Luận văn Nghiên cứu tác dụng hạ glucose và lipid máu của dịch chiết vỏ quả măng cụt (garcinia mangostana l.)

hợp chất tự nhiên để điều trị căn bệnh béo phì và đái tháo đường ngày càng phát triển trên thế giới. Trong những năm gần đây, nhiều công trình khoa học đã tập trung nghiên cứu tác dụng của những hợp chất tự nhiên có từ cây cỏ trong các bài thuốc cổ truyền Phương Đông, Châu Phi và Nam Mỹ lên sự trao đổi lipid, glucid, trên các mô hình động vật gây béo phì và đái tháo đường thực nghiệm [42]. Trong những năm gần đây nhiều dược phẩm từ thực vật đã được sử dụng để điều trị chống béo phì và đái tháo đường dưới dạng các thực phẩm chức năng và cơ chế của nó đã được làm sáng tỏ một phần. Tuy nhiên, để sử dụng các hợp chất tự nhiên từ thảo dược và từ các bài thuốc cổ truyền thay thế một phần hoặc toàn bộ các chế phẩm thuốc tổng hợ hóa học trong điều trị các bệnh rối loạn trao đổi chất, các bệnh ung thư, tim mạch và các bệnh rối loạn miễn dịch, chúng ta cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý, hóa sinh của các bài thuốc này. Nhìn chung cơ chế hạ lipid và glucose huyết của các dược phẩm đều tập trung vào các đích sau: * Ức chế quá trình phân giải glycogen và ức chế quá trình tân tạo glucose thông qua tác động lên các enzyme: glycogen phosphorylase, glucose – 6 – phosphatase, pyruvat carboxylase, * Tăng cường thoái hóa lipid ở một số cơ quan nhờ các hợp chất trong chè đen, cà phê và trong dịch chiết vỏ cam chanh. * Hoạt hóa các enzyme phân giải của quá trình đường phân: glucokinase/hexokinase. * Hoạt hóa thụ thể insulin thông qua cơ chế tăng cường phosphoryl hóa thụ thể. * Kích thích hoặc ức chế sự biểu hiện gen của các enzyme. * Giảm béo phì và lipid máu, đặc biệt là các acid béo tự do cũng là một đích để giảm kháng insulin. 1.5. Ức chế enzyme alpha-glucosidase [44] 1.5.1.Enzyme alpha-glucosidase: Enzym α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase nhóm enzym xúc tác các phản ứng thủy phân. Tinh bột Maltose (Glucose + Glucose) Amylase Glucose Glucose Saccharose (Glucose - Fructose) Glucose Fructose α-glucosidase Glucose huyết tăng Chất ức chế Chất ức chế Chúng ta biết rằng carbohydrat chứa trong thức ăn là nguồn cung ứng lớn chất đường vào cơ thể.  Trước khi các phân tử đường được tỏa ra nuôi các tế bào cơ thể, thì những carbohydrat được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzym trong ruột non. Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng (pancreas) phải tiết ra α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid.  Màng tế bào ruột non lại tiết ra α-glucosidase để tiếp tục phân hoá các oligosaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu.  Bằng cách kiềm chế sự hoạt động của enzym α-glucosidase, có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào mạch máu. 1.5.2. Phương pháp nghiên cứu ức chế enzym α-glucosidase Phương pháp nghiên cứu ức chế ezym α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường typ 2 là phương pháp được ưu tiên sử dụng vì có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy như các phương pháp khác. Phương pháp nghiên cứu in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của một số hợp chất thiên nhiên dựa trên nguyên tắc: Enzym α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucopyranosyl sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose. Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid, dưới tác dụng của enzym α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol. p-Nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 400nm. Từ đó xác định được lượng D-glucose sinh ra. Khi sử dụng chất ức chế α-glucosidase sẽ làm cho phản ứng của enzym bị ngừng lại, không tạo ra được sản phẩm D-glucose. 