Luận văn Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra thành nguyên liệu thực phẩm giàu calcium và protein

hiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn tỷ lệ giống thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của nồng độ sucrose Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3 với các nồng độ sucrose: 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn nồng độ sucrose thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định pH ban đầu của MT thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các nhiệt độ: 300C, 350C, 400C, 450C. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Động thái học của quá trình lên men Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các các điều kiện đã chọn. Cứ 6giờ kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào và hoạt độ protease. Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei  Chuẩn bị giống lên men * Nhân giống cấp 1 - Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT3 đã vô trùng. - Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy một vòng KL từ ống giống sang ống nghiệm MT đã chuẩn bị ở trên. - Ủ ở nhiệt độ 430C trong 24giờ. * Nhân giống cấp 2 - Chuẩn bị bình tam giác chứa 45ml MT3 đã vô trùng. - Cho 5ml giống cấp 1 vào bình MT đã chuẩn bị ở trên. - Ủ ở nhiệt độ 430C trong 24giờ. Bacillus amyloliquefaciens Tỷ lệ giống/MT 1% 2% 3% 4% 5% Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ pH ban đầu 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nhiệt độ 300C 350C 400C 450C Nồng độ sucrose 0% 1% 2% 3% 4% 5% Hoạt độ protease Chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp  Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei * Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Cấy 5% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT2 dịch thể. Sau các khoảng thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng 24giờ, 48giờ, 72giờ, 96giờ, 120giờ thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn thời gian thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của MT nuôi cấy Cấy 5% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT (gồm các loại MT khác nhau: MT5, MT6, MT7, MT8). Sau thời gian nuôi cấy đã chọn ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn MT thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Cấy vào bình tam giác chứa 50ml MT với các tỷ lệ giống: 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn tỷ lệ giống thích hợp cho lượng acid cao để nghiên cứu thí nghiệm tiếp theo. * Ảnh hưởng của nồng độ surose Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT với các điều kiện đã chọn với các nồng độ surose: 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn nồng độ surose thích hợp cho lượng acid cao để nghiên cứu thí nghiệm tiếp theo. * Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT với các điều kiện đã chọn, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Xác định pH MT ban đầu thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Cấy giống vào bình tam giác chứa 50 ml MT với các điều kiện đã chọn, nuôi ở các nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C. Sau thời gian thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Xác định nhiệt độ thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Động thái học của quá trình lên men Nuôi VK với các điều kiện thích hợp đã xác định ở các thí nghiệm trên. Cứ 12giờ kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào và hàm lượng acid. Sơ đồ 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei Chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp Hàm lượng acid Lactobacillus casei Tỷ lệ giống/MT 1% 3% 5% 7% 10% Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ pH ban đầu 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nhiệt độ 200C 250C 300C 350C 400C 450C Môi trường MT5 MT6 MT7 MT8 Nồng độ sucrose 0% 1% 2% 3% 4% 5% 2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens Với điều kiện tối ưu để thu dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens cho hoạt độ protease cao đã chọn ở những thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens. * Tỷ lệ nước Bổ sung 3% dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens và các tỷ lệ nước khảo sát như sau: 0%, 10%, 30%, 50%, 70%, 100% vào xương cá tra, tiến hành thủy phân trong 24giờ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra tỷ lệ nước tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Tỷ lệ dịch nuôi cấy Với tỷ lệ nước tối ưu đã xác định, xương cá tra được thủy phân với tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens khác nhau: 1%, 3%, 5%, 7%, 10% trong 24giờ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra tỷ lệ dịch nuôi cấy tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Nhiệt độ thủy phân Với tỷ lệ nước và dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đã xác định, tiến hành thủy phân xương cá tra trong 24giờ ở các nhiệt độ: 400C, 450C, 500C, 550C. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra nhiệt độ tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Thời gian thủy phân Với các điều kiện đã xác định ở các thí nghiệm trên, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens từ 4 - 40giờ. Sau các khoảng thời gian khảo sát tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Sơ đồ 2.4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens Thủy phân bằng dịch lên men Bacillus amyloliquefaciens Bột xương cá tra Tỷ lệ dịch lên men/cơ chất 1% 3% 5% 7% 10% Tỷ lệ nước/cơ chất 0% 10% 30% 50% Nhiệt độ 300C 350C 400C 450C 500C 550C Thời gian 0 giờ 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ Đo các chỉ số đạm Hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan Chọn điều kiện thủy phân thích hợp 2.3.2.5 Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei Với điều kiện tối ưu để thu dịch lên men Lactobacillus casei cho hàm lượng acid cao đã chọn ở những thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra đã tách protein bằng dịch lên men Lactobacillus casei. Sơ đồ 2.5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium của xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ Xương cá tra đã tách protein Ngâm trích ly calcium bằng dịch lên men Lactobacillus casei Tỷ lệ dịch nuôi cấy/cơ chất 1:1 1.5:1 2:1 2.5:1 3:1 Xác định hàm lượng calcium Chọn điều kiện trích ly thích hợp * Tỷ lệ dịch lên men Xương cá tra đã tách protein được ngâm bằng dịch lên men Lactobacillus casei với các tỷ lệ 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3 trong 72giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thu mẫu để xác định hàm lượng calcium. Từ đó, chọn ra tỷ lệ dịch lên men tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo. * Thời gian trích ly Với tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đã xác định, tiến hành khảo sát thời gian ngâm trích ly calcium từ xương cá tra từ 0 - 120giờ. Sau các khoảng thời gian khảo sát tiến hành lấy mẫu xác định hàm lượng calcium. Từ đó, chọn ra thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. 2.3.2.6 Thí nghiệm 6: Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV Tiến hành xác định các chỉ tiêu về hàm lượng Ca2+, NTS, protein tổng, NF, NNH3 của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV. 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp cấy truyền giữ giống [32] [38]  Nguyên tắc Trong điều kiện lạnh sẽ làm giảm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV. Đồng thời ngăn cản sự sinh trưởng của chúng để đảm bảo không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống.  Cách tiến hành Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa MT giữ giống đã vô trùng. Dùng que cấy vòng vô trùng, cấy zích zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 - 48giờ cho tạo sinh khối, sau đó bảo quản ống giống ở nhiệt độ 40C. Giống được cấy truyền hàng tháng. 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 2.4.2.1 Phương pháp quan sát KL [23] Quan sát và miêu tả KL của VK về: - Khả năng phát triển của KL. - Màu sắc KL - Đặc điểm hình thái, kích thước và tính chất bề mặt KL. 2.4.2.2 Phương pháp nhuộm Gram [20] [32]  Nguyên tắc Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà vi khuẩn được chia làm 2 nhóm: - Nhóm vi khuẩn Gram dương (G+): vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn etylic. - Nhóm vi khuẩn Gram âm (G-): không giữ nguyên màu của thuốc nhuộm khi xử lý bằng cồn etylic và bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung.  