả năng phát hiện tất cả các kháng sinh có mặt trong thực phẩm, các kháng sinh thuộc nhóm Betalactams, Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 13 Tetracyclines, Sulphonamides, Macrolides, Chloramphenicol, William và cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng kháng sinh tetracycline trong các mẫu thịt và sữa bò với ngưỡng phát hiện là 20-50 ppb trong mẫu thịt và 4-8 ppb trong các mẫu sữa [68], xác định được dư lượng kháng sinh Sulfamethazine ở 3 trong 4 mẫu sữa bò đã phân tích với hàm lượng 12,2 μg/kg cao hơn rất nhiều so với giới hạn cho phép [26]. Sử dụng phương pháp HPLC để xác định các dư lượng kháng sinh Cefotaxime và Cephalexine trong sữa, với giới hạn xác định tương ứng là 0,1 và 0,3 ng/ml [64]. Tác giả W. Hela và cộng sự [41] đã phát triển phương pháp HPLC với detector DAD để xác định 12 kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamid (SAs) trong thịt, gan, thận động vật (lợn, bò, gà). Tại Việt Nam, TCVN 8345- 2010 [2] qui định phương pháp xác định 10 SAs trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Phương pháp này cũng được áp dụng để xác định dư lượng các thuốc thú y có chứa Cephalexine. Phương pháp HPLC có thể kết hợp với các phương pháp sắc ký khác như sắc ký khí, khối phổ cho phép xác định chính xác các dư lượng kháng sinh trong các mẫu phân tích. HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược [40]. Hình 1.3. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 14 1.4.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography - HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry - MS). Phương pháp này đã được nghiên cứu để phát hiện đồng thời tồn dư nhóm Phenicol gồm Chloramphenicol (CAP), Thiamphenicol (TAP) và Florfenicol (FF) trong một số sản phẩm có nguồn gốc động vật. Trên thế giới, nhiều tác giả đã nghiên cứu thành công phương pháp xác định dư lượng CAP (Chloramphenicol) trong sữa bằng kỹ thuật sắc ký khác nhau. Gần đây với sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật sắc ký, áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ để phân tích CAP có nhiều ưu điểm nổi trội. Nhóm tác giả Yanbin Lu, Quing Shen [69] đã xác định được 13 SAs chỉ trong 7 phút với độ nhạy cao, LOQ từ 2-10 ppb bằng sự tương tác trực tiếp chiết pha rắn phân tán cột C18-Silica với sắc ký lỏng khối phổ chế độ bẫy tứ cực. Tác giả George Stubbings và cộng sự [39] đã ứng dụng kỹ thuật QuEChERS và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phát triển và thẩm định phương pháp phân tích dư lượng 30 thuốc thú y trong thịt gia súc, gia cầm. Ở trong nước, việc áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ để phát hiện dư lượng kháng sinh trong thực phẩm đã được triển khai. Kết quả nghiên cứu của Vũ Thị Trang [19] về việc xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) đã chỉ ra rằng phương pháp phân tích LC-MS/MS có độ nhạy cao, phân tích nhanh và chính xác, có thể áp dụng phân tích dư lượng 10 SAs với độ tin cậy cao. Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 15 Hình 1.4. Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS 1.4.1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các bản kính hoặc bản kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Các mẫu được áp dụng chủ yếu là dược phẩm và một số loại thực phẩm như sữa, mật ong, thịt, cá, Phương pháp này chủ yếu cho phép định tính sự hiện diện của các kháng sinh trong mẫu phân tích nhưng đôi khi cũng có thể xác định được lượng kháng sinh trong khoảng 0,4-0,6 μg/kg đối với Streptomycin, Kanamycin, Gentamycin [53], khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp, ví dụ Acetone-Methanol- Ammonia, 5:4,5:0,5 trong phân tích Streptomycin, Chloroform-Methanol- Ammonia, 1:1:1 trong phân tích Tetracycline. Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 16 Ưu điểm của phương pháp khẳng định lý hóa: Nhận diện rõ ràng, khả năng định lượng tốt, có độ nhạy cao, thích hợp cho việc khẳng định các chất cấm, các chất có dư lượng tối đa cho phép. Nhược điểm của phương pháp khẳng định lý hóa: Qui trình rất phức tạp (chuẩn bị, tách chiết, làm sạch), đòi hỏi thiết bị đắt tiền, cần kỹ thuật viên chuyên nghiệp cao, một số kháng sinh không có qui trình phân tích bằng phương pháp này. Do vậy phương pháp này không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. 1.4.2. Phương pháp sử dụng kỹ thuật nano Công nghệ nano đã tạo ra các loại vật liệu thế hệ mới có nhiều đặc tính siêu việt. Ưu điểm nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc nano trong tạo các cảm biến sinh học cho độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Hiện nay, việc ứng dụng các aptamer (là các oligonucleotide ssDNA, RNA hoặc các peptid có khả năng liên kết đặc hiệu với các phân tử đích) trong tạo cảm biến sinh học đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Lã Thị Huyền và cộng sự [11] đã công bố các kết quả cho thấy có thể sử dụng kỹ thuật nano để xác định sự có mặt của chất kháng sinh trong các mẫu nghiên cứu, cụ thể như: - Tạo được thư viện các aptamer (có bản chất ADN) có độ đa dạng cao để làm nguồn sàng lọc, thu nhận aptamer có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với từng kháng sinh trong số 4 kháng sinh thường sử dụng trong chăn nuôi: Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline. - Thu nhận và gắn kết aptamer với các hạt nano (hạt nano vàng hoặc sillica phát quang) để tạo phức hệ DNA-Au/DNA-sillica có khả năng gắn kết đặc hiệu với từng kháng sinh: Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline. - Sử dụng phức hệ DNA-Au/DNA-sillica để tạo được KIT xác định nhanh, chính xác dư lượng kháng sinh Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline trong sữa với thời gian 1,5-2 giờ và độ nhạy > 99%, độ đặc hiệu > 98%. Ưu điểm: xác định chính xác dư lượng kháng sinh trong sữa với thời gian ngắn, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 17 Nhược điểm: Cần có trang thiết bị đắt tiền và đội ngũ cán bộ thực hiện được đào tạo chuyên sâu. 1.4.3. Phương pháp sàng lọc (screening method) Đây là phương pháp được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của một hoặc một nhóm chất ở một nồng độ quan tâm hay để phân biệt giữa các mẫu đạt và mẫu không đạt yêu cầu vệ sinh. Phương pháp này thường được thiết kế để tránh tối đa kết quả âm tính giả. Trong chiến lược phân tích tồn dư, phương pháp sàng lọc thường được tiến hành trước khi định danh và định lượng chính xác. 1.4.3.1. Phương pháp sắc ký miễn dịch Hiện nay các test nhanh trên cơ sở sắc ký miễn dịch được sử dụng để phát hiện nhanh và tương đối chính xác các loại kháng sinh trong sữa ngay tại địa điểm thu mua, cho kết quả trong thời gian ngắn (khoảng 1-2 phút). Test thường ở dạng que thử, được sử dụng phổ biến, rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Que thử dạng sắc kí miễn dịch dựa trên cơ sở phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại test thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch như: - Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa thuộc nhóm -lactam của hãng Ar Brown - Nhật Bản cho kết quả sau 5 phút với độ nhạy từ 3-20 ppb tùy từng loại kháng sinh như với Penicillin 3 ppb, Ceftiofur 5ppb, Cloxacillin 4ppb,... - Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa thuộc các nhóm - lactam, Tetracycline, Streptomycin, Chloramphenicol của hãng Ballya - Trung Quốc cho kết quả chỉ sau 3-5 phút với độ nhạy từ 0,3-100 ppb tùy từng loại kháng sinh như Penicillin G 1,5-2ppb, Tetracycline 10 ppb, Streptomycin 100 ppb, Chloramphenicol 03 ppb, - Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamides trong sữa của hãng Nankai Biotech - Trung Quốc cho kết quả sau 10 phút với độ nhạy từ 3-30 ppb tùy từng loại kháng sinh, nhóm Beta-lactams từ 2-4 ppb trong 5 phút, Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 18 Ưu điểm: Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao; phát hiện được nhiều nhóm kháng sinh trong sữa, cho kết quả nhanh, có thể sử dụng các mẫu khác nhau, bán định lượng; thích hợp dùng để kiểm soát nguyên liệu đầu vào. Nhược điểm: Giá thành nguyên liệu cao, có thể phản ứng chéo. Hình 1.5. Một số loại que thử sắc ký miễn dịch 1.4.3.2. Phương pháp ELISA: Vài năm gần đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên - kháng thể đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên - kháng thể trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phương pháp ELISA có khả năng phát hiện hầu hết những chất kháng sinh thường có mặt trong thực phẩm như nhóm Beta-lactams, nhóm Chloramphenicol, nhóm Macrolides, nhóm Tetracyclines, nhóm Aminoglycosides, nhóm Sulphonamides. Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 19 Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Abhishek Gaurav và cộng sự [38] đã nghiên cứu trên 133 mẫu sữa thu thập được từ nhà sản xuất sữa thuộc 5 huyện của Punjab, Ấn Độ vào tháng 5/2013 và đã thử nghiệm, phân tích tình trạng tồn dư kháng sinh Tetracycline. Kết quả cho thấy có 18 mẫu sữa có tồn dư Tetracycline. Tỷ lệ Tetracycline được phát hiện trong các mẫu sữa thuộc 5 huyện trong phạm vi từ 0-46 là 15%. Nồng độ các mẫu sữa có chứa dư lượng kháng sinh Tetracycline trong phạm vi từ 16-134 là 5ppm . Với mục đích đưa việc xác vào xét nghiệm cận lâm sàng, nghiên cứu của Hua-Jin Zeng và cộng sự năm 2011 đã sử dụng kháng thể thu được từ việc tạo miễn dịch với Sparfloxacin trên thỏ kết hợp với huyết tương bò. Sau khi tối ưu hóa, phương pháp ELISA đã xác định hàm lượng Sparfloxacin từ 5ng/mL đến 2mg/mL với độ thu hồi từ 87,7 đến 106,2% [42]. Năm 2012, cũng với kỹ thuật ELISA gián tiếp, tác giả Jiang Jinqing đã xác định được hàm lượng Sparfloxacin trong mẫu sữa bò với khoảng xác định từ 0,036 đến 92,5 ng/mL với giới hạn phát hiện là 0,019 ng/mL, hệ số tương quan đạt 0,9844 [46]. Ở Việt Nam, từ năm 2002 đến nay phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích sàng lọc tại phòng kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng với các chỉ tiêu CAP (Chloramphenicol), AOZ (3-amino-2-oxazolidone để kiểm tra Furazolidone) và AMOZ (5-methylamorfolino-3-amino-2-oxazolidone để kiểm tra Furaltadone). Phạm Kim Đăng và cộng sự đã sử dụng kít ELISA do CER Vương Quốc Bỉ sản xuất để phân tích tồn dư chất kháng sinh Quinolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc. Kết quả được khẳng định lại bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Kết quả cho thấy, bộ kít ổn định để phân tích các Quinolone được thử vào trong tôm với giới hạn nồng độ phát hiện là 0,07ppb. Tác giả cũng cho rằng khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 20 phòng thí nghiệm ở Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định lượng qui định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002) [7]. Ưu điểm: Phương pháp ELISA có ưu điểm: nhanh, thao tác đơn giản, dễ thực hiện; không đòi hỏi thiết bị đắt