Luận văn Nghiên cứu tần suất alen của một số locus gen ở người Việt

hệ thống CODIS và 2 locus đặc trưng bổ sung: D2S1338 và D19S433) [41]. Bộ kit phân tích sử dụng kỹ thuật huỳnh quang 5 màu, tương thích hoàn toàn với phần mềm phân tích STR chuyên dụng GeneMapper ID, đồng thời có thể tự động hóa toàn bộ quá trình từ chuẩn bị mẫu đến phân tích kết quả vì vậy cho kết quả phân tích chính xác và nhanh hơn rất nhiều so với các phương pháp khác. Ở Việt Nam, các trung tâm xét nghiệm hàng đầu như Học viện Quân Y, Viện Khoa học Hình sự cũng đã và đang sử dụng bộ kit này phục vụ công tác giám định gen, nhận dạng pháp y. Viện Khoa học Hình sự cