Luận văn Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng bacillus phân lập từ đất vườn

quá trình này sẽ chựng lại hoặc giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu do cơ chất gây nên. Nhiều nghiên cứu cho biết cellulose là nguồn chất cảm ứng thích hợp nhất đối với sự tổng hợp cellulase. Cellulase là enzyme cảm ứng vì vậy trong MT nuôi cấy VSV sinh enzyme này nhất thiết phải bổ sung cellulose là chất cảm ứng và là nguồn carbon. Nguồn carbon thường dùng và có hiệu quả khi nuôi VSV tổng hợp 28 cellulase là giấy lọc, bông thấm nước, giấy báo,mùn cưa, phế liệu nông nghiệp chứa cellulose như rơm rạ, lõi ngô, cám, bã củ cải đường [22]. Một số chất có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cellulase như glucose, succinate, acetate, citrate, các sản phẩm trung gian của chu trình Krep, muối amon thường làm ức chế tổng hợp cellulase. Cao ngô, cao nấm men, pepton có thể là chất tăng sinh tổng hợp cellulase ở một số chủng VSV, nhưng cũng có thể kìm hãm tổng hợp cellulase ở một số chủng khác. 1.3.4. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme Sự tổng hợp cảm ứng enzyme bởi cơ chất và ức chế tổng hợp enzyme bởi sản phẩm cuối cùng là hai quá trình liên quan mật thiết với nhau và được điều hòa trong quá trình phiên mã (điều hòa ở mức độ gen). Cơ chế điều hòa quá trình sinh tổng hợp cảm ứng enzyme được giải thích theo học thuyết operon ở E.coli nổi tiếng của Jacob và Monob năm 1961. Theo học thuyết này, cơ thể sống chỉ tạo ra một lượng đáng kể những enzyme cảm ứng khi có mặt chất cảm ứng. Còn những enzyme bản thể thường xuyên được tạo thành với mức độ đáng kể hoặc tối đa cả trên MT không có chất cảm ứng mà enzyme tác dụng [80]. Ngoài cơ chế điều hòa enzyme ở mức độ gen, trong quá trình sống của TB còn có kiểu điều hòa ở mức độ enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược hay còn gọi là cơ chế dị lập thể (alosteric) điều hòa tổng hợp các chất trao đổi. Sự tổng hợp phần lớn các sản phẩm trao đổi chất thường xảy ra ở nhiều giai đoạn, ở mỗi giai đoạn được thực hiện bởi một enzyme xác định. Enzyme này khác với những enzyme khác ở chỗ ngoài khả tăng tác động lên chất cảm ứng còn có tính nhạy cảm với sản phẩm cuối cùng. Sản phẩm cuối cùng được tích tụ trong TB tới một nồng độ xác định sẽ ức chế hoạt động của enzyme đầu tiên làm cho cả chuỗi phản ứng bị ngừng lại. Enzyme tuy vẫn được tổng hợp nhưng bất hoạt. Kết quả là TB tạm ngừng tổng hợp sản phẩm cuối cùng cho tới khi nào nồng độ chất này không còn dư [33]. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược xảy ra như sau: enzyme ở giai đoạn đầu kết hợp với sản phẩm cuối cùng làm biến dạng bề mặt hoạt động, do đó nó không còn khả năng xúc tác phản ứng trong chuỗi phản 29 ứng. Người ta gọi biến dạng này là biến dạng dị lập thể và những hệ thống enzyme có thể bị biến dạng bởi các chất chuyển hóa được gọi là hệ thống dị lập thể [33]. Dẫn chứng cho quá trình điều hòa dị lập thể là quá trình sinh tổng hợp valin từ acid pyruvic qua bốn giai đoạn nhờ bốn enzyme xúc tác tương ứng. Khi sản phẩm cuối cùng đạt được nồng độ cao nó sẽ tác dụng với enzyme ban đầu làm nó bị biến dạng và bất hoạt [19]. Hình 1.9. Sự điều hòa enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược [19] Do đó, để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme bằng cơ chất cảm ứng cần chú ý: − Có gen tương ứng trong nhiễm sắc thể của TB. − Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng phần tử của enzyme đó. − Năng lượng cần thiết dùng cho tổng hợp enzyme. − Muốn thu nhận enzyme cảm ứng nào thì phải cho cơ chất cảm ứng của enzyme đó vào MT nuôi cấy VSV. − Tác động cảm ứng chỉ đạt hiệu quả cao ở một liều lượng cơ chất nhất định. Nếu vượt quá liều lượng này sẽ làm cho quá trình tổng hợp enzyme sẽ càng giảm. Như vậy, ta có thể coi việc có cơ chất cảm ứng là việc rất cần thiết để thu nhận những enzyme mong muốn. Trong công nghiệp sản xuất enzyme, cần phải lựa chọn những cơ chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong MT để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [19]. Ức chế enzyme Acid α- cetoisovaleric Acid α, β- dioxyisovaleric Enzyme II Acid α- acetolactic Acid pyruvic Enzyme I Enzyme III Enzyme IV Valin 30 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Nguyên vật liệu Các chủng Bacillus phân lập được từ đất vườn thuộc xã Bình Nhì, huyện Gò Công Tây, tỉnh Tiền Giang. Nguyên liệu làm cơ chất là các phế liệu nông nghiệp: rơm, bã mía, lõi ngô, trấu, cám mua tại chợ Vĩnh Bình, Gò Công Tây, Tiền Giang. 