1.6. Vài nét về cây măng cụt 1.6.1. Đặc điểm thực vật học và phân bố hình thái Măng cụt (Garcinia mangostana L.), họ Bứa (Clusiaceae) là loài cây nhiệt đới ăn quả được. Cây to, cao từ 7 – 25 m, lá dày, dai, màu lục sẫm, hình thuôn dài. Hoa đực cụm 3 – 9 hoa có lá bắc. Hoa lưỡng tính có cuống, có đốt. Quả hình cầu, to trung bình, khi chín có vỏ ngoài dày cứng, màu đỏ tím đậm, trong đỏ tươi như rượu vang, dày xốp, phía dưới có lá đài, phía đỉnh có đầu nhụy. Trong quả có từ 6 – 18 hạt, quanh hạt có áo hạt trắng ngà. Cây măng cụt có nguồn gốc Mã Lai, Nam Dương, từ Malaca qua Moluku. Ngày nay bắt gặp ở Ấn Độ, khắp Đông Nam Á: Myanma, Sri Lanka, Philipines,Ở Việt Nam, măng cụt được trồng nhiều ở các tỉnh miền Nam: Tây Ninh, Gia Định, Vĩnh Long, Thủ Dầu Một,nơi đây có khí hậu nóng ẩm nên cây dễ mọc, vì nó không thể tiến lên miên Bắc xứ lạnh, xa nhất là đến Huế [7]. 1.6.2. Thành phần hóa học của vỏ quả măng cụt Vỏ quả măng cụt có thành phần chính là các xanthon, trong đó những chất chính là các mangostin, tươi, không vị, tan trong rượu, ete, chất kiềm, không tan trong nước, nhiệt nóng chảy 1750C như: a – mangostin, b – mangostin, g – mangostin, những iso mangostin, nor mangostin, trioxi xanthon, pyrano xanthon, dihydroxi methyl butenyl xanthon. Tannin chiếm 7 – 13%. Một lượng nhỏ các chất: garcinon A, B, C, D, E; mangostin; garcimangoson A, B, C; gartanin; egonol; epicatechin; procyanidin được tìm ra từ măng cụt có nguồn gốc Việt Nam. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất trên phần lớn đã được nghiên cứu nhưng chưa có tài liệu nào nghiên cứu về hoạt tính chống béo phì và đái tháo đường của chúng. 1.6.3. Tính năng và công dụng của vỏ quả măng cụt Theo đông y, vỏ quả măng cụt có vị chua, chát, tính bình, đi vào hai kinh phế và đại tràng, có công năng thu liễn, sáp trường, chi huyết, dùng điều trị tiêu chảy, ngộ độc chất ăn, khi bệnh thuyên giảm thì thôi, dùng lâu sinh táo bón. Có tác dụng trị tiểu đường, nước sắc vỏ quả măng cụt chữa lỵ, đau bụng, đi tiêu chảy, bệnh da vàng. Những khảo cứu mới cho biết những tính chất của vỏ quả măng cụt như: chống oxi hóa, ức chế hoạt động sản xuất acid của vi khuẩn Streptococcus muntans GS – 5. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu thực vật Quả măng cụt Garcinia mangostana, L. thuộc họ Măng cụt (Chisiaceae) được thu mua tại Hà Nội vào tháng 5 năm 2010 đã được Tiến sĩ phân loại Thực vật Trần Văn Ơn thẩm định tên khoa học tại đại học Dược Hà nội. Quả được đem rửa sạch, tách lấy phần vỏ tươi, bảo quản trong ethanol 900. Hình 2. Quả và vỏ cây Măng cụt Hình 1. Cây Măng cụt 2.1.2. Mẫu động vật Chuột nhắt trắng chủng Swiss 4 tuần tuổi có thể trọng 14 – 15 g và thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 22 ± 20C với chu kỳ sáng 21 giờ và tối 21 giờ. Các thức ăn béo cao đã được phối trộn theo tài liệu của Srinivasan [41], Bhavana [19] từ thực phẩm Việt Nam có phẩm chất, thành phần chất xác định dinh dưỡng theo tài liệu của Viện dinh dưỡng Quốc gia. 2.2. Dụng cụ và hóa chất 2.2.1. Dụng cụ - Dụng cụ: phễu chiết, bình tam giác, ống nghiệm, giấy lọc, phễu lọc, Pipette 5ml, 10ml;Micropipette 100-1000μl và các dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm. - Thiết bị: máy cô quay chân không, tủ sấy, bếp điện từ, máy phân tích các thành phần lipid và glucose huyết AU 640 (Olympus) – 7213261, sản xuất tại Nhật Bản,và các thiết bị khác có liên quan. 2.2.2. Hóa chất - Dung môi tách chiết: ethanol 900, ethanol, điclometan, n-hexan, - STZ (streptozotocin) – hóa chất gây đái tháo đường. - Metformin (Merck) - một loại thuốc chữa béo phì và ĐTĐ. - Nước muối sinh lý NaCl 0,9% - Dung dịch p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G Sigma) (pha trong nước khử ion). - α-glucosidase (α-Glc) 17% protein, 194 U/mg protein (G0660 Sigma), (pha trong nước khử ion lạnh). - Đệm phosphate pH = 6.82 - Đệm natri carbonate pH = 9.62 - Cao chiết (pha trong nước khử ion hoặc dung môi hữu cơ thích hợp). - Nước khử ion. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Xử lý mẫu Vỏ quả Măng cụt tươi ngâm chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong 4 tuần. Sau đó, thu dịch chiết lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cao ethanol. Cao ethanol được hòa tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi điclometan, n-hexan và etylacetat thu được các dịch chiết, sau đó cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cao chiết tương ứng. 2.3.2. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong vỏ quả măng cụt 2.3.2.1. Định tính flavonoids [16, 24] Mẫu thử được pha trong Ethanol với một lượng thích hợp, thêm vài giọt HCl đặc. - Phản ứng Shinoda: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam. - Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron. - Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính . 2.3.2.2. Định tính tannins Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng: - Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm. - Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục. - Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa. 2.3.2.3. Định tính các polyphenols khác - Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử được pha như trên. Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam. - Phản ứng với FeCl3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen. 2.3.2.4. Định tính glycoside Phản ứng Keller-Killian: Thuốc thử Keller-Killian: Dung dịch A: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid acetic 10%. Dung dịch B: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid sunfuric đặc. Phương pháp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng. 2.3.2.5. Định tính alkaloids Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng. - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu nâu sẫm. - Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong nước): phản ứng cho kết tủa màu trắng ánh vàng. - Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ. 2.3.3. Định lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết vỏ Măng cụt [40] * Phương pháp: Định lượng hợp chất phenolics tổng số của dịch chiết ban đầu theo phương pháp Folin-Ciocalteau. * Nguyên tắc: Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc các hợp chất phenolics trong dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin - Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam, đo độ hấp thụ ở bước sóng 765 nm, lấy acid gallic làm chất chuẩn. * Chuẩn bị: - Cân 10mg mỗi loại cao và hòa loãng trong 1ml ethanol 90% - Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi, thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24h đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml. - Dung dịch axit gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh - Chuẩn bị 6 bình định mức 100 ml, sau đó cho vào mỗi bình 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml acid gallic chuẩn, sau đó dẫn nước cất tới 100 ml sẽ thu được dung dịch acid gallic các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/l. Dựng đường chuẩn axit gallic. * Tiến hành: - Cho vào mỗi cuvet định lượng 20ml mẫu thử + 1,58ml H2O + 100ml thuốc thử Folin – Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300ml Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch trong 2h ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn. Bảng 1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic: STT Gallic acid (mg/l) OD765nm 1 0 0,009 2 50 0,062 3 100 0,119 4 150 0,168 5 250 0,265 6 500 0,519 y = 0,001x + 0,0218 2.3.4. Phương pháp tạo mô hình chuột béo phì và đái tháo đường [19,31,41,43] 2.3.4.1. Phân nhóm động vật thí nghiệm Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng thuần chủng dùng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh được cân từng con, đánh dấu, phân lô ngẫu nhiên trước khi thí nghiệm. Chuột được chia làm 11 lô, mỗi lô gồm 6 con. a) Tạo mô hình chuột béo phì Lô nuôi thường (lô 1): Cho ăn chế độ bình thường (thức ăn chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW). Các