Luận văn Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân hủy nhựa cây trên nguyên liệu dăm mảnh keo nhằm ứng dụng trong sản xuất bột giấy thân thiện với môi trường

dƣờng nhƣ nhóm peroxidase phân hủy lignin thuộc liên họ (superfamily) peroxidase của thực vật chỉ thấy có ở nấm bậc cao. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn sản sinh khá nhiều enzyme thuộc loại peroxidase khác, đƣợc gọi là peroxidase khử màu thuốc nhuộm (EC 1.11.1.19), viết tắt là DyPs [40]. DyPs là nhóm enzyme peroxidase chứa nhân heme mới đƣợc phát hiện và đƣợc chú ý bởi chúng có khả năng phân hủy lignin và nhiều hợp chất khác. Năm 1988 enzym này đƣợc phát hiện từ Streptomyces viridosporus và năm 1999 ở Bjerkandera adusta. Gần đây, rất nhiều enzyme DyPs của vi khuẩn đã đƣợc mô tả, cho thấy rằng vi khuẩn có nguồn gen rất phong phú mã hóa cho DyPs. Tuy có cấu trúc phân tử khác với peroxidase của nấm, nhƣng DyPs của vi khuẩn lại có những điểm tƣơng tự nhƣ của nấm, đó là sự tiết enzyme ra ngoài tế bào bằng cơ chế Tat (Twin Arginine Translocation) và đặc tính xúc tác. Enzyme DyP ở vi khuẩn và xạ khuẩn có phổ cơ chất rộng, bao gồm một số nhóm thuốc nhuộm tổng hợp, các hợp chất monophenol, veratryl alcohol, carotene, Mn+2 và hợp chất lignin. Gần đây, một số peroxidase kiểu DyP của vi khuẩn đƣợc ứng dụng để phân hủy lignin và những hợp chất giống lignin [41, 42]. Bên cạnh đó, một số enzyme DyP của vi khuẩn, nhƣ Pseudomonas fluorescence Pf-5 lại có hoạt tính đối với lignin Kraft kiềm. Enzyme vi khuẩn bền nhiệt và chịu kiềm SviDyP đã đƣợc ứng dụng thành công trong khử màu của bột giấy Kraft bạch đàn [41]. DyPB, một peroxidase của vi khuẩn phân hủy lignin từ Rhodococcus jostii RHA1, có gốc Asn246 đƣợc thay thế bằng alanine (N246A), có hoạt tính biến đổi kraft lignin của gỗ cứng và các phân đoạn chiết trong dung môi, tạo thành 2 sản phẩm chính là 2,6- dimethoxybenzoquinone and 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde [43]. 19 Laccase (EC 1.10.3.2) là nhóm enzyme oxidase có chứa 4 ion đồng ở tâm heme, có chức năng oxi hóa các hợp chất hữu cơ thành các gốc tƣơng ứng, sau đó các gốc này đƣợc oxi hóa hoặc chuyển hóa tiếp. Laccase rất phổ biến trong tự nhiên, có ở trong thực vật, nấm, vi khuẩn và côn trùng. Laccase có trọng lƣợng phân tử và cấu trúc khác nhau tùy theo xuất xứ của chúng [44]. Nhóm enzyme này thƣờng là ngoại bào, xúc tác các phản ứng polymer hóa hoặc phân giải polymer [45]. Tƣơng tự laccase của nấm, nhiều loại laccase của vi khuẩn cũng đƣợc tiết ra ngoài tế bào nhờ hệ thống Tat. Tuy nhiên, khác với nhóm enzyme oxy hóa-khử, phản ứng xúc tác của laccase không cần có cofactor. Và cũng khác với nhóm enzyme oxy hóa, phản ứng không tạo ra H2O2. Trƣớc đây, những enzyme của nhóm laccase đƣợc phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng trong phân hủy lignin đều có nguồn gốc từ nấm. Tuy vậy, những năm gần đây thì laccase của vi khuẩn đƣợc chú ý hơn vì tiềm năng của chúng trong phân hủy lignin và nhiều ứng dụng khác. Trong tự nhiên, trong quá trình phân hủy lignocellulose, vai trò của laccase của vi khuẩn là làm thay đổi đặc tính của lignin để cho các hệ enzyme khác tiếp cận cellulose và hemicellulose. Laccase của vi khuẩn đầu tiên đƣợc phát hiện ra năm 1995, nhƣng tới nay đã có một số lƣợng lớn laccase của vi khuẩn đƣợc xác định [40, 44, 46, 47], đồng thời vai trò và hiệu quả của chúng trong phân hủy lignin đang đƣợc đẩy mạnh nghiên cứu [48]. Laccase của vi khuẩn đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là ở xạ khuẩn, đặc biệt là các loài Streptomyces (Fernandes et al., 2014) nhƣ Laccase chịu mặn (SilA) của chủng S. ipomoea CECT 3341, và 4 laccase từ Streptomyces (S. coelicolor A3(2), S. lividans TK24, S. viridosporus T7A) và Amycolatopsis sp. 75iv2. Những enzyme này có độ ổn định hoạt tính cao trong dải pH rộng từ 3-10, là những tác nhân xúc tác tiềm năng trong công nghiệp giấy. Thông báo đầu tiên về ứng dụng laccase của vi khuẩn trong sản xuất bột giấy và giấy là trƣờng hợp của chủng siêu chịu nhiệt Thermus thermophilus. Laccase tái tổ hợp của chủng này đƣợc dùng để tẩy trắng bột giấy từ rơm lúa mỳ, làm tăng độ sáng lên 3.3% ISO và giảm chỉ số kappa 5,6 U, giảm 25% 20 lƣợng dùng H2O2 trong công đoạn tẩy trắng tiếp theo. Khi bổ sung 5 mM ABTS thì độ sáng tăng thêm 1,5% ISO mà không ảnh hƣởng tới xơ sợi [49]. Các loài Bacillus sinh ra laccase chịu nhiệt độ cao và môi trƣờng kiềm, tuy nhiên đa số là enzyme nội bào. Laccase ngoại bào đƣợc phát hiện ở chủng B. tequilensis SN4 đƣợc phân lập từ nƣớc thải của nhà máy bột giấy [30]. Enzyme của chủng này có nhiệt độ tối ƣu ở 80-90 oC, thậm chí còn một phần hoạt tính ở 100 oC, và pH tối ƣu là 8 và độ ổn định hoạt tính cao. Laccase của chủng này làm giảm 28% chỉ số kappa và tăng độ sáng của bột giấy lên 7,6%. Khi bổ sung một lƣợng nhỏ (2 mM) chất hỗ trợ N-hydroxybenzotriazole (HBT) thì hiệu quả tăng lên rõ rệt. Ngoài ra, một số enzyme của vi khuẩn nhƣ etherase phụ thuộc glutathione, superoxide dismutase và dioxygenase cũng có vai trò trong biến đổi/ phân hủy lignin và các hợp chất hữu cơ khác trong nhựa cây. Năm 2013, một enzyme ngoại bào đặc biệt đƣợc phát hiện ở Streptomyces, có một vùng dioxygenase và một vùng gắn lignin [40]. Enzyme này có hoạt tính nhƣ dioxygenase đối với một số dẫn suất của catechol, đồng thời lại có ái lực đối với một số phân tử lignin tổng hợp. Nhìn chung, vai trò của nấm trong phân hủy lignin và các hợp chất hữu cơ trong nhựa cây đã đƣợc nghiên cứu từ nhiều thập kỷ và ứng dụng có hiệu quả. Vi khuẩn, xạ khuẩn tuy không có hệ enzyme peroxidase thông thƣờng nhƣ ở nấm, nhƣng lại có hệ enzyme rất phong phú và đa dạng, bao gồm những enzyme đã biết nhƣ DyP, laccase, etherase, dismutase, dioxygenase, và còn nhiều enzyme chƣa đƣợc phát hiện. Tất cả đều tham gia vào quá trình biến đổi phân tử lignin và phân hủy các axit béo, axit nhựa và các hợp chất hữu cơ khó phân hủy khác trong nhựa cây. Vi khuẩn có lợi thế hơn nấm mục trắng ở chỗ có thể nhanh chóng phát triển sau khi cấy vào nguyên liệu gỗ nên giảm nguy cơ gỗ bị nhiễm các vi sinh vật không mong muốn khác. Bên cạnh đó, vi khuẩn và xạ khuẩn có thể phát triển trong điều kiện có nồng độ oxy thấp mà nấm không phát triển đƣợc. Và cộng đồng hỗn hợp vi khuẩn sẽ có