2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Hóa chất Glucose, agar, CMC, cao thịt, cao nấm men, pepton, tinh bột, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaNO3, KCl, FeSO4.7H2O 2.2.2. Thiết bị − Nồi hấp vô trùng Huxley (Đà Loan) − Tủ ấm Sanyo (Nhật) − Tủ lạnh Hitachi (Nhật) − Tủ sấy Memmert (Đức) − Tủ cấy vô trùng (Việt Nam) − Máy đo pH Hana (Nhật) − Máy quang phổ UV/ Visibl Spectrophometer (Nhật) − Máy li tâm Hettich (Đức) − Kính hiển vi Olympus CHL (Nhật) − Cân phân tích điện tử Scientech (Nhật) − Máy ảnh kĩ thuật số Cannon (Nhật) − Pipetman Nichigo (Nhật) − Máy ảnh kĩ thuật số Olympus (Nhật) − Máy lắc Gerhardt (Đức) 2.3. Các môi trường sử dụng [14] MT1: Môi trường phân lập và giữ giống VK (MPA) Cao thịt 5g Pepton 5g NaCl 5g Agar 20g Nước cất 1000ml pH 7,0 – 7,2 32 MT2: Môi trường định tính khả năng sinh enzyme cellulase Pepton 5g Cao nấm men 2,5g CMC 5g Agar 20g Nước cất 1000ml MT3: Môi trường thử hoạt tính của enzyme cellulase Pepton 0,2g CMC 5g Glucose 0,05g MnSO4.4H2O 0,1g NaCl 3g K2HPO4 1,5g KH2PO4 1,5g Agar 20g Nước cất 1000ml MT4: Môi trường bán rắn sản xuất enzyme cellulase Trấu 20% Cám 80% MgSO4.7H2O 0,05g K2HPO4 0,1g NaCl 0,3g CaCl2 0,1g Độ ẩm ban đầu 50 – 55% MT5: Môi trường thử hoạt tính catalase Pepton 5g Cao thịt 5g Cao nấm men 5g Glucose 10g 33 MnSO4.4H2O 0,1g Tween 80 0,5g Agar 18g Nước cất 1000ml 2.4. Các phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus [23], [5] a. Nguyên tắc Tách rời các khuẩn lạc VK, nuôi cấy VK trên MT dinh dưỡng đặc trưng để thu KL riêng rẽ, cách biệt nhau. b. Tiến hành Thời gian lấy mẫu chia làm hai lần: lần 1 là ngày 24/12/2011 và lần 2 vào ngày 15/01/2012. Lấy một ít đất (10g) cho vào bình tam giác và thêm 90ml nước cất vô trùng lắc đều để tạo huyền phù, gia nhiệt tới 850C trong 20 – 25 phút, thu được dịch huyền phù có độ pha loãng 10-1. Lắc đều rồi hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3 10-4, 10-5. Nhỏ 0,1ml (2 giọt) dung dịch ở nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 lên đĩa petri thứ 1 có chứa MT1. Dùng que trang trải đều khắp trên mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục sang đĩa petri thứ 2 rồi thứ 3. Sau đó gói các đĩa petri bằng giấy báo và ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ thu được các KL riêng rẽ. Làm thuần Lấy 1 KL riêng rẽ hòa với nước cất vô trùng, cấy trang lên đĩa petri có MT1. Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng cho đến khi xuất hiện KL. Nếu thấy các dạng KL đồng đều về hình dạng, màu sắc thì giống phân lập đã thuần khiết. Chọn KL riêng rẽ cấy chuyền sang ống thạch nghiêng. Nuôi cấy và ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, sau đó bảo quản ở 40C. 34 c. Yêu cầu Chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết. 2.4.2. Phương pháp bảo quản giống * Cấy chuyền và bảo quản [11] Dùng que cấy cấy zich zắc VK trên bề mặt thạch nghiêng MPA, để ở 300C, sau 24 giờ thấy xuất hiện KL thì chuyển vào tủ lạnh 40C giữ giống. Tiến hành cấy chuyền định kì một tháng một lần, trước khi sử dụng phải hoạt hóa giống. * Giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng [12] Cho 0,2ml dầu khoáng (paraffin lỏng hay vazơlin) vào ống eppendoff, khử trùng bằng cách hấp ở 1210C/ 30 phút, để nguội. Nuôi cấy VK đạt đến độ trưởng thành. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 lượng VK cho vào ống eppendoff, trên đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng ống, bảo quản ở điều kiện lạnh 4-60C. 2.4.3. Quan sát hình thái khuẩn lạc [14] Quan sát một số chỉ tiêu của chủng nghiên cứu trên môi trường MPA. - Khả năng phát triển của KL. - Bề mặt KL. - Màu sắc KL. 2.4.4. Phương pháp nhuộm Gram [25] a. Nguyên tắc Dựa trên khả năng bắt màu của TB chất và thành TB với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc loại Gram dương. Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. VSV có phức chất này thuộc loại Gram âm b. Cách tiến hành 35 − VK được cấy trong ống thạch nghiêng chứa môi trường MPA từ 16 – 24h. Cho một giọt nước cất vô trùng lên phiến kính, dùng que cấy vô trùng lấy một ít tế bào VK hòa vào giọt nước và dàn mỏng. − Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá vì như thế tế bào VK sẽ bị biến dạng. Khi giọt nước bay hơi dần VK sẽ gắn chặt vào phiến kính. − Nhuộm màu bằng cách nhỏ tím gentian lên vết bôi qua giấy lọc, giữ 1 – 2 phút. − Tiếp theo nhỏ dung dịch lugol lên tiêu bản để trong 1 phút, sau đó bỏ giấy lọc và đổ thuốc đi, rửa lại tiêu bản bằng nước cất. − Tiếp tục rửa bằng cồn 960 trong thời gian 30 – 40 giây, rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi. − Nhuộm bổ sung bằng Fuchsin khoảng 1 – 2 phút, rửa lại bằng nước cất đến khi hết màu rồi để tiêu bản cho khô. Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x100. c. Kết quả Nếu VK bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương, VK bắt màu hồng là VK Gram âm. Chọn các chủng VK Gram dương để tiếp tục nghiên cứu. 2.4.5. Phương pháp nhuộm bào tử [25] a. Nguyên tắc Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Khi tế bào được xử lí bằng nhiệt và acid thì TB chất của bào tử rất dễ bắt màu. Nhuộm cả TB chất của bào tử và TB với thuốc nhuộm có khả năng bắt màu mạnh, sau đó tẩy màu TB chất của TB và nhuộm nó với một thuốc nhuộm phân biệt khác. Khi đó TB chất và bào tử sẽ bắt màu phân biệt. b. Cách tiến hành − Làm vết bôi với VK đã nuôi cấy hai tuần tuổi và để vết bôi khô tự nhiên. − Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn, giữ 2 phút rồi rửa nước. 36 − Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc rồi nhỏ Fuchsin, hơ nóng cho đến khi bốc hơi trong vòng 5 phút, nếu thuốc nhuộm cạn phải bổ sung ngay. − Bỏ giấy lọc ra và rửa vết bôi bằng nước. − Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút, sau đó rửa vết bôi bằng nước. − Nhuộm vết bôi bằng xanh methylene trong 5 – 15 phút. − Rửa vết bôi lại với nước và để khô tự nhiên. Quan sát tiêu bản trên KHV với vật kính dầu. c. Kết quả Bào tử sẽ mang màu đỏ, TB sinh dưỡng mang màu xanh. 2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính catalase [28] a. Nguyên tắc Catalase xúc tác phản ứng thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và giải phóng oxi (có hiện tượng sủi bọt). b. Cách tiến hành − Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên trên KL, hoặc chuyển một lượng VSV lên lam rồi thử bằng dung dịch H2O2 3%, dựa vào hiện tượng có sủi bọt (+) hay không (-) mà kết luận về hoạt tính catalase của mỗi chủng  từ đó cho biết mỗi chủng có phải là VK hiếu khí hay không. 2.4.7. Phương pháp định danh đến loài bằng sinh học phân tử [14]  Thu nhận DNA − Phá màng TB và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng các DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. − Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và cloroform (có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA. − Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol để thu được các acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.  