Luận văn Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase ở một số chủng bacillus

. Sự tổng hợp cảm ứng chỉ thấy ở các môi trường không chứa nguồn cacbon dễ đồng hóa (ví dụ: glucose). Ngay khi sự cảm ứng đã bắt đầu ta cũng có thể ngăn cản hiện tuợng này bằng cách cho thêm glucose vào môi trường. Người ta gọi đó là hiệu ứng glucose. [1] Ví dụ: Khi bổ sung glucose vào môi trường sẽ xảy ra hiện tượng ức chế và kìm hãm quá trình sinh tổng hợp amylase. Vì vậy trong sản xuất không nên thêm vào môi trường các nguồn cacbon dễ đồng hóa hoặc chỉ thêm vào một lượng rất hạn chế để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển lúc đầu mà thôi.[11] 1.3.7. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzym Thông tin về sự tổng hợp enzym hay bất kì một protein nào đều đã được mã hóa trong nhân tế bào. Vì vậy sự điều hòa sinh tổng hợp enzym (hay protein) có thể xảy ra ở mức độ gen. Cơ chế điều hòa luôn diễn ra theo nguyên tắc tiết kiệm và đạt hiệu quả cao nhất. [1] Sự tổng hợp cảm ứng enzym bởi cơ chất và ức chế tổng hợp enzym bởi sản phẩm cuối cùng là hai quá trình liên quan mật thiết với nhau và được điều hòa trong quá trình phiên mã (điều hòa ở mức độ gen). Cơ chế điều hòa quá trình sinh tổng hợp cảm ứng enzym được giải thích theo học thuyết operon ở E.coli nổi tiếng của Jacob nà Monod năm 1961 (đã được trình bày ở mục 1.3.4). Theo học thuyết này cơ thể sống chỉ tạo ra một lượng đáng kể những enzym cảm ứng khi có mặt chất cảm ứng. Còn những enzym bản thể thường xuyên được tạo thành với mức độ đáng kể hoặc tối đa cả trên môi trường không có chất cảm ứng mà enzym tác dụng. [61] Ngoài cơ chế điều hòa enzym ở mức độ gen như đã trình bày ở trên, trong quá trình sống của tế bào còn có kiểu điều hòa ở mức độ enzym theo nguyên tắc liên kết ngược hay còn gọi là cơ chế dị lập thể (alosteric) điều hòa tổng hợp các chất trao đổi. Sự tổng hợp phần lớn các sản phẩm trao đổi chất thường xảy ra ở nhiều giai đoạn, ở mỗi giai đoạn được thực hiện bởi một enzym xác định. Enzym này khác với những enzym khác ở chỗ ngoài khả năng tác động lên chất cảm ứng còn có tính nhạy cảm với sản phẩm cuối cùng. Sản phẩm cuối cùng được tích tụ trong tế bào tới một nồng độ xác định sẽ ức chế hoạt động của enzym đầu tiên làm cho cả chuỗi phản ứng bị ngừng lại. Enzym tuy vẫn được tổng hợp nhưng bị bất hoạt. Kết quả là tế bào tạm ngừng tổng hợp sản phẩm cuối cùng cho tới khi nào nồng độ chất này không còn dư. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzym theo nguyên tắc liên kết ngược xảy ra như sau: enzym ở giai đọan đầu kết hợp với sản phẩm cuối cùng làm biến dạng bề mặt hoạt động, do đó nó không còn khả năng xúc tác phản ứng trong chuỗi phản ứng. Người ta gọi biến dạng này là biến dạng dị lập thể và những hệ thống enzym có thể bị biến dạng bởi các chất chuyển hóa được gọi là hệ thống dị lập thể. [11] Dẫn chứng cho quá trình điều hòa dị lập thể là quá trình sinh tổng hợp valin từ acid pyruvic qua bốn giai đoạn nhờ bốn enzym xúc tác tương ứng (hình 1.10). Khi sản phẩm cuối cùng là valin đạt được nồng độ cao nó sẽ tác dụng với enzym ban đầu, làm nó biến dạng và mất hoạt động. [11] Hình 1.12: Sự điều hòa enzym theo nguyên tắc liên kết ngược( biến dạng dị lập thể) [11] Acid pyruvic Acid α- acetolactic Acid α, β- dioxyisovaleric Acid α- cetoisovaleric Valin Enzym I Ức chế enzym Enzym IV Enzym III Enzym II Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng vi sinh vật nghiên cứu: Các chủng Bacillus do phòng thí nghiệm, bộ môn Sinh hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. 