khả năng phân hủy lignin và các hợp chất trong gỗ tốt hơn các loài riêng lẻ. Do đó, việc tìm kiếm và phối hợp các chủng vi sinh vật trong tiền xử lý dăm 21 mảnh nguyên liệu gỗ sản xuất bột giấy và giấy sẽ khiến cho giải pháp này càng trở nên khả thi và hiệu quả hơn trong thực tiễn sản xuất. Đây là một hƣớng giúp cho sản xuất an toàn mà không cần đầu tƣ lớn cho các nhà máy hiện hành. 22 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu. Các mẫu VSV đƣợc phân thập từ các mẫu mùn đất, dăm gỗ thu thập xung quanh nhà máy giấy Bãi Bằng - Tổng Công ty Giấy Việt Nam, huyện Phù Ninh, tỉnh Phú Thọ. 2.1.2. Thiết bị - Kính hiển vi quang học Olympius (Model CHD, Nhật Bản). - Máy đo pH (Metter Toledo, Thụy Sỹ). - Nồi hấp khử trùng (ALP MC-40DP, Nhật Bản) - Tủ ấm vô trùng, tủ sấy Memmert (Trung Quốc) - Cân điện tử (Metteler Toledo, Thụy Sỹ) - Máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc) - Bốc vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy ly tâm Hettich (Đức) - Pipet, máy sấy, đĩa petri, ông đong, bình thủy tinh 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml, ống falcon, ống eppendorf 1,5 ml... - Các dụng cụ khác... 2.1.3. Hóa chất Các loại đƣờng chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose... của hãng Merck (Đức) và Trung Quốc. - Các loại muối: K2HP)4, MgSO4.7H2O,NaH2PO4, Na2HPO4, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnSO4, ZnSO4, CuSO4, (NH4)2 SO4, CaCO3, MnCl2, Na2SO3,ZnCl2, Tris HCl, Tris Base, EDTA, Isomylalcohol, chloroform, isopropanol, glacial acetic acid, ethidium bromide, agarose... có xuất sứ từ Đức Đức và Trung Quốc có độ tinh khiết cao. - Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone, p -nitrophenyl butyrate (p- NPB) (Merck), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA), agar, tinh bột tan, casein, 23 Remazol Brilliant Blue R (RBBR), Carboxymethyl Cellulose (CMC) của Nhật, Trung Quốc. - Các hóa chất khác đƣợc sử dụng trong thí nghiệm có độ tinh khiết cao và đảm bảo sử dụng trong phân tích. 2.1.4. Môi trƣờng Môi trƣờng phân lập (g/l): NaNO3: 3g, K2HPO4: 1g, MgSO4.7H2O: 0,5g KCl: 0,5g, FeSO4.7H2O: 0,01g. pH=7,0. Bổ sung 100mg stigmasterol. MT1 (g/l) Môi trƣờng giữ và nhân giống (môi trƣờng Bennet): Cao nấm men: 1g Cao thịt: 1g, casein thủy phân: 2g, Glucose: 10g, CoCl2.6H2O: 0.01g, thạch: 18g, pH=7. MT2 (g/l): Môi trƣờng khoáng NaNO3: 3g, K2HPO4: 1g, MgSO4.7H2O: 0,5g KCl: 0,5g, FeSO4.7H2O: 0,01g, 0,2% pepton, 0,5% glucose và 0,5% chất chiết nhựa cây. MT3 (ISP2) (g/l): Môi trƣờng nhân giống và xác định đặc điểm sinh học Glucoza: 10g, Cao nấm men: 4g, Cao Malt: 4g, pH=7. MPA (g/L) (Meat-peptone agar): cao thịt 3,0; pepton 5,0. pH 7,0. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Chuẩn bị chất chiết nhựa cây Chất chiết nhựa đƣợc tách từ dăm gỗ nghiền theo phƣơng pháp chiết trong aceton. Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện nhƣ mục 2.2.7. Nhựa cây sau khi làm bay hơi aceton sẽ đƣợc thu hồi và dùng cho các mục đích thí nghiệm tiếp theo. 2.2.2. Phƣơng pháp sàng lọc vi sinh vật phân hủy nhựa. Mẫu mùn thu thập từ nhà máy giấy Bãi Bằng đƣợc pha loãng đến nồng độ thích hợp theo phƣơng pháp pha loãng tới hạn và trang đĩa trên môi trƣờng khoáng có bổ sung stigmasterol làm nguồn cơ chất. Các đĩa phân lập đƣợc ủ ở 37oC và 45ºC trong 3 ÷ 5 ngày. Tách và làm sạch các chủng VSV xuất hiện trên đĩa. 24 Xác định sự phát triển của vi sinh vật trên stigmasterol lỏng: Các chủng VSV đƣợc nuôi cấy trên các ống nghiệm lỏng chứa 5 ml môi trƣờng phân lập. Sau 48 giờ nuôi cấy tiến hành kiểm tra khả năng phát triển của các chủng. Những chủng không phát triển trên môi trƣờng sẽ đƣợc loại bỏ. Xác định khả năng sinh tổng hợp lipase (phương pháp định tính): là phƣơng pháp thử nghiệm kết tủa sử dụng môi trƣờng thạch có chứa Tween 20 để xác nhận hoạt động lipolytic. Môi trƣờng xác định sự có mặt của lipase (g/L); 10g peptone, 5g NaCl 2; 0,1g CaCl2. 2H2O, 20g agar và 10ml (v/v) tween 20. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc kết tủa muối canxi. Sự thủy phân của tween 20 sẽ giải phóng các axit béo liên kết với canxi trong môi trƣờng để tạo thành các tinh thể không hòa tan xung quanh điểm tiêm chủng. Các sinh vật đƣợc cấy vào các đĩa và đƣợc ủ ở 37°C trong 2 - 4 ngày. Một lƣợng kết tủa sẽ xuất hiện xung quanh khuẩn lạc cho thấy dấu hiệu hoạt động của lipase [50]. Kiểm tra khả năng phân giải cellulose: Các vi sinh vật chọn lọc đƣợc ở trên đƣợc kiểm tra khả năng phân hủy Cellulose bằng kiểm tra vòng phân hủy trên môi trƣờng thạch chọn lọc. Cấy chấm điểm các chủng vi sinh vật trên đĩa Petri chứa 1% CMC và 1% tinh thể cellulose trên môi trƣờng khoáng phân lập. Các chủng phân lập tạo thành vòng phân hủy lớn và rõ trên môi trƣờng có tinh thể cellulose khi bổ sung thuốc thử công gô đỏ 0,5% ở 50oC trong 2 giờ và rửa lại bằng NaCl 0,9% sẽ đƣợc loại bỏ. 2.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật đƣợc tuyển trọn. Quan sát hình thái vi sinh vật: Hình thái vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử JSM-5410LV (Jeol - Japan). Phương pháp kiểm tra khả năng sinh bào tử: Thí nghiệm kiểm tra khả năng sinh nội bào tử của chủng vi khuẩn đƣợc thực hiện bằng cách giữ chủng trong dung dịch nƣớc muối sinh lý và ủ ở 80oC trong 15 phút. Sau khi ủ ở 80 oC trong 15 phút và kiểm tra bằng cách cấy trải trên môi trƣờng Bennet. 25 Sau 24-48 giờ chủng vi khuẩn phát triển trở lại trên môi trƣờng kiểm tra thì có khả năng sinh bào tử. Tách chiết DNA và phân tích trình tự vùng gen 16S rDNA Phƣơng pháp tách chiết DNA đƣợc tiến hành theo Sambrook và Russell [51]. Gen 16S rRNA đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi 27f (5'- TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và 1492R (5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Trình tự 16S rDNA nucleotide đƣợc phân tích dựa trên dữ liệu Ngân hàng gen của NCBI. Độ tƣơng đồng về trình tự đƣợc xác định và so sánh với các trình tự khác đƣợc so sánh trên nhân hàng GenBank bằng BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov). Mức độ tƣơng đồng di truyền của các chủng đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm CLC DNA workbench 6.6. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp một số enzyme ngoại bào: Khả năng sinh tổng hợp các enzym ngoại bào của các chủng nấm đƣợc khảo sát trên môi trƣờng khoáng, có bổ sung 1% các nguồn cơ chất khác nhau nhƣ: tinh bột tan, casein, xylan, RBBR (Remazol Brilliant Blue R) và Guaiacol, nuôi ở nhiệt độ 28°C. Khả năng sinh enzym ngoại bào đƣợc quan sát và đo đƣờng kính vòng phân hủy xung quanh khuẩn lạc. 2.2.4. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật và thu nhận enzym Nuôi cấy trong môi trường lỏng: Thực hiện trên bình nón dung tích 250 ml với 75 ml môi trƣờng khoáng phân lập có bổ sung thêm 0,2% pepton và 0,5% glucose. Các bình môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 121 oC trong 30 phút, và đƣợc làm nguội về nhiệt độ phòng, tiến hành bổ sung 0,5 % (w/v) chất chiết nhựa thu nhận từ gỗ keo và 2% (v/v) giống, các bình đƣợc nuôi cấy ở tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau 3-5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, tiến hành ly tâm thu dịch nổi để xác định hoạt tính các enzyme. Phương pháp nuôi cấy trên dăm gỗ: Nuôi cấy vi sinh vật trên dăm gỗ đƣợc thực hiện theo Su et al. (2011) với một vài thay đổi nhỏ. Dăm gỗ keo thu nhận tại nhà máy có kích thƣớc từ 1-2 cm2, đƣợc làm ẩm đến 60% (v/w) và khử trùng 121oC trong vòng 15 phút. 2 kg gỗ đƣợc bổ sung giống vi sinh vật 26 ở tỷ lệ kiểm tra và đƣợc ủ trong 7, 14 và 21 ngày. Mẫu đối chứng đƣợc xử lý tƣơng ứng bằng nƣớc [52]. Phương pháp thu nhận enzyme thô: Lấy ra 10 gram dăm mảnh gỗ đƣợc ủ với vi sinh vật cho vào trong 100ml dung dịch đệm và lắc trên máy có tốc độ vòng 200 vòng/ phút trong vòng 2 giờ. Thu dịch và tiến hành xác định hoạt độ các enzym (laccase, sterol esterase, cellulase). 2.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzym Phương pháp xác định hoạt tính sterol esterase Nguyên tắc: Dựa trên sự thuỷ phân của pNBP thành sản phẩm oxy hoá hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 410nm [53]. Dung dịch phản ứng bao gồm pNBP 2 mM pha trong đệm Tris-HCl (pH 7) và dịch enzyme tỷ lệ 1:1. Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng khi bắt đầu khi bổ sung dung dịch pNBP 2 mM trong 15 phút. Dừng phản ứng bằng cách ủ trong đá lạnh 5 phút. Đo giá trị hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 410nm. Mẫu đối chứng dịch enzyme đƣợc thay bằng dung dịch đệm Tris-HCl (pH 7) không có bổ sung cơ chất. Một đơn vị hoạt độ (U) esterase đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme cần thiết để oxy hóa 1 µmol pNBP trong một phút ở nhiệt độ phòng. Công thức tính: Hoạt tính = ( ) (U/ml) Trong đó: t: thời gian phản ứng (phút); V: tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml); v: thể tích dịch enzym thô (ml); ε: hệ số hấp thụ (15.200 M-1cm-1). Phương pháp xác định hoạt tính laccase Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hoá 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulphonic acid) (ABTS) thành sản phẩm oxy hoá hấp thụ mạnh ở bƣớc sóng 460nm. Dung dịch phản ứng bao gồm 1,5 ml đệm acetat 50 mM pH 4,8, 0,5 27 ml ABTS 0,4 mM và 0,5 ml dịch enzym. Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng khi bắt đầu khi bổ sung dung dịch cơ chất ABTS 0,4 mM. Đọc giá trị hấp thụ ở 460 nm sau 3 phút ở nhiệt độ 30oC. Mẫu đối chứng, enzyme phản ứng đƣợc bất hoạt ở 100oC trong 15 phút [54]. Một đơn vị hoạt độ laccase đƣợc định nghĩa là lƣợng enzym cần thiết để oxy hóa 1 µmol ABTS trong một phút ở điều kiện phản ứng. Công thức tính: Hoạt tính = ( ) (U/ml) Trong đó: Trong đó: t: thời gian phản ứng (phút); V: tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml); v: thể tích dịch enzym thô (ml); ε: hệ số hấp thụ 36000 (M-1cm-1) Phương pháp xác định hoạt tính cellulase Nguyên tắc: Phƣơng pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi cellulase. Lƣợng đƣờng khử sinh ra phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) cho dung dịch có màu vàng cam. Dung dịch màu này đƣợc xác định bằng phƣơng pháp so màu trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 540 nm. Lƣợng đƣờng khử tạo ra đƣợc xác định từ đƣờng chuẩn glucose đƣợc xây dựng trƣớc. Đơn vị hoạt tính cellulase (U/L) đƣợc xác định nhƣ là lƣợng enzyme phân giải tạo ra lƣợng đƣờng khử trong điều kiện thí nghiệm. Phương pháp: Dung dịch phản ứng chứa 1 ml dung dịch enzyme và 1ml dung dịch cơ chất nồng độ 1%. Giữ các ống phản ứng ở 50oC trong 30 phút. Lấy 1ml dịch phản ứng, bổ sung thêm 1 ml dung dịch DNSA, sau đó đem đun sôi trong 10 phút. Để lạnh trong 5 phút. Tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 540 nm. Đối với mẫu đối chứng tiến hành giống nhƣ trên nhƣng không có ủ ở 50oC trong 30 phút. Hàm lƣợng glucose đƣợc xác định bằng phƣơng trình đƣờng chuẩn chuẩn glucose [55]. 28 Xây dựng phương trình đường chuẩn Chuẩn bị dung dịch glucose chuẩn có nồng độ 10 mg/ml để làm dung dịch gốc. Tiến hành pha dãy ống nghiệm có nồng độ glucose liên tiếp từ 0 – 1 mg/ml, bằng cách bổ sung nƣớc cất theo tỷ lệ: Nồng độ (mg/ml) Glucose (ml) Nƣớc cất (ml) 0 0 1 0,05 0,005 0,995 0,1 0,01 0,99 0,15 0,015 0,985 0,2 0,02 0,98 0,25 0,025 0,975 0,3 0,03 0,97 Bổ sung vào từng ống nghiệm 1ml thuốc thử DNSA, đun sôi trong 10 phút, tiến hành làm lạnh nhanh. Đo độ hấp thụ màu của các ống bằng máy quang phổ ở bƣớc sóng 540nm. Dựng đƣờng chuẩn glucose ở dạng phƣơng trình y = ax +b với R2 ≥ 0,99 (Hình 2.1) Hình 2. 1. Đồ thị đƣờng chuẩn Glucose Hoạt tính Cellulase đƣợc tính toán theo công thức U/L = ×1000 Trong đó: X: Lƣợng đƣờng khử tƣơng đƣơng đƣợc tạo ra (mg/ml) 29 D: Hệ số pha loãng enzyme V: Thể tích enzyme (ml) T: Thời gian phản ứng 2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nhựa cây bằng chiết trong aceton Dăm mảnh gỗ ủ với vi sinh vật đƣợc rửa bằng nƣớc cất khử trùng, sấy ở 60 oC trong 2 giờ, chẻ nhỏ mảnh rồi nghiền thành bột gỗ kích thƣớc 0,3 - 0,4 mm. Hàm lƣợng chất chiết đƣợc xác định theo phƣơng pháp chiết Soxhlex bằng aceton trong 6 giờ theo Martinez-Inĩgo et al. (2000a) và TAPPI T204- 2007 với vài thay đổi nhỏ [56]. Các bƣớc tiến hành: - Cho mẫu vào bộ Soxhlex cùng với 150 ml axeton. - Đặt bộ Sohlex vào bếp cách thủy ở nhiệt độ 72oC, thời gian chiết 6 giờ. - Lấy bình chứa dung dịch chiết ra khỏi Soxhlex rồi mang đi sấy ở 105 oC trong thời gian 2 giờ. - Đặt bình chứa dung dịch chất chiết vào bình hút ẩm để nguội và cân chính