Chạy PCR (polymerase chain reaction) 37 • Nguyên tắc: khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. • Tiến hành: phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước: - Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường khoảng là 940C – 950C trong vòng 30 giây – 1 phút. - Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động khoảng từ 400C – 700C và kéo dài trong vòng 30 giây – 1 phút. - Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được tăng lên 720C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây – 1 phút.  Giải trình tự DNA Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh lệch nhau 1 nucleotide. Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các deoxinucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotide. Ở cả hai phương pháp trên, các phân tử DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bảng phóng xạ tự ghi từ bảng điện di. Sau khi giải trình tự gen 16sRNA, so sánh với ngân hàng gen NCBI để định danh đến loài chủng VK nghiên cứu. 2.4.8. Phương pháp chiết dung dịch enzyme thô từ canh trường nuôi cấy VK [17] Nuôi VK trên MT 4, sau thời gian nuôi cấy thu dịch nuôi cấy VK: cho 60ml nước cất vô trùng vào mỗi bình tam giác chứa MT nuôi VK, khuấy trộn trong 30 38 phút rồi lọc lấy dịch lọc. Đem dịch lọc ly tâm 5000 vòng/ phút, phần dịch lọc bên trên chính là dịch enzyme thô. 2.4.9. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo đường kính vòng thủy phân a. Nguyên tắc Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzyme của VK phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt xung quanh KL. Độ lớn của vòng trong suốt thể hiện hoạt tính của enzyme. b. Tiến hành  Phương pháp cấy chấm điểm − Chuẩn bị các chủng VK cần nghiên cứu và MT định tính khả năng sinh enzyme cellulase (MT2). − Cấy chấm điểm các chủng VK lên bề mặt môi trường (3 điểm/ đĩa). − Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 300C trong 24 giờ. Sau đó, đo đường kính vòng phân giải. Phương pháp này chỉ sơ bộ định tính enzyme.  Phương pháp khoan lỗ thạch [1] − Chuẩn bị các đĩa petri có MT định tính enzyme (MT2). Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính enzyme, dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào các lỗ khoan. − Giữ các đĩa petri trong tủ lạnh 40C trong 8h, sau đó chuyển ra nhiệt độ phòng 24h. − Dùng thuốc thử nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải. c. Kiểm tra kết quả Dùng lugol nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu VK sinh ra cellulase  có 1 vòng trong suốt quanh lỗ khoan do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với lugol. d. Đánh giá khả năng tạo enzyme 39 Khả năng sinh cellulase được đánh giá bằng hiệu số D-d (D: đường kính vòng phân giải, d = 9 mm: đường kính của lỗ khoan). Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) (D – d) ≥ 25mm: enzyme có hoạt tính rất mạnh (D – d) = 20-24,5 mm: enzyme có hoạt tính mạnh (D – d) = 10-19,5 mm: enzyme có hoạt tính trung bình (D – d) ≤ 10mm: enzyme có hoạt tính yếu 2.4.10. Xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS [17] a. Nguyên tắc Cho enzyme tác dụng với cơ chất thích hợp trong điều kiện nhất định và xác định lượng đường khử tạo thành. Một đơn vị hoạt độ enzyme cellulase tương ứng với 1mg glucose tạo thành trong 1 giờ ở 400C. b. Tiến hành * Chuẩn bị hóa chất Dung dịch CMC 1% (w/v): cân chính xác 1g CMC, hòa tan trong 80ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5. Sau đó chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm và lắc đều. Thuốc thử DNS 1%: cân 5g DNS cho vào becher 500ml, thêm 200ml nước cất. Đặt becher vào chậu nước 800C và khuấy đều, thêm dung dịch NaOH (8g NaOH trong 75ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C. Tiếp tục thêm 150g potassium sodium tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 800C. Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình định mức 500ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp. Dung dịch lactose 0,12%: hòa tan 0,12g lactose với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Dung dịch DNS-lactose: trộn đều 75ml DNS với 25ml dung dịch lactose. 