tiền; không cần nhân viên chuyên môn cao; chi phí thử nghiệm mẫu thấp do có thể thử nghiệm đồng thời số lượng mẫu lớn; một bộ kit có thể phân tích được 50-80 mẫu. Nhược điểm: Một số hóa chất trong bộ kit phải bảo quản lạnh và có hạn sử dụng nhất định; độ chính xác không cao bằng các phương pháp hóa lý như phương pháp sắc ký do đó phương pháp này chỉ thích hợp với các phân tính sàng lọc hơn là các phân tích định lượng. Hình 1.6. Hệ thống phân tích ELISA 1.4.3.3. Phương pháp sử dụng vi sinh vật: Để kiểm tra dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm có nguồn gốc động vật, phương pháp xác định dựa vào quá trình ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật thường được sử dụng [57,55]. Phương pháp dựa trên sự ức chế vi sinh vật của chất kháng sinh nhờ việc hình thành vòng vô khuẩn trên đĩa thạch. Người ta có thể sử dụng mẫu đặt trực tiếp lên đĩa thạch hoặc dùng dung dịch chiết tách từ mẫu nhỏ vào khoanh giấy thấm rồi đặt lên đĩa thạch. Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 21 Test vi sinh vật được thiết kế theo các hướng: 1. Sử dụng một chủng vi sinh vật ở cùng một điều kiện môi trường: Test một đĩa dùng chủng Bacillus subtilis (test thận Bỉ). 2. Sử dụng một chủng vi sinh vật nhưng điều kiện môi trường khác nhau (pH khác nhau) như New Two Plate Test [29]. 3. Sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau ở cùng điều kiện môi trường. 4. Sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau ở các điều kiện môi trường khác nhau (pH khác nhau). Điển hình là test 4 đĩa Châu Âu (FPT-Four Plate Test), test cải tiến test 4 đĩa CPMA (Combined Plate Microbial Assay). Các chủng vi sinh vật thường sử dụng là B.subtilis pH 7.2, Kocuria varians pH 8, B.cereus pH 6, E.coli pH 8, Geobacillus stearothermophilus pH 7. 5. Đọc kết quả dựa vào phản ứng lên men, kết hợp với chỉ thị màu. Hình 1.7. Test thận Bỉ sử dụng chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Vi sinh vật chính thức được dùng để thực hiện đầu tiên là Sarcina lutea trong test thận của Van Schothorst và đã trở thành phương pháp chính thức được sử dụng ở Hà Lan năm 1973. Vào khoảng thời gian đó, ở Đức đã nghiên cứu test BGA có sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis và đã được một số nước dùng để thử nghiệm [60]. Vào năm 1980, EU sử dụng phương pháp test 4 tấm trong đó 3 tấm là môi trường thạch agar có bổ sung bào tử vi khuẩn B. subtilis BGA ở pH 6; 7,2 ; 8 và 1 tấm là vi khuẩn Micrococcus luteus ở pH 8. Môi trường có pH 7.2 được bổ sung với trimethoprim (TMP) để tăng độ nhạy cho sulfonamides. Trong một thời gian dài các Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 22 kết quả của thử nghiệm này đã được sử dụng [51]. Ferrini et al. [35] đã nghiên cứu phương pháp sáu tấm, bao gồm 4 tấm ở trên có bổ sung thêm tấm chứa vi khuẩn B. cereus và tấm có vi khuẩn E. coli. Nghiên cứu trên đã cho phép xác định được nhóm kháng sinh trong sữa và sàng lọc ban đầu chỉ trong một bước. Khả năng phát hiện tốt nhất đối với các kháng sinh nhóm β-lactam là các chủng Geobacillus stearothermophilus, Kocuria rhizophila, và Bacillus subtilis, trong khi đó đối với các kháng sinh macrolide là chủng K. rhizophila. Giới hạn phát hiện Tetracycline thấp khi sử dụng chủng Bacillus cereus, còn đối với Quinolone là Escherichia coli và Yersinia ruckeri. Sulfonamid được phát hiện khi sử dụng các chủng G. stearothermophilus và Bacillus pumilus. Chủng B. subtilis được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của các Aminoglycoside [31]. Ưu điểm: Trang thiết bị đơn giản, cần ít mẫu; phổ phát hiện rộng, tương đối nhạy (tùy vào chủng