xác tới 0,0001g. Tiến hành thí nghiệm trắng: Để 150 ml dung môi bay hơi tới khô và tiến hành cân chính xác tới 0,0001g. Hiệu chỉnh khối lƣợng chất chiết với khối lƣợng cân đƣợc trong thí nghiệm trắng. Hàm lƣợng các chất chiết đƣợc tính theo công thức sau: W W .100 W c b p AE   Trong đó: - Wc: khối lƣợng chất chiết - Wb: Khối lƣợng chất chiết còn lại trong thí nghiệm trắng (g) - Wp: Khối lƣợng mẫu thử khô tuyệt đối (g) 2.2.7. Phƣơng pháp nấu bột giấy sunfate Dăm mảnh sau khi xử lý với chế phẩm sinh học đƣợc tiến hành nấu theo 30 phƣơng pháp Sunphat trong nồi nấu thí nghiệm 4,5 lít, gia nhiệt gián tiếp bằng điện theo các điều kiện công nghệ nhất định. Quy trình nấu bột giấy đƣợc lựa chọn tƣơng tự nhƣ quy trình nấu hiện đang áp dụng tại Tổng Công ty Giấy Việt Nam. Tuy nhiên, một số yếu tố nhƣ thời gian tăng ôn và thời gian bảo ôn dài hơn phụ thuộc vào yêu cầu của thiết bị nấu trong phòng thí nghiệm tại Viện Công nghiệp Giấy và Xenluylô. Hóa chất và quy trình thực hiện: NaOH, 20%; sulfide, 25%; mảnh/nƣớc, 1:4; nhiệt độ nấu, 170 oC; thời gian nấu, 150 phút. Bột giấy sau nấu đƣợc rửa trên các lƣới rửa với số mắt lƣới là 40 mesh và 100 mesh. Bột giấy hợp cách qua lƣới 40 mesh đƣợc vắt khô, bảo quản để sử dụng cho các công đoạn thí nghiệm tiếp theo. Bột giấy thu đƣợc đem đi xác định hiệu suất, trị số Kappa, tàn kiềm và hàm lƣợng nhựa trong bột sau nấu. 2.2.8. Phƣơng pháp xác định chỉ số Kappa (đánh giá hàm lƣợng lignin) Định nghĩa: Chỉ số Kappa của bột là số ml của dung dịch kali permanganat 0,02 mol/l tiêu hao cho 1 g bột (đƣợc tính trên cơ sở sấy khô) trong điều kiện quy định. Nguyên tắc: Bột đƣợc đánh tơi sẽ đƣợc phản ứng với một lƣợng dung dịch kali permanganat quy định trong một thời gian nhất định. Số lƣợng bột đƣợc chọn để sao cho khoảng 50 % tổng khả năng ôxi hóa của permanganat còn lại không tiêu thụ hết vào cuối thời gian phản ứng. Chỉ số kappa của bột nấu đƣợc đánh giá theo tiêu chuẩn TCVN 4361:1907, ISO 302:1904, liên quan trực tiếp đến lƣợng lignin (độ cứng) hoặc khả năng tẩy trắng của bột. 2.2.9. Phƣơng pháp phân tích thống kê. Tất cả các thí nghiệm đều đƣợc thực hiện 3 lần. Số liệu đƣa ra trong báo cáo này là giá trị trung bình theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai (ANOVA), tiếp theo là so sánh giữa các nhóm thông qua tính khác biệt nhỏ nhất có ý nghĩa (Least significant difference – LSD) ở mức ý nghĩa p < 0,05, sử dụng phần mền thống kê phân tích dữ liệu Excel. 31 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÀ XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA CÂY. 3.1.1. Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy nhựa cây Cơ chất sterol là thành phần đƣợc đánh giá rất khó phân hủy trong các chất chiết nhựa. Nó là nguyên nhân gây nhiều vấn đề lớn cặn nhựa trong sản xuất giấy. Trong nguyên liệu gỗ stigmasterol là thành phần sterol có mặt trong hầu hết các loại gỗ, vì vậy đƣợc sử dụng làm cơ chất tuyển chọn các chủng có tiềm năng phân hủy nhựa trong nghiên cứu này. Từ 19 mẫu mùn đất phân lập đƣợc 162 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn (92 chủng phát triển ở nhiệt độ 37oC và 70 chủng phát triển ở 45 oC). Các chủng này đƣợc tách, làm sạch trên môi trƣờng phân lập và giữ giống trên môi trƣờng Bennet (Bảng 3.1). Hình 3. 