40 Dung dịch enzyme: pha loãng dung dịch enzyme với dung dịch đệm Na- acetate 50mM, pH 5 đến nồng độ phù hợp. * Dựng đường chuẩn Hòa tan 100mg glucose với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đếm vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt bảy ống nghiệm theo bảng sau Bảng 2.2. Xây dựng đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Dung dịch glucose 0,1% (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 06 Dung dịch CMC 1% (ml) 1 1 1 1 1 1 1 Dung dịch DNS-lactose (ml) 2 2 2 2 2 2 2 Nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ bước sóng 540nm. * Xác định hoạt độ enzyme cellulase − Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm thử thật, thay 1ml dung dịch đệm Na-acetate đối với ống đối chứng. − Đặt vào bể ổn nhiệt ở 400C trong 5 phút. Đồng thời ta cũng đặt lọ chứa lượng dung dịch CMC 1% ở 400C trong 5 phút. − Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. − Cho phản ứng ở 400C trong thời gian chính xác 10 phút. − Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. − Đem đun sôi cách thủy trong 5 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu ở bước sóng 540nm trên máy quang phổ. 41 Công thức tính Hoạt tính C = X: Số mg glucose suy ra từ đường chuẩn L: Độ pha loãng mẫu enzyme (số ml dịch lọc được) V: Thể tích phản ứng (ml) t: Thời gian thủy phân v: Lượng enzyme phản ứng (ml) 2.4.11. Phương pháp định lượng cellulose [7] a. Nguyên tắc Dựa vào tính chất bền của cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu. b. Tiến hành Cân chính xác 1 – 2 g mẫu khô cho vào bình cầu với 200ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp ống sinh hàn hoàn lưu trong 30 phút kể từ lúc sôi. Chú ý đừng để bọt trào lên. Tiếp theo lọc qua giấy lọc, rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH 0,5% nóng. Cho cặn cellulose tác dụng với 10ml HCl 10%, thêm vào đó 10ml dung dịch hypoclorit natri (nước javel) từng giọt một, vừa cho vừa khuấy đều. Để yên trong 5 phút rồi lọc. Cho cặn tác dụng trở lại với dung dịch NaOH 0,5% ở nhiệt độ 400C, để yêu vài phút rồi li tâm. Làm như thế 1 – 2 lần nữa để có cellulose thật trắng. Rửa thật kĩ bằng nước sôi. Sấy khô và cân. c. Tính kết quả Hàm lượng cellulose tính bằng công thức: X (%) = Trong đó: m a*100 X*L*V v*t 42 a: trọng lượng cellulose (g) m: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g) 2.4.12. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng 2.4.12.1. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng Tiến hành nuôi cấy VK trên MT 4 có các cơ chất cảm ứng khác nhau: bã mía, lõi bắp, rơm với hàm lượng như nhau (1%), mẫu đối chứng là VK nuôi trong MT 4 không bổ sung cơ chất cảm ứng. Sau thời gian nuôi cấy thu dịch enzyme, xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Chọn cơ chất cảm ứng thích hợp cho hoạt độ cellulase cao . 2.4.12.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng Để xác định nồng độ cơ chất cảm ứng thích hợp, chúng tôi tiến hành nuôi cấy VK trên MT theo kết quả thí nghiệm 2.4.12.1 có nồng độ cơ chất cảm ứng khác nhau: 1, 2, 3, 4, 5%. Sau thời gian nuôi cấy thu dịch enzyme, xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Chọn nồng độ cơ chất cảm ứng thích hợp cho hoạt độ cellulase cao nhất. 2.4.13. Phương pháp khảo sát một số điều kiện môi trường nuôi cấy để thu nhận cellulase 2.4.13.1. Xác định nguồn nitơ thích hợp, hàm lượng nitơ  Xác định nguồn thức ăn nitơ thích hợp Tiến hành nuôi cấy VK trên MT theo kết quả của thí nghiệm 2.4.12.2. Bổ sung vào MT nuôi cấy các nguồn nitơ khác nhau: cao nấm men, (NH4)2SO4, NH- 4NO3. Sau thời gian nuôi cấy thu dịch enzyme, xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Chọn nguồn nitơ thích hợp cho hoạt độ cellulase cao nhất.  