2.1.2. Nguyên liệu sử dụng làm cơ chất - Pectin (hãng Merck) - Cà rốt - Vỏ bưởi 2.1.3. Môi trường nuôi cấy  Môi trường giữ giống: MT MPA Cao thịt :5g NaCl :5g Pepton :5g Thạch :20g Nước cất :1lít pH :7,0- 7,2  Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym pectinase: MT Czapeck- Dox pectin Pectin :5 g NaNO3 :2g K2HPO4 :1g KCl : 0.5g MgSO4.7H2O : 0.5g Cao nấm men :1g Agar :20g Nước cất : 1lít  Môi trường sản xuất enzym pectinase: MT bán rắn có bổ sung chất cảm ứng Trấu : 20% Cám : 80% Chất cảm ứng : bổ sung từ 1g- 5g chất cảm ứng vào 100g môi trường Độ ẩm ban đầu : 50- 55% 2.2. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT Dụng cụ: thước đo khuẩn lạc, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy lọc, giấy báo cũ, bông mỡ, bông thấm nước, đũa khuấy, phễu, ống đong, nồi nấu môi trường, lò điện, vải lọc … Thiết bị: Nồi hấp vô trùng Tủ cấy vô trùng Tủ sấy Tủ ấm Tủ lạnh Máy đo pH Máy li tâm Cân phân tích điện tử Máy chụp ảnh kỹ thuật số Máy nghiền mẫu Máy đo độ ẩm Máy đo quang phổ UV / Visible Spectrophometre Hóa chất và vật liệu Cao thịt, pepton, cao nấm men, pectinase, agar, cồn, trấu, cám. NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, Lugol và các hóa chất khác sử dụng trong từng phương pháp sẽ nêu cụ thể. 2.3. PHƯƠNG PHÁP 2.3.1. Phương pháp cấy truyền và giữ giống Trên môi trường ghi ở mục 2.1.3. Tiến hành cấy truyền định kì một tháng một lần, để tủ ấm 30- 370C từ 2-3 ngày, sau đó giữ tủ lạnh 2-40C. Trước khi sử dụng phải cấy truyền sang ống thạch mới. [8][2] 2.3.2. Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzym pectinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải Nguyên tắc: Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong môi trường thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục môi trường giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh khả năng hoạt động của enzym.  Phương pháp này chỉ định tính enzym, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp pectinase chứ chưa xác định chính xác hoạt độ pectinase. Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường ghi ở mục 2.1.3 đã tiệt trùng . Đem ủ 48 h ở 370 C. Sau khi khuẩn lạc có đường kính khoảng 3mm, nhỏ dung dịch lugol vào đĩa, kiểm tra vòng phân giải. Sau đó kết luận các chủng Bacillus đem nghiên cứu có tạo enzym pectinase hay không, nhiều hay ít. [4] [5] [6] 2.3.3. Phương pháp nuôi cấy Bacillus Sau khi hấp khử trùng, các erlen chứa môi trường bán rắn ở mục 2.1.3 được để nguội. Giống vi khuẩn Bacillus được giữ trong ống thạch nghiêng được cấy vào trong các erlen. Cho vào 10ml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng, hòa đều. Dùng que thủy tinh khuấy nhẹ để các tế bào và bào tử Bacillus hòa lẫn trong nước. Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 600nm. Cho vào mỗi erlen chứa 10g môi trường nuôi cấy một thể tích dịch huyền phù sao cho đạt mật độ tế bào là 105- 106 tế bào / 1g canh trường. Nuôi cấy ở các điều kiện (nhiệt độ, pH,…) thích hợp theo từng thí nghiệm, độ ẩm 50- 60%.[8] 2.3.4. Phương pháp chiết dung dịch enzym từ canh trường nuôi cấy vi khuẩn Cho vào mỗi erlen 50ml nước cất, khuấy trộn trong 30 phút và lọc lấy dịch lọc. đem dịch lọc li tâm 7000vòng/ phút trong 15 phút, thu phần dịch trong bên trên và đem xác định họat tính enzym pectinase trong dung dịch enzym thu được. [21] 2.3.5. Xác định hoạt độ pectinase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5-dinitrosalicylic) [25] [50]  Phương pháp so màu Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất. Phân tích bằng phương pháp này mất ít thới gian so với các phương pháp hóa học khác.  Nguyên tắc Cho enzym tác dụng với cơ chất là pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic được hiện màu với thuốc thử DNS (acid dinitrosalicylic) và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575nm.  Định nghĩa đơn vị hoạt tính Một đơn vị họat tính pectinase là lượng enzym cần thiết để giải phóng một µmol acid D-galacturonic từ pectin trong một phút ở 370C, pH = 4,2.  Hóa chất - Dung dịch đệm acetat 0,1 M, pH 4,2 (dung dịch đệm thí nghiệm) - Thuốc thử DNS: + Dung dịch A: hòa tan trong 300g muối Na-K tartrat kép vào 500ml nước cất. + Dung dịch B: hòa tan trong 10g acid 3,5-dinitrosalicylic vào trong 200ml dung dịch NaOH 2M. Thuốc thử DNS dùng cho phản ứng: trộn dung dịch với dung dịch B, thêm nước cất đủ 1 lít. Chỉ pha chế dung dịch thuốc thử trước khi sử dụng. Giữ trong chai nâu và tránh CO2. - Dung dịch D-galacturonic chuẩn 100 µmol/ml. - Dung dịch pectin 1%: đun nóng 100ml dung dịch đệm thí nghiệm. Trong khi đun và khuấy, cho từ từ 1g pectin, đun và khuấy đến khi tan. Dung dịch trong và có dạng keo. Không đun sôi dung dịch. Làm lạnh và thêm nuớc cho đủ 100ml. Bảo quản ở 40C. - Dung dịch enzym: hòa tan một lượng enzym nhất định trong dung dịch đệm và bảo quản trong ngăn đá.  Cách tiến hành Cho vào ống nghiệm : - 0,5ml dung dịch pectin 1% pha trong đệm acetat 0,1M pH 4,2. - 0,5ml dung dịch enzym pha trong đệm acetat. Lắc đều và ủ ở 370 trong 60 phút. Thêm 3ml thuốc thử DNS, trộn đều và đun sôi chính xác trong 15 phút, sau đó làm lạnh nhanh trong bồn nước lạnh. Thêm 1ml nước cất , lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 575nm. Đồng thời thực hiện mẫu thử không bằng cách thay 0,5ml dung dịch enzym bằng 0,5ml dung dịch đệm acatat.  Dựng đường chuẩn Xây dựng đường chuẩn với acid D-galacturonic chuẩn có nồng độ từ 0 đến 250mg/ml. Bảng 2.1 : Xây dựng đường chuẩn với acid D-galacturonic (mg/ml). Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dd acid D-galacturonic 100 mg/ml 0 1 2 3 4 5 Dung dịch đệm(ml) 5 4 3 2 1 0 Nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 Vẽ đồ thị biểu diễn mật độ quang(OD) theo nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml).  Tính kết quả Hoạt độ của enzym pectinase được tính theo công thức sau với đơn vị quốc tế UI: HđPe = (UI/g hay ml) X.n m Trong đó: X: lượng acid D-galacturonic được suy ra từ đường chuẩn(mg/ml) m: khối lượng canh trường(g) n: độ pha loãng HđPe: hoạt độ enzym pectinase (UI/g) 2.3.6. Định lượng pectin theo phương pháp Ca-pectat[13]  Nguyên tắc Dùng kiềm để xà phòng hóa hoàn toàn lượng pectin có trong mẫu vật, chuyển pectin sang dạng acid pectic, rồi dùng CaCl2 để tác dụng với acid này tạo dạng kết tủa Ca-pectat. Sấy khô kết tủa trên giấy đến trọng lượng không đổi, cân kết tủa khô rồi suy ra lượng pectin.  Hóa chất - Dung dịch CH3COOH 1N - Dung dịch NaOH 0,1N - Dung dịch CaCl2 2N: cân 230g pha trong 1 lít nước cất, lọc cẩn thận.  