Cách tiến hành * Làm tiêu bản - Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. - Dung bút bông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lam để đánh dấu vết khuẩn phía trên lam. - Nhỏ dung dịch NaCl 9‰ lên giữa vòng tròn. - Dung que cấy khử trùng để nguội đặt nhẹ KL (VK nuôi cấy từ 24 - 48giờ trong ống thạch nghiêng), đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam. - Dàn mỏng thành vết bôi, cố định vết bôi bằng cách để khô trong không khí hoặc hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn. * Nhuộm tiêu bản - Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U. - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi. - Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để từ 1-2 phút, rửa bằng nước cất. - Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa bằng nước cất. - Tẩy màu bằng cồn 960 từ 15-20 giây. Rửa bằng nước cất. - Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ dung dịch Fuschin trong 1 phút, rửa bằng nước cất. - Làm khô tiêu bản và quan sát tiêu bản bằng vật kính dầu. 2.4.2.3 Phương pháp nhuộm bào tử [20] [32]  Nguyên tắc Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu đỏ.  Cách tiến hành * Làm tiêu bản: tương tự mục 2.4.2.2 nhưng VK được nuôi cấy khoảng 2 tuần trên MT thạch nghiêng. * Nhuộm tiêu bản - Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U. - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhỏ xanh Metylen thấm ướt hết giấy lọc, hơ nóng phía dưới và giữ trong 1 phút, rửa kỹ bằng nước cất đến khi hết màu. - Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ đỏ trung tính 0.5% trong 1 phút, rửa bằng nước cất. - Làm khô tiêu bản và quan sát tiêu bản bằng vật kính dầu. 2.4.2.4 Phương pháp xác định khả năng sinh catalase [28]  Nguyên tắc Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Catalase thủy phân H2O2 (hydrogen perioxide) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân H2O2 giải phóng O2 sẽ xuất hiện hiện tượng sủi bọt khí.  Cách tiến hành Nhỏ trực tiếp 1 giọt dd H2O2 3% lên trên KL, hoặc chuyển một lượng VSV lên lam rồi thử bằng dd H2O2 3%. Ghi nhận hiện tượng sủi bọt khí nếu có.  Đọc kết quả Thử nghiệm là dương tính: khi có hiện tượng sủi bọt khí xảy ra do O2 được tạo thành. Thử nghiệm là âm tính: khi không có hiện tượng sủi bọt xảy ra. 2.4.3 Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử [33]  Nguyên tắc Khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Gen 16 rARN gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn. Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của VK. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh xác định VK.  Cách tiến hành * Bước 1 - Lấy một ít KL được nuôi cấy trên bề mặt thạch làm thành dịch huyền phù. - Tiến hành tách chiết ADN bằng cách: đun sôi 5phút, để nguội 5phút, ly tâm 5phút, sau đó lấy dịch nổi. * Bước 2 - Cho dịch nổi thu được, primer, Taq, dNTP, Mg2+ vào PCR mix để khuếch đại gen 16s rARN. - Phản ứng PCR gồm 3 bước: + Biến tính: Trong một dd đầy đủ thành phần cho sự sao chép, ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94 - 950C trong vòng 30giây - 1phút. + Lai: Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700C và kéo dài 30giây - 1phút. + Tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên đến 720C để ADN polimerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự ADN thường kéo dài từ 30giây đến vài phút. * Bước 3: Điện di kiểm tra trên gel 1% agarose để xác định sản phẩm PCR. * Bước 4: Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEX II của Qiagen. * Bước 5: Giải trình tự đoạn rARN 16s, nhằm xác định trình tự acis nucleic. Có 2 phương pháp xác định: - Phương pháp hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử ADN, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleoide. - Phương pháp enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ ADN polimerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các dideoxynucleotide thông thường. Kết quả cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn ADN có kích thước chênh nhau 1 nucleoide. Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn ADN sẽ được phân tích trên điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ điện di. * Bước 6: Xuất kết quả trình tự để phân tích. Đăng nhập vào NCBI BLAST SEARCH xác định tên VK cần định danh. 2.4.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm KL [22] [29] [32]  Nguyên tắc Cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù VSV lên MT thạch trong đĩa Petri. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các KL có thể quan sát được bằng mắt thường. Đếm số KL mọc trên môi trường (trên cơ sở xem mỗi KL hình thành từ một TB). Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã lấy và hệ số pha loãng ta có thể suy ra số khuẩn lạc trong 1ml mẫu khảo sát ban đầu.  Cách tiến hành Chuẩn bị đĩa Petri có chứa MT1. Pha loãng mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý với các độ pha loãng khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3, lắc đều mẫu và dùng pipetman lấy 0,1ml dịch huyền phù cho lên bề mặt thạch trong đĩa Petri. Dùng que gạt vô trùng dàn đều dịch huyền phù trên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô. Lật úp đĩa thạch vừa cấy và đặt vào tủ ấm. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 48 - 72 giờ. Với mỗi độ pha loãng tiến hành gieo cấy 3 đĩa Petri, sử dụng 1 pipet vô trùng và 1 que gạt cho mỗi độ pha loãng. Thực hiện cho 3 dung dịch mẫu với các độ pha loãng liên tiếp nhau.  Tính kết quả Đếm tổng số các KL trên các đĩa Petri. Chọn tất cả các đĩa Petri có từ 25 đến 250 KL. KL đếm trên các đĩa Petri có độ pha loãng khác nhau cần phải tuân theo một quy luật hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số KL đếm được trên đĩa Petri phải càng ít. Nếu không hợp lý, cần thực hiện lại các thí nghiệm. Mật độ tế bào được tính theo công thức: Trong đó: M: mật độ tế bào ở các độ pha loãng khác nhau. A: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa. D: Độ pha loãng. V : Thể tích dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa. 2.4.5 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [11]  Nguyên tắc Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzyme của VK phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn của MT trong suốt thể hiện hoạt tính của enzyme. A * D M (CFU/ml) = V  Cách tiến hành Thu dịch nuôi cấy - Chuẩn bị 50ml MT3 nuôi VK trong bình tam giác 250ml, đem hấp khử trùng 1210C trong 30 phút. - Dùng pipetman lấy một thể tích giống cấp 2 sao cho mật độ tế bào 106 - 107/ml nuôi cấy vào bình tam giác chứa MT3. - Đặc bình tam giác lên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Ly tâm dịch nuôi cấy 15phút, tốc độ 5000vòng/phút. Loại bỏ sinh khối thu được dịch enzyme thô. Chuẩn bị các đĩa Petri có MT4. Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 9mm) khoan các lỗ thạch trên MT4 tương ứng trong các đĩa. Dùng pipetman vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào các lỗ khoan. Giữ các đĩa petri trong tủ lạnh 40C trong 2 - 4giờ, sau đó chuyển ra nhiệt độ phòng 24giờ. Nhỏ dung dịch HgCl2 10% lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải.  Kiểm tra kết quả VK sinh ra protease sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ khoan do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do HgCl2 phản ứng với protein tạo kết tủa.  Đánh giá khả năng tạo enzyme Đặt sấp đĩa petri. Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính lỗ khoan (d). Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzyme của các chủng nấm sợi. Quy ước: - (D - d) ≥ 25mm: enzyme có hoạt tính rất mạnh - (D - d) ≥ 20mm: enzyme có hoạt tính mạnh - (D - d) ≥ 10-19,5mm: enzyme có hoạt tính trung bình - (D - d) ≤ 10mm: enzyme có hoạt tính yếu 2.4.6 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [11] [20]  Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt độ phân giải protein của protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enyme.  Cách tiến hành * Dựng đường chuẩn tyrosine Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Dd tyrosin chuẩn 1mM/l (ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Dd HCl 0.2N (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Dd NaOH 0.5N (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 Lắc và để yên trong 10 phút, đem đo mật độ quang ở bước sống 660nm Ống 1 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn tyrosin tương quan giữa lượng tyrosin (µmol) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODKC) * Định lượng protease trong mẫu Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Ống thí nghiệm Ống kiểm chứng Dd casein 1% (ml) 5 5 Dd TCA 10% (ml) 0 5 Dịch enzyme mẫu (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 300C trong 30 phút TCA 5% (ml) 5 0 Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1 Lọc, lấy dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dịch lọc (ml) 1 1 Dd NaOH 0.5N (ml) 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6 Lắc đều và để yên trong 10 phút. Đem đo OD ở bước sống 660nm Tính ΔOD = ODTN – ODKC. Dựa vào đồ thị chuẩn suy ra µmol tyrosin.  Tính kết quả Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong một phút ở 300C phân giải được một lượng protein tương đương với một micromole tyrosin Hoạt độ 1ml dung dịch enzyme được tính bằng công thức Trong đó: x: Số ml tyrosin suy ra từ đường chuẩn. V: Tổng thể tích của hỗn hợp phản ứng với enzyme (ml). L: Độ pha loãng của dịch enzyme mẫu. t: Thời gian hỗn hợp phản ứng. v: Thể tích dịch lọc đem phản ứng (ml). 2.4.7 Phương pháp định tính acid lactic [16] [21]  Nguyên tắc Khi tác dụng với acid lactic thuốc thử Ufermen sẽ đổi màu từ xanh tím sang màu vàng. Quan sát sự đổi màu của thuốc thử ta có thể xác định được khả năng tạo acid lactic của VK.  Cách tiến hành Chuẩn bị khoảng 5ml môi trường dịch lên men, cấy vi khuẩn đã phân lập ở trên vào. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó cho dịch lên men phản ứng với thuốc thử Ufermen. x * V * L HĐP = (UI/ml) t * v Chuẩn bị 3 ống nghiệm chứa các thành phần như sau: Ống 1 Ống 2 Ống 3 3ml dịch Ufermen 3ml dịch Ufermen 3ml dịch Ufermen 3ml dịch MT 3ml dịch lên men 3ml acid lactic Quan sát và nhận xét sự thay đổi màu của thuốc thử. Từ đó có thể xác định được VK đó có thể tạo ra acid lactic hay không. 2.4.8 Phương pháp định lượng acid tổng [2] [21]  Nguyên tắc Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định được bằng một dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dd với thuốc thử phenolphthalein.  Cách tiến hành Cho vào bình tam giác (250ml) 10ml dịch lên men, thêm 3 giọt phenolphthalein 1% và 20ml nước cất. Đem chuẩn độ bằng dd NaOH 0.1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền vững. Thực hiện mẫu đối chứng là dịch chưa lên men.  Tính kết quả Hàm lượng acid tổng được tính theo công thức: ∑a = (V - V0) * 0.1 * 90 10 = (V - V0) * 0.9 (g/l) Trong đó, V: Số ml dung dich NaOH dùng trung hòa 10ml dịch lên men. V0: Số ml dung dich NaOH dùng trung hòa 10ml dịch chưa lên men. 2.4.9 Phương pháp xác định độ ẩm [3] [10]  Nguyên tắc Làm bay hơi hết nước trong thực phẩm. Cân thực phẩm trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra % nước có trong thực phẩm.  Cách tiến hành Cân chính xác m(g) nguyên liệu cho vào chén sứ đã sấy khô. Đem sấy khô ở nhiệt độ 100 - 1050C trong tủ sấy, sấy khô cho đến khối lượng không đổi từ 2 - 5giờ tùy theo mẫu. Sấy xong, lấy chén nguyên liệu ra khỏi tủ sấy cho ngay vào bình hút ẩm khoảng 30 - 45phút, đem cân ở cân phân tích. Từ đó xác định khối lượng khô tuyệt đối của nguyên liệu. Tính kết quả Độ ẩm (%) X được xác đinh theo công thức: Trong đó, m0: khối lượng chén sứ (g). m1: khối lượng chén sứ và khối lượng nguyên liệu trước khi sấy (g). m2: khối lượng chén sứ và khối lượng nguyên liệu sau khi sấy (g). 2.4.10 Phương pháp định lượng calcium [3] [10]  Nguyên tắc Dùng EDTA xác định calcium trong dung dịch với chất chỉ thị là murexid (C8H5O6N5) trong môi trường có pH=12. Ký hiệu chất chỉ thị murexid là H3I- trong môi trường pH=12, H3I- có màu tím khi kết hợp với calcium tạo thành chất phức tạp có màu hồng. H3I- (tím) + Ca2+ ↔ CaH3I- (hồng) Chất phức tạp của Ca với murexid không bền bằng chất phức tạp của Ca với EDTA nên EDTA đẩy chỉ thị murexid ra khỏi chất phức tạp dưới dạng tự do có màu tím. CaH3I- (hồng) + H2Y2- ↔ CaY2- + H3I- (tím) + 2H+  Tiến hành * Xác định hàm lượng Ca2+ trong xương của Xương cá tra m1 – m2 X = * 100 m1 – m0 Cần m(g) nguyên liệu hòa tan bằng HCl đậm đặc, sau đó định mức 100ml. Hút 10ml mẫu trên cho vào bình tam giác 250ml. Thêm Vml dung dịch NaOH 10% để đạt pH = 12-13, nhỏ 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo chỉ thị murexid. Sau đó, chuẩn độ bằng EDTA 0.02N cho đến khi màu hồng của dd chuyển sang màu tím. Cần thực hiện song song một sự thử không. * Xác định hàm lượng Ca2+ trong dịch lên men Hút 1ml dung dịch lên men, thêm 20ml nước cất, cho vào bình tam giác 100ml. Thêm V(ml) dung dịch NaOH 10% để đạt pH = 12-13, 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo chỉ thị murexid. Sau đó, chuẩn độ bằng EDTA 0.02N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song một sự thử không.  Tính kết quả - Số gam Ca2+ trong 100gam nguyên liệu: - Số gam Ca2+ có trong 1l nguyên liệu: Trong đó, C: Độ nguyên chuẩn của dd EDTA 0.02N. V: Thể tích dd EDTA 0.02N. Vm: Thể tích dd mẫu đem xác định. m: Khối lượng nguyên liệu đem xác định. Đ = 20.04: Đương lượng của Calcium. 2.