Xác định nồng độ nguồn thức ăn nitơ Tiến hành nuôi cấy VK trên MT theo kết quả của thí nghiệm 2.4.13.1. Bổ sung vào MT nuôi cấy nguồn nitơ thích hợp có nồng độ khác nhau: 1, 2, 3, 4, 5%. Sau thời gian nuôi cấy thu dịch enzyme, xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Chọn nguồn nitơ có nồng độ thích hợp cho hoạt độ cellulase cao. 2.4.13.2. Xác định pH ban đầu của môi trường 43 Tiến hành nuôi cấy VK trên MT theo kết quả của thí nghiệm 2.4.13.1, điều chỉnh pH ban đầu của MT ở các mức khác nhau: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5. Sau thời gian nuôi cấy thu dịch enzyme, xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Xác định pH ban đầu thích hợp cho hoạt độ cellulase cao. 2.4.13.3. Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp Tiến hành nuôi cấy VK trên MT theo kết quả của thí nghiệm 2.4.13.2 ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 40, 45, 500C. Sau thời gian nuôi cấy thu dịch enzyme, xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ cellulase cao nhất. 2.4.13.4. Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp Tiến hành nuôi cấy VK trên MT theo kết quả của thí nghiệm 2.4.13.3 ở các khoảng thời gian khác nhau: 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120, 144 giờ. Sau thời gian nuôi cấy thu dịch enzyme, xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho hoạt độ cellulase cao nhất. 2.4.14. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô [17] Tiến hành nuôi cấy VK trên MT bán rắn theo kết quả của thí nghiệm 2.4.13.4. Sau thời gian nuôi cấy cho vào mỗi erlen 60ml nước cất vô trùng, khuấy trộn trong 30 phút và lọc lấy dịch lọc. Đem dịch lọc ly tâm 5000 vòng/ phút trong vòng 15 phút rồi thu phần dịch lọc bên trên. Tủa dịch chiết enzyme vừa thu được bằng cồn 960 theo tỉ lệ 1:3 (thể tích dịch chiết enzyme : thể tích cồn 960), giữ lạnh trong 15 – 30 phút, sau đó li tâm hoặc lọc hỗn hợp trên. Thu nhận chế phẩm enzyme lắng ở đáy ống li tâm và sấy khô ở nhiệt độ nhỏ hơn 400C. Bảo quản chế phẩm enzyme trong lọ thủy tinh ở 40C. 2.4.15. Phương pháp khảo sát một vài đặc điểm cellulase của chủng Bacillus được chọn 2.4.15.1. pH hoạt động tối ưu Tiến hành phản ứng enzyme trên cơ chất CMC 1%, ở nhiệt độ 400C, tỉ lệ enzyme ở các mẫu là như nhau (1ml), thay đổi pH các mẫu ở các mức khác nhau: 44 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Sau thời gian phản ứng, đo hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Xác định pH tối ưu cho hoạt động của cellulase. 2.4.15.2. Nồng độ cơ chất tối ưu Tiến hành phản ứng enzyme ở nhiệt độ 400C, pH theo kết quả của thí nghiệm 2.4.15.1, thay đổi nồng độ cơ chất CMC ở các mức khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5%. Sau thời gian phản ứng, đo hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của cellulase. 2.4.15.3. Nhiệt độ hoạt động tối ưu Tiến hành phản ứng enzyme theo kết quả của thí nghiệm 2.4.15.2, thay đổi nhiệt độ phản ứng ở các mức khác nhau: 35, 40, 45, 50, 55, 60, 650C. Sau thời gian phản ứng, đo hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của cellulase. 2.4.15.4. Phương pháp xác định thời gian hoạt động tối ưu Tiến hành phản ứng enzyme theo kết quả của thí nghiệm 2.4.15.3, ở các khoảng thời gian khác nhau: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 phút. Sau thời gian phản ứng, đo hoạt độ cellulase theo phương pháp 2.4.10. Xác định thời gian phản ứng tối ưu của cellulase. 2.4.16. Phương pháp xử lí số liệu Các thí nghiệm trong luận văn được lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả trình bày trong luận văn là số liệu trung bình ± sai số được tính bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. 45 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK có hoạt tính cellulase 3.1.1. Phân lập Từ 22 mẫu đất, tiến hành đem phân lập, chúng tôi thu được 156 dạng KL khác nhau (tạm gọi là chủng), trong đó có 106 chủng từ 13 mẫu đất mặt và 50 chủng từ 9 mẫu đất sâu. Các chủng này được kí hiệu khác nhau để tiện cho việc nghiên cứu. Chủng được kí hiệu theo tầng đất lấy mẫu và số lượng chủng có trong mẫu đó. Ví dụ từ mẫu thứ nhất lấy từ tầng đất mặt chúng tôi phân lập được 5 chủng thì kí hiệu lần lượt là ĐM1.1, ĐM1.2