Cách tiến hành Cân 20g nguyên liệu (chứa pectin), giã nhỏ cho vào 100ml nước cất, gia nhiệt tứ 40-450 C, sau 2-3 giờ, lấy dung dịch chiết lần một, tương tự thực hiện lần 2, lần 3 sao cho tổng thể tích dung dịch chiết là 200ml. Lấy 20ml dung dịch này cho vào bình cầu rồi thêm 100ml dung dịch NaOH 0,1 N, để yên 7giờ (có thể qua đêm) sau đó thêm 50ml dung dịch CH3COOH 1N, qua 5 phút lại cho dung dịch CaCl2 2N để yên 1giờ. Đem đun sôi 5 phút, lọc qua giấy lọc đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa kết tủa Ca- pectat bằng nước cất nóng cho đến khi không còn ion Cl- (dùng dung dịch AgNO3 1% để thử). Sau khi rửa sạch kết tủa, cho giấy lọc vào chén, sấy khô ở 1050C cho đến trọng lượng không đổi. Sự khác nhau về trọng lượng giấy lọc và giấy lọc có kết tủa cho ta biết trọng lượng của Ca-pectat. Vì hàm lượng của canxi trong Caxi-pectat là 8% nên khi tính hàm lượng pectin ta phải nhân trọng lượng Ca-pectat với 0,92.  Cách tính hàm lượng pectin trong nguyên liệu Hàm lượng pectin trong nguyên liệu được tính theo công thức sau: A0(%) = B0 x 0,92 x 100 2 B0: Trọng lượng kết tủa Ca-pectat trên giấy (g) 2 : Lượng nguyên liệu có chứa pectin trong 20ml lấy để xà phòng hóa (g) 2.3.7. Phương pháp khảo sát cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp pectinase của chủng Bacillus được nghiên cứu 2.3.7.1. Khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng pectin tối ưu Tiền hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trong môi trường bán rắn không bổ sung cơ chất cảm ứng và có bổ sung pectin với tỉ lệ khác nhau 1%, 2%, 3%, 4%. Tách chiết enzym. Xác định sự biến thiên của hoạt độ. Từ đó xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho việc sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu. 2.3.7.2. Khảo sát cơ chất cảm ứng tối ưu Tiến hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trên môi trường bán rắn có bổ sung các nguồn cơ chất cảm ứng khác nhau (vỏ bưởi, cà rốt) với nồng độ điều chỉnh theo kết quả thí nghiệm 2.3.6 và 2.3.7.1 với thời gian nuôi cấy khác nhau (24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144 h). Tách chiết enzym. Xác định sự biến thiên của hoạt độ. Từ đó xác định loại cơ chất và thời gian nuôi cấy thích hợp cho việc sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu. 2.3.8. Phương pháp khảo sát một số điều kiện môi trường nuôi cấy thu nhận pectinase có hoạt độ cao nhất của Bacillus Bên cạnh cơ chất cảm ứng có vai trò quan trọng đối với quá trình tổng hợp enzym thì các yếu tố khác của môi trường như nguồn nitơ, nguồn chất khoáng, yếu tố pH, nhiệt độ, độ ẩm, … cũng ảnh hưởng đáng kể quá trình này. Do thời gian có hạn, chúng tôi chỉ khảo sát thêm ảnh hưởng của các yếu tố: nguồn nitơ, pH, nhiệt độ của môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp pectinase ở các chủng Bacillus nghiên cứu. 2.3.8.1. Phương pháp xác định nguồn nitơ thích hợp cho môi trường nuôi cấy Bacillus để thu nhận pectinase có hoạt độ cao nhất Tiến hành nuôi cấy các chủng Bacillus được chọn trên môi trường bán rắn có bổ sung chất cảm ứng và thời gian nuôi cấy thích hợp theo kết quả của thí nghiệm 2.3.7. Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các nguồn nitơ khác nhau (cao nấm men, (NH4)2SO4, NH4NO3) với các tỉ lệ khác nhau: 1-4%. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Vẽ đồ thị biến thiên của hoạt độ. Xác định nguồn nitơ tối ưu cho chủng Bacillus được chọn sinh tổng hợp pectinase. 2.3.8.2. Phương pháp xác định pH thích hợp cho môi trường nuôi cấy Bacillus để thu nhận pectinase có hoạt độ cao nhất: Chuẩn bị canh trường nuôi cấy theo mục 2.3.7 và bổ sung nguồn nitơ thích hợp theo kết quả của thí nghiệm 2.3.8.1. Sau đó điều chỉnh pH của môi trường bằng các dung dịch đệm: - pH 3, 4: đệm acetat - pH 5,6,7: đệm photphat - pH 8, 9: đệm borat Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Vẽ đồ thị biến thiên của hoạt độ. Xác định pH tối ưu cho chủng Bacillus được chọn sinh tổng hợp pectinase. 