vi sinh vật và môi trường), thời gian phát hiện tương đối nhanh, giá thành rẻ; có thể tự động hoá, rất tiện để sàng lọc; dễ thực hiện, không cần kỹ thuật viên tay nghề cao. Nhược điểm: Không định lượng được, độ nhạy phụ thuộc điều kiện của chủng vi sinh vật sử dụng. Một số chất kháng sinh như Chloramphenicol, Nitrofurane, Nitroimidasole không phát hiện được dù có nồng độ cao do các chủng vi sinh vật không mẫn cảm với những chất này. Có rất nhiều chủng vi sinh vật được sử dụng trong phương pháp này, chúng được sử dụng như là một chỉ thị sinh học cho việc xác định dư lượng kháng sinh. Việc lựa chọn đúng loài vi sinh vật chỉ thị đóng vai trò qua trọng đối với kết quả của phương pháp. Để lựa chọn đúng loại vi sinh vật ta dựa vào những đặc điểm của mẫu nguyên liệu, đặc điểm của loại kháng sinh cần xác định và nhiều yếu tố liên quan khác. Đề tài lựa chọn chủng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus vì đây là chủng rất nhạy cảm với kháng sinh và là chủng vi sinh vật ưa nhiệt. Chúng có thể tồn tại ở nhiệt độ cao mà ở nhiệt độ đó một số vi sinh vật khác không tồn tại được, giúp tránh lây nhiễm các chủng khác trong không khí gây khó khăn trong quá trình xây dựng test. Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 23 1.5. Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus và ứng dụng trong việc phát hiện nhanh dƣ lƣợng kháng sinh trong sữa: 1.5.1. Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus: Đây là vi khuẩn được tìm thấy lần đầu tiên vào năm 1920 [32]. Năm 1986, vi khuẩn này được đặt tên là Bacillus stearothermophilus [27,44]. Năm 2001, nhóm các nhà khoa học từ Moscow [70] đã bắt đầu phân tích các hệ sinh thái vi sinh vật của các mỏ dầu ở nhiệt độ cao ở Kazakhstan. Sau khi phun nước nóng từ biển Caspian để thay thế nước ban đầu, các nhà khoa học phát hiện ra rằng có sự gia tăng vi sinh vật và đa dạng sinh trưởng. Nguồn nước nóng, mặn và nước oxy hóa đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của vi khuẩn ưa khí, ưa nhiệt và hình thành nội bào tử của thermophiles. Sau khi phân tích các đặc điểm di truyền và sinh lý, các nhà khoa học xác định chỉ một phần thuộc vi khuẩn Bacillus stearothermophilus. Sau khi kiểm tra kỹ lưỡng các loại vi khuẩn dựa trên đặc điểm về hình thái, sinh lý học, và phát sinh loài, họ thấy nó thuộc một đơn vị phân loại riêng biệt là Geobacillus. Vi khuẩn này đã chính thức đổi tên Geobacillus stearothermophilus vào năm 2004 [67]. G. stearothermophilus được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đã được phân lập từ một số địa điểm quan trọng tại Hoa Kỳ như: trên gỗ mục nát ở Florida, đất đã được sử dụng kỹ thuật làm giàu và suối nước nóng ở công viên Quốc gia Yellowstone. Những địa điểm này thể hiện đặc điểm của nó là một vi khuẩn khử nitơ, có khả năng sinh trưởng trong các môi trường nóng khác nhau và có tên là Geobacillus mà chữ “Geo” có nghĩa là trái đất [70]. 1.5.1.1. Phân loại: Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus thuộc: [70] Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Geobacillus Loài: G. stearothermophilus Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 24 Hình 1.8. Cây phát sinh dựa trên sự sắp xếp gen 16S rRNA [70] 1.5.1.2. Đặc điểm của Geobacillus stearothermophilus: Vi khuẩn G. stearothermophilus được phân bố rộng rãi trong các môi trường ấm như: đất, cát sa mạc, vùng biển và suối nước nóng. G. stearothermophilus là trực khuẩn ưa nhiệt được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Về mặt lâm sàng, vi khuẩn này cũng có vai trò quan trọng trong việc chứng minh rằng quá trình khử trùng phòng thí nghiệm đang hoạt động đúng tiến trình [60]. Cả hai chỉ số sinh học và hóa học được sử dụng để xác định sự hiện diện của bào tử G. stearothermophilus trên bề mặt đã trải qua một quá trình khử trùng [59,70]. Vi khuẩn này cũng được sử dụng như là một chỉ số sinh học để chứng minh độ sạch của các sông suối, cũng như nguồn chính cung cấp các enzyme chịu nhiệt được sử dụng trong các ứng dụng công nghiệp [70]. G. stearothermophilus còn có ý nghĩa trong việc xác minh các thực phẩm bị hư hỏng, chủ yếu là sữa và sữa chua [36,43]. Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 25  Đặc điểm hình thái Geobacillus stearothermophilus là vi khuẩn Gram dương, hình que, có thể sinh trưởng đơn lẻ hoặc chuỗi, có khả năng tạo thành bào tử, có thể tạo thành nội bào tử khi môi trường dinh dưỡng bị suy giảm. Thành tế bào của vi khuẩn có cấu trúc của vi khuẩn Gram dương điển hình. Chúng có cấu tạo gồm một lớp peptidoglycan dày xung quanh màng sinh chất [67]. Lớp peptidoglycan này chứa DAP hoặc axit meso- diaminopimelic và có chứa lượng axit teichoic đáng kể với axit muramic giúp bảo vệ thành tế bào trong suốt quá trình phân chia. [70] Bề mặt của vi khuẩn này có chứa một lớp vỏ, lớp S-layer, các protein. Các lớp này kết tinh trên bề mặt các protein giống như các lớp S-layer của các vi khuẩn khác, chúng có mối liên quan chặt chẽ với các tế bào của vi khuẩn [67].  Đặc điểm sinh hóa G. stearothermophilus có phản ứng catalase và oxidase dương. Vi khuẩn này sử dụng hoàn toàn các hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, axit amin, axit hữu cơ và oxy là chất nhận điện tử cuối cùng [67,70]. G. stearothermophilus cũng là vi khuẩn khử nitơ. Vi khuẩn được tìm thấy trong đất công nghiệp và phân compost và nó tham gia vào quá trình khử nitơ trong phân bón từ NO3 xuống NO2 dễ bay hơi hoặc N2 [70].  Đặc điểm nuôi cấy - Điều kiện sinh trưởng: Vi khuẩn này có khả năng di động, hiếu khí. G. stearothermophilus sinh trưởng ở nhiệt độ khác nhau, từ 30-75oC, chịu axit với dải pH từ 2-11 và nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ở 50-65°C. Đặc biệt loài vi khuẩn này có thể sống sót ở nhiệt độ cao đến 130oC [59]. Vi khuẩn dễ dàng sinh trưởng và phân lập trong phòng thí nghiệm vi sinh [70]. G. stearothermophilus là chủng vi khuẩn rất dễ bị ức chế bởi kháng sinh, đặc biệt là nhóm β-lactam [54,61,66,45]. - Đặc điểm nuôi cấy: Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 26 vi khuẩn sinh trưởng làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều. - Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như Glucose) và nitơ (như Peptone). Hình 1.9. Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus trên môi trường thạch [31] 1.5.1.3. Sự hình thành bào tử ở vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus: Bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan Bào tử G.stearothermophilus có chứa một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic. Hình 1.10. Bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus [63] Luận văn thạc sỹ Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 27  Cấu tạo bào tử Geobacillus stearothermophilus: Bào tử G. stearothermophilus là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Bào tử được bọc trong một vỏ dày gồm nhiều lớp: - Lớp màng ngoài: Màng ngoài nằm ở ngoài cùng, đó là các phần còn sót lại của tế bào mẹ, có khi có khi không, khi dày, khi xốp, chiếm 2 - 10% khối lượng khô của bào tử. Màng ngoài gồm 2 lớp, lớp ngoài dày 6nm, lớp trong dày 19nm. - Lớp áo bào tử: Lớp áo bào tử là một lớp peptidoglycan dày trong đó gồm nhiều loại protein khác nhau. Lớp áo bào tử thường chứa các prot