1. Hình ảnh vi sinh vật phát triển trên môi trƣờng phân lập Bảng 3. 1. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập ở nhiệt độ 37oC và 45oC trong các mẫu Mẫu Nhiệt độ phân lập 37oC Nhiệt độ phân lập 450C Vi khuẩn Xạ khuẩn Vi khuẩn Xạ khuẩn BG VSBG-1, VSBG-2, VSBG-3 VSBG-4, VSBG-5 XBG-2, XBG-3, XBG-4, XBG-5 CVSBG-2, CVSBG-3 CXBG-23 Đ1 VSĐ1-1, VSĐ1-4, - CVSĐ1-6 - ĐN VSĐn-1, VSĐN-2, VSĐn-3, VSĐn-4, VSĐn-5 XĐN-1 CVSĐN-1, CVSĐN-2 CXĐN-1, CXĐN-3 D1 VSD1-1, VSD1-2, VSD1-3, VSD1-4 XD1-1, XD1-2, XD1-3 CVSD1-4, CVSD1-1 CXD1-1, CXD1-4 32 D2 VSD2-1, VSD2-3 XD2-2, XD2-3 CVSD2-1, CVSD2-2, CVSD2-3, CVSD2-4 CXD2-15, CXD2-17 D3 VSD3-1, VSD3-2, VSD3-3, VSD3-4 XD3-1, XD3-2 CVSD3-4 CXD3-1, CXD3-2 D4 VSD4-1, VSD4-2, VSD4-3, VSD4-4, VSD4-5 - CVSD4-1 CXD4-1, CXD4-2 S1 VSS1-1, VSS1-2, VSS1-3 XS1-2, XS1-4 CVSS1-1, CVSS1-2 CXSS1-1 S2 VSS2-1, VSS2-2, VSS2-3 XS2-2, XS2-3 CVSS2-1 CXS2-2, CXS2-3 S3 VSS3-1, VSS3-3 XS3-1, XS3-2 CVSS3-2, CVSS3-1, CXS3-1, CXS3-3 M1 VSM1-1, VSM1-2, VSM1-3, VSM1-4 XM1-1, XM1-2, XM1-3 CVSM1-1, CXM1-20 M2 VSM2-3, VSM2-2 XM2-1, XM2-2 CVSM2-1, CVSM2-2, CVSM2-3, CVSM2-4 CXM2-2, CXM2-3 M3 VSM3-1, - CVSM3-1, CVSM3-2, CVSM3-3, CXM3-2 M4 VSM4-1, VSM4-2, VSM4-2, VSM4-3 XM4-1, XM4-2 XM4-3 CVSM4-1, CVSM4-2, CVSM4-3 CXM4-3, CXM4-4, CXM4-5 M6 VSM6-1, VSM6-2, VSM6-3 - CVSM6-1 CXM6-2 MT VSMT-1, VSMT-2, VSMT-3, VSMT-4 XMT-1 CVSMT-1, CVSMT-2, CVSMT-3 - MT2 VSMT2-1, VSMT2- 2, VSMT2-3 - CVSMT2-1, CVSMT2-2, CVSMT2-3, CVSMT2-4 - VC1 VSVC1-1, VSVC1- 2, VSVC1-3 XVC1-1, XVC1- 3, XVC1-2 CVSVC1-1, CVSVC1-2 CXVC1-2, CXVC1- 1 VC2 VSVC2-1, VSVC2- 2, VSVC2-3 - CVSVC2-1, CVSVC2-2, CVSVC2-3 CXVC2-1, CXVC2- 25 Ghi chú: (BG) Mẫu được lấy cạnh nguồn nước thải. (Đ1, Đn): Mẫu đất được lấy xung quanh khu vực nhà mấy giấy bãi bằng, (D1, D2, D3, D4): dăm mảnh gỗ, (S1, S2, S3): mẫu trong khu vực xuất hiện lignin, (M1, M2, M4, M5, M6): Mẫu mùn trong bãi gỗ nguyên liệu, (MT, MT2): mạt cưa, (VC1, VC2): vỏ cây. Các chủng vi sinh vật tách từ môi trƣờng phân lập ban đầu đƣợc kiểm tra khả năng phát triển trên môi trƣờng phân lập lỏng. Sau 48 giờ nuôi cấy, có 104 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phát triển trên môi trƣờng này (trong đó có 51 chủng phân lập ở 37oC và 53 chủng phân lập ở 45oC (Hình 3.3 và Bảng 3.2). Một số chủng VSM4-3, VSD1-2, VSD1-3, VSD2-1, VSD4-4, VSD4-5, 33 VSBG-3, VSS1-2, VSS3-3, VSVC2-2, CVSMT2-4, CVSM2-3, CVSVC2-3, CVSD2-1, CXD2-17 phát triển nhanh và tốt nên chúng đƣợc xem là những chủng có triển vọng trong những ứng dụng loại bỏ chất chiết nhựa. Hình 3.2. Khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn trên môi trƣờng phân lập lỏng Bên cạnh đó các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn phân lập, đƣợc đánh giá khả năng sinh lipase và khả năng phân hủy cellulose (1% CMC và tinh thể cellulose) bằng các vòng phân hủy xuất hiện trên môi trƣờng kiểm tra. Kết quả đƣợc thể hiện trên Hình 3.3, 3.4 và Bảng 3.2. Trong số 162 chủng phân lập, 17 chủng có khả năng sinh lipase, đáng chú ý nhấ