2.3.8.3. Phương pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy Bacillus thích hợp để thu nhận pectinase có hoạt độ cao nhất: Chuẩn bị canh trường nuôi cấy theo mục 2.3.7 có bổ sung nguồn nitơ, và điều chỉnh pH môi trường theo kết quả của các thí nghiệm trên. Tiến hành nuôi cấy các chủng Bacillus chọn lọc ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 25 oC, 30 oC, 35 oC, 37 oC, 40 oC, 45 oC, 50 oC. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Vẽ đồ thị biến thiên của hoạt độ. Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu cho chủng Bacillus được chọn sinh tổng hợp pectinase. 2.3.9. Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy thu nhận enzym pectinase của chủng Bacillus được chọn theo quy hoạch thực nghiệm[14] Để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy các chủng Bacillus thu chế phẩm enzym pectinase, chúng tôi dùng thực nghiệm yếu tố toàn phần. Từ các kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ từng yếu tố, chúng tôi chọn 3 yếu tố là nguồn nitơ, nhiệt độ môi trường nuôi cấy và pH để nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm. Ba yếu tố được nghiên cứu ở 5 mức ( -, -1, 0, +1, +) với 15 thí nghiệm ( bảng 2.3) Bảng 2.2: Các mức yếu tố của môi trường Nhiệt độ(0C) pH Cao nấm men(%) Mức yếu tố x1 x2 x3 Mức trên(+) 50 8 5 Mức dưới(-) 25 4 1 Mức gốc(0) 35.25 6 3 Điểm sao(+) 55.5 8.4 5.6 Điểm sao(-) 19.5 3.6 0.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm được thiết lập bằng tổ hợp 8 thí nghiệm khác nhau hoàn toàn của ba yếu tố (nhiệt độ, pH, cao nấm men(%)) ở mức trên, mức dưới. Sáu thí nghiệm tiếp theo được thực hiện ở cánh tay đòn  trên và dưới với các yếu tố còn lại được thực hiện ở tâm. Một thí nghiệm còn lại được thực hiện ở tâm phương án của cả ba yếu tố. Bố trí thí nghiệm được tóm tắt theo bảng 2.3. Bảng 2.3: Ma trận thực nghiệm Biến mã hoá Thí nghiệm song song Thí nghiệm x1 x2 x3 Y1 Y2 1 + + + 2 - + + 3 + - + 4 - - + 5 + + - 6 - + - 7 + - - 8 - - - 9 + 0 0 10 - 0 0 11 0 + 0 12 0 - 0 13 0 0 + 14 0 0 - 15 0 0 0 Hàm đáp ứng được chọn là sản lượng pectinase (Y, UI/g CT) . Mô hình hóa được biểu diễn bằng phương trình bậc hai: Y= b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b11x12 + b22 x22 + b33x32 + b12x1x2 + b23x2x3 + b13x1x3 Trong đó b1, b2, b3 là các hệ số bậc 1, b11, b22, b33 là các hệ số bậc 2, b12, b23, b13 là các hệ số tương tác giữa các cặp yếu tố; x1, x2, x3, x11, x22, x33, x12, x23, x13 là các biến độc lập. Số liệu được phân tích theo chương trình Data Analysis của Microsoft Office Excel. Kết quả sản lượng pectinase thực nghiệm, sản lượng pectinase suy ra từ mô hình tính toán, mô hình và các giá trị tương quan giữa mô hình và thực nghiệm được trình bày trong chương III. 2.3.10. Khảo sát một vài đặc điểm pectinase của chủng Bacillus được chọn 2.3.10.1. pH hoạt động tối ưu Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở môi trường bán rắn theo kết quả của các thí nghiệm trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kiện: - Nhiệt độ 370 C - Nồng độ cơ chất: 1% - Thời gian phản ứng: 60 phút - pH: 5,6,7,8,9,10,11 Đo hoạt độ enzym, vẽ đồ thị, xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase của chủng Bacillus nghiên cứu. 2.3.10.2. Nồng