lô còn lại (lô 2 đến lô 11): Cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần được trộn từ nhiều loại thức ăn khác nhau như: ngô, sữa bột, đậu tương, lòng đỏ trứng, lạc, mỡ nước Thời gian nuôi chuột theo 2 chế độ ăn là 4 tuần. Bảng 2. Thành phần thức ăn giàu lipid Thành phần Tỉ lệ % Hydratcacbon 40 Lipid 32 Protein 20 Cholesterol 2 Chất khoáng 4 Vitamin & axit amin 2 Thành phần thức ăn được tính toán dựa trên thành phần dưỡng chất của từng loại hỗn hợp thức ăn phối trộn, theo tài liệu chuẩn của Viện dinh dưỡng Quốc gia Việt nam và theo các tài liệu tham khảo [19, 41, 43] Sau 4 tuần nuôi, tiến hành cân trọng lượng và xét nghiệm một số chỉ số hoá sinh như: glucose máu, lipid máu gồm Cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL để xác định mức độ khác nhau của các lô theo hai chế độ ăn. b) Gây ĐTĐ typ 2 từ chuột béo phì thực nghiệm bằng streptozotocin (STZ) liều thấp. Sau khi chuột được nuôi béo phì thực nghiệm thành công chúng tôi tiếp tục tiến hành gây ĐTĐ typ 2 bằng STZ liều thấp. Trước khi thí nghiệm cho chuột nhịn đói 16h, tiêm màng bụng STZ gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm nhằm tạo mô hình ĐTĐ typ 2 phát triển từ béo phì. Sau đó chuột được tiếp nhận thức ăn bình thường. Sau 2 – 3 ngày chúng tôi tiến hành phân lô để nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả măng cụt. c) Phân lô chuột thí nghiệm Sau khi đã tạo được chuột béo phì và chuột ĐTĐ typ 2 chúng tôi tiến hành phân lô chuột thí nghiệm như sau : Lô 1: Chuột bình thường, uống nước muối sinh lý NaCl 0,9% (lô đối chứng âm) Lô 2: Chuột béo phì, không điều trị (lô đối chứng dương) Lô 3: Chuột béo phì điều trị bằng thuốc Metformin Lô 4: Chuột béo phì, điều trị bằng cao ethanol Lô 5: Chuột béo phì, điều trị bằng cao etylacetat Lô 6: Chuột béo phì, điều trị bằng cao n-hexan Lô 7: Chuột ĐTĐ typ 2, không điều trị Lô 8: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng thuốc Metformin Lô 9: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng cao ethanol Lô 10: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng cao etylacetat Lô 11: Chuột ĐTĐ typ 2, điều trị bằng cao n-hexan Thời gian điều trị bằng các cao phân đoạn dịch chiết ethanol, etylacetat, n-hexan và metformin là 21 ngày. 2.3.4.2. Thử độc tính cấp xác định LD50 bằng đường uống [32] Xác định LD50 của dịch chiết vỏ quả măng cụt theo đường uống là xác định liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm. Chuột bình thường được nhịn đói trước 16h thí nghiệm (phân lô ngẫu nhiên N = 10) và được cho uống theo liều tăng dần từ 5000 đến 8000 mg/kg thể trọng (liều tối đa cho phép), theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết vỏ quả măng cụt. 2.3.4.3. Pha thuốc và hóa chất thí nghiệm 1. Dung dịch NaCl 0,9% 2. Metformin (500mg/kg) 3. Cao dịch chiết phân đoạn (2000mg/kg) 4. Streptozotocin (STZ) (110 mg/kg) 5. Thức ăn có hàm lượng béo cao 2.3.4.4. Tiến hành thí nghiệm Trong quá trình thí nghiệm, các lô chuột đều được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm của Trung tâm Kiểm nghiệm Bắc Giang. Chuột được cho ăn thức ăn tổng hợp, thức ăn có hàm lượng béo cao và uống nước đun sôi để nguội. Các lô chuột được nuôi trong các lồng riêng biệt để tránh lây chéo có thể xảy ra qua đường hô hấp và tiếp xúc. Hàng ngày theo dõi, ghi chép diễn biến, kết quả thí nghiệm. Chuột được cho uống vào các buổi sáng vào giờ nhất định. Thời gian nuôi béo trong 28 ngày và thời gian điều trị trong 21 ngày. 2.3.4.5. Theo dõi thí nghiệm Để thí tiến hành thí nghiệm đạt kết quả như mục tiêu đề ra, chúng tôi theo dõi chặt chẽ các bước thí nghiệm, cụ thể như: Quan sát tình trạng ăn uống, bài tiết, vận động,... Sau 3 ngày cân lại một lần. 2.3.4.6. Tiến hành lấy mẫu thử nghiệm sau khi kết thúc đợt thí nghiệm Cho chuột nhịn ăn trước 24 giờ khi lấy mẫu. Giết chuột bằng cách cắt đầu nhanh để thu máu. Máu được xác định các chỉ số: Glucose Cholesterol, Triglycerid, HDLC, LDLC, GOT và GPT. Đây là những chỉ số đáng tin cậy để đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn vỏ quả măng cụt. 2.3.5. Phương pháp xác định một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột trước và sau khi điều trị bằng bằng dịch chiết trên máy phân tích tự động OLYMPUS AU 640 2.3.5.1. Định lượng glucose huyết theo giai đoạn thực nghiệm * Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kit thử với glucose trong máu tạo thành axit gluconic và H2O2 (phản ứng 1). H2O2 tạo thành được peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hoá O-Dianisidin tạo phức chất mầu vàng nâu (phản ứng 2). Glucose + O2 glucose oxidase axit gluconic + H2O2 (1) O-Dianisidin + H2O2 phức hợp nâu vàng + H2O (2) Cường độ mầu được xác định theo phương pháp đo quang (l = 500nm) tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng. * Mẫu máu: Máu toàn phần lấy một giọt từ đuôi chuột. Định lượng glucose máu bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít thử tương ứng (One Touch Ultra, Johnson & Johnson, USA). 2.3.5.2. Định lượng Triglycerid huyết thanh * Nguyên lý: Thuỷ phân Triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4-aminoantipyryl và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau: Triglycerid Glycerol + acid béo Glycerol + ATP Glycerol–3–phosphate + ADP Glycerol–3–phosphate +O2 Dihydroxyacetone phosphate + H2O2 H2O2 + Aminoantipyrine + 4-chlorophenol Quinonimin + 4HCl + 4H2O * Tính kết quả: Đo mật độ quang học Quinonimin ở bước sóng 546 nm rồi so với chuẩn của bộ KIT của hãng thương mại. 2.3.5.3. Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh * Nguyên lý: Thuỷ phân Cholesterol este bằng enzyme Cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng Cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxidase. Các phản ứng: Cholesterol este + H2O Cholesterol + acid béo Cholesterol + O2 Cholesterol–3– one + H2O2 2H2O2 + 4 – aminophenazone + phenol Quinonimin + H2O * Tính kết quả : So mật độ quang của Quinonimin với ống chuẩn 2.3.5.4. Kết quả thử hoạt tính α-glucosidase in vitro * Nguyên tắc: Chúng ta biết rằng, α-glucosidase được tiết ra từ ruột non giúp chuyển hóa các phân tử đường oligosacaride thành những phân tử glucose. Do đó, để khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase bằng cách sử dụng cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) như là cơ chất ban đầu và bị α-glucosidase thủy phân sinh ra α-D-glucose và p-nitrophenol (PNP). Dựa vào lượng p-nitrophenol sinh ra, tiến hành đo quang tại bước sóng 400nm. 1 unit (hay 1 U) của enzym α-glucosidase được định nghĩa như là lượng enzym giải phóng 1.0 μmol của PNP-G tại điều kiện phân tích xác định. α-glucosidase p-nitrophenol α-D-glucose p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) Khi mẫu có chất hoạt tính ức chế α-glucosidase (chẳng hạn dịch chiết thực vật) thì hàm lượng của p-nitrophenol tạo thành sẽ giảm. Hàm lượng p-nitrophenol tạo thành trong dung dịch được xác định bằng phương pháp trắc quang hấp thu tại bước sóng là 400nm. Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP. Vì vậy có thể đo độ hấp thu của PNP ở bước sóng 400nm để xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50 (là nồng độ ức chế 50%). Cách tính IC50 Khả năng ức chế α-glucosidase được tính dựa trên phần trăm ức chế (I %). Phần trăm ức chế (I %) được xác định theo công thức: Ao - As I (%) = Ao *100% Với: Ao: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có hoạt chất ức chế. As: Giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu có hoạt chất ức chế. IC50 được định nghĩa là nồng độ của một mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% enzym α-glucosidase. Giá trị IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế (mạnh hay yếu) của hoạt chất. Mẫu có hoạt tính ức chế ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Từ giá trị I%, ta tính được giá trị IC50  Phương pháp tiến hành Trộn lẫn các dung dịch gồm: đệm pH = 6.8, enzym α-glucosidase, chất ức chế với thể tích đã định trước. Tiến hành ống nghiệm đối chứng: đệm pH = 6.8, enzym và dung dịch mẫu trắng cùng thể tích, không chứa chất ức chế. Hoạt hóa hỗn hợp ở 370C trong thời gian 30 phút. Thêm cơ chất PNP-G, duy trì phản ứng ở 370C, lắc đều, trong thời gian 20 phút. Kết thúc phản ứng bằng đệm pH = 9.6 Đo độ hấp thu A ở λ = 400nm, từ đó xác định % ức chế (%I) và suy ra chỉ số IC50 Chuẩn bị mẫu thử: - Điều kiện phản ứng: T = 370C, pH = 6.8, nồng độ enzym 0.031U/ml, nồng độ cơ chất PNP-G 0.085mM. - Chuẩn bị các mẫu ức chế có nồng độ 2.95mg/ml tương ứng với nồng độ 100μg/ml trong hỗn hợp phản ứng. Pha loãng để có các nồng độ 75, 50, 25, 5 μg/ml. Thực hiện đối với mỗi nồng độ (Ci) của từng mẫu thử theo bảng sau: Bảng 3 : Quy trình của một mẫu thử hoạt tính CÁC CHẤT THỂ TÍCH (ml) Mẫu trắng Mẫu ức chế Mẫu không ức chế Nước khử ion 0.2 0 0.2 Đệm phosphate pH=6.82 5.0 5.0 5.0 Enzym 0 0.2 0.2 Chất ức chế có nồng độ Ci (dịch chiết thực vật) 0.2 0.2 0 Ủ ở 370C trong 30 phút PNP-G 0.5 0.5 0.5 Lắc đều, ủ ở 370C trong 20 phút Lấy 2ml mỗi hỗn hợp cho vào ống nghiệm có sẵn 8ml đệm pH = 9.62, lắc đều Đo độ hấp thu ở 400nm trên máy quang phổ UV-Vis và tính theo công thức I (%) 2.3.6. Xác suất thống kê toán học xử lí số liệu: Sử dụng chương trình Microsoft Office – Excell: Nạp các số liệu, dùng hàm AVERAGE để tính giá trị trung bình và hàm VAR để tính sai số, vẽ biểu đồ, lập các bảng biểu . CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quy trình chiết, tách các phân đoạn từ vỏ quả măng cụt Để tìm hiểu thành phần hóa học của vỏ quả măng cụt, chúng tôi tiến hành chiết các hợp chất trong vỏ quả măng cụt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: ethanol, điclometan, n-hexan và etylacetat. Quy trình được trình bày trên hình 3 Vỏ quả măng cụt tươi (2000 g) Cao ethanol (387 g) Lớp nước Cao điclometan (8 g) Lớp nước Cao etylacetat (48 g) Bổ sung nước, điclometan Chiết ethanol (3 lần) Bổ sung n-hexan Lớp nước (105 g) Cao n-hexan (25 g) Bổ sung etylacetat Hình 3. Quy trình tách, chiết phân đoạn vỏ quả măng cụt tươi Từ sơ đồ quy trình tách chiết trên, chúng ta thấy được hiệu suất tách chiết các phân đoạn từ vỏ quả măng cụt như sau: Bảng 4. Hiệu suất tách chiết các phân đoạn từ vỏ quả măng cụt Phân đoạn Khối lượng (g) Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô) Vỏ măng cụt tươi 2000 Cao ethanol 387 19,35% Cao điclometan 8 0,40% Cao n-hexan 25 1,25% Cao etylacetat 48 2,40% Cao nước 105 5,25% Kết quả này cho thấy trong vỏ quả măng cụt có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên. Phương pháp tách chiết này giúp tách chiết các chất có độ phân cực từ thấp đến cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân lập các hợp chất sau này. Tiếp theo chúng tôi tiến hành chạy sắc kí lớp mỏng trên hệ dung môi: Toluen:Etylacetat:Aceton:Axit formic = 5 : 3 : 1 : 1. Bản mỏng được được phun bằng hơi H2SO4 và soi trên máy soi UV ở bước sóng 365 nm. Kết quả thu được thể hiện ở sắc kí đồ hình 4. 4 3 2 1 Hình 4. Sắc kí đồ của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả măng cụt 1-Phân đoạn ethanol; 2-Phân đoạn ethylacetat; 3-Phân đoạn n-hexan; 4-Phân đoạn điclometan 3.2. Định tính sơ bộ thành phần phần hóa học của dịch chiết Bằng cách sử dụng các phản ứng đặc trưng để khảo sát thành phần hóa học của dịch chiết từ vỏ quả măng cụt. Chúng tôi thu được kết quả như ở bảng 5: Bảng 5. Kết quả thử định tính của các lớp chất của dịch chiết từ vỏ quả măng cụt Nhóm chất Phản ứng đặc trưng Phân đoạn dịch chiết vỏ quả măng cụt Ethanol Điclometan n-hexan Etylacetat Polyphenol Flavonoid Shinoda ++ +++ ++ - Diazo - - - - H2SO4 ++ ++ - +++ NaOH10% +++ +++ +++ +++ Catechin Vanilin1% NaCl +++ +++ +++ +++ Tannin Vanilin- H2SO4 +++ +++ +++ +++ Gelatin/NaCl +++ ++ +++ - FeCl3 +++