độ cơ chất tối ưu Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở môi trường bán rắn theo kết quả của các thí nghiệm trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kiện: - Thời gian phản ứng: 60 phút - Nhiệt độ: 370C - pH : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.1 - Nồng độ cơ chất: 0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; 3%; 3,5%; 4% Đo hoạt độ enzym, vẽ đồ thị, xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase của chủng Bacillus nghiên cứu. 2.3.10.3. Nhiệt độ hoạt động tối ưu Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở môi trường bán rắn theo kết quả của các thí nghiệm trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kiện: - Thời gian phản ứng: 60 phút - Nhiệt độ: 30 oC,35 oC,40 oC,45 oC,50 oC,55 oC,60 oC,65 oC,70 oC - pH : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.1 - Nồng độ cơ chất : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.2 Đo hoạt độ enzym, vẽ đồ thị, xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase của chủng Bacillus nghiên cứu. 2.3.10.4. Thời gian hoạt động tối ưu Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở môi trường bán rắn theo kết quả của các thí nghiệm trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kiện: - Thời gian phản ứng: 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút, 70 phút, 80 phút, 90 phút - Nhiệt độ: theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.3. - pH : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.1 - Nồng độ cơ chất : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.2 Đo hoạt độ enzym, vẽ đồ thị, xác định thời gian phản ứng tối ưu của enzym pectinase của chủng Bacillus nghiên cứu. 2.3.10.5. Ảnh hưởng của ion kim loại Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở môi trường bán rắn theo kết quả của các thí nghiệm trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kiện: - Thời gian phản ứng: 60 phút - Nhiệt độ: theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.3 - pH : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.1 - Nồng độ cơ chất : theo kết quả thí nghiệm 2.3.10.2 - Bổ sung một số ion kim loại: Mg2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+ (nồng độ 0.1mmol/l) vào dung dịch enzym thô Đo hoạt độ enzym, so sánh với hoạt độ enzym trong điều kiện không bổ sung ion kim loại. 2.3.11. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym từ dịch chiết enzym[3] Tủa dịch chiết enzym vừa thu được bằng cồn 960 theo tỉ lệ 1:3 (thể tích dịch chiết enzym/ thể tích cồn 960, giữ lạnh trong 15 phút, sau đó li tâm hỗn hợp trên. Thu nhận chế phẩm enzym lắng ở đáy ống li tâm và sấy khô ở 400 C trong điều kiện có quạt gió . Bảo quản chế phẩm enzym trong lọ thủy tinh ở 40 C 05 10 15 20 25 30 35 đường kính vòng phân giải(mm) Ba1 Bl2 Bs1 Bs2 Bs3 Bs4 Chủng Bacillus Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KÍNH VÒNG PHÂN GIẢI ENZYM PECTINASE CỦA SÁU CHỦNG BACILLUS Tiến hành thí nghiệm theo phần 2, mục 2.3.2, kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Đường kính trung bình vòng phân giải của enzym pectinase ở sáu chủng Bacillus Kí hiệu Tên chủng Đường kính vòng phân giải (d: mm) Ba1 Bacillus aureus 18 Bl2 Bacillus licheniformis 31 Bs1 Bacillus stearothermophilus 15 Bs2 Bacillus subtilis 29 Bs3 Bacillus subtilis 20 Bs4 Bacillus subtilis 32 Biểu đồ 3.1: Đường kính trung bình vòng phân giải(d) của enzym pectinase ở ở sáu chủng Bacillus trên môi trường cảm ứng ( theo số liệu bảng 3.1) Kết quả cho thấy cả 6 chủng Bacillus trên đều có khả năng phân giải pectin. Trong đó, 2 chủng Bs4 và Bl2 có khả năng tổng hợp enzym pectinase cao hơn cả. Chúng tôi quyết định chọn 2 chủng này làm các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PECTIN TRONG CÁC NGUYÊN LIỆU SỬ DỤNG LÀM CƠ CHẤT CẢM ỨNG 3.2.1. Hàm lượng pectin trong cà rốt Cà rốt tươi rửa sạch, bỏ cuống. cân 20g cà rốt, giã nhỏ, chiết pectin và xác định hàm lượng pectin theo phương pháp ghi ở mục 2.3.6. Dựa vào công thức xác định hàm lượng pectin trong nguyên liệu ở mục 2.3.6, chúng tôi được kết quả trình bày trong bảng 3.2. Bảng 3.2: Hàm lượng pectin trong cà rốt 3.2.2. Hàm lượng pectin trong vỏ bưởi Loại bưởi sử dụng là bưởi năm roi. Gọt bỏ phần xanh có chứa tinh dầu bên ngoài, chỉ sử dụng phần thịt trắng của vỏ bưởi. Cân 20g vỏ bưởi, giã nhỏ, chiết pectin và xác định hàm lượng pectin trong nguyên liệu ở mục 2.3.6, chúng tôi được kết quả trình bày trong bảng 3.3 Bảng 3.3: Hàm lượng pectin trong vỏ bưởi Mẫu Trọng lượng giấy lọc(g) Trọng lượng giấy lọc và kết tủa(g) Trọng lượng kết tủa(g) Hàm lượng pectin(%) 1 0,8135 0,8749 0,0614 2,82 2 0,8124 0,8745 0,0621 2,86 3 0,8111 0,8707 0,0596 2,74 Hàm lượng pectin trung bình trong vỏ bưởi (%) 2,81 3.3. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PECTINASE TRONG CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY BACILLUS CÓ CHẤT CẢM ỨNG KHÁC NHAU Sử dụng hai chủng Bacillus: Bs4 và Bl2 để tiến hành nuôi cấy trên môi trường bán rắn có bổ sung các cơ chất cảm ứng khác nhau, đo hoạt độ enzym pectinase, chọn cơ chất cảm ứng tốt nhất cho sự sinh tổng hợp pectinase. 3.3.1. Xác định hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy chủng hai Bacillus không có cơ chất cảm ứng và có cơ chất cảm ứng là pectin. Chúng tôi sử dụng Citrus pectin của hãng JI-Degussa-Huls (Pháp) làm chất cảm ứng. Quá trình nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bacillus là Bs4 và Bl2 được thực hiện trên môi trường bán rắn không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng là pectin theo mục 2.3.3 trong 48h, quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Dựa vào công thức xác định hoạt độ ở mục 2.3.5, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.4 và đồ thị 3.1. Bảng 3.4: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng là pectin Mẫu Trọng lượng giấy lọc(g) Trọng lượng giấy lọc và kết tủa(g) Trọng lượng kết tủa(g) Hàm lượng pectin(%) 1 0,8118 0,8389 0,0271 1,25 2 0,8124 0,8391 0,0267 1,23 3 0,8155 0,8423 0,0268 1,23 Hàm lượng pectin trung bình trong cà rốt(%) 1,24 Chủng Bacillus Cơ chất cảm ứng (%) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase(UI/gCT) Không có 0,041 0,135 0,094 26,093 Pectin 1 0,048 0,339 0,291 80,870 Pectin 2 0,051 0,434 0,383 106,223 Pectin 3 0,053 0,518 0,465 129,170 Pectin 4 0,052 0,492 0,440 122,230 Bs4 Pectin 5 0,051 0,406 0,355 98,450 Không có 0,043 0,156 0,113 31,367 Pectin 1 0,051 0,324 0,273 75,688 Pectin 2 0,052 0,458 0,406 112,607 Pectin 3 0,054 0,584 0,530 147,120 Pectin 4 0,051 0,502 0,451 125,283 Bl2 Pectin 5 0,048 0,423 0,375 104,094 Đồ thị 3.1: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng là pectin. Nhận xét: Trong môi trường không có chất cảm ứng (môi trường bán rắn cơ bản), 2 chủng Bacillus vẫn có khả năng sinh tổng hợp enzym với hoạt độ là Bacillus licheniformic(Bl2): 31,367 (UI/g CT) và Bacillus subtilis(Bs4): 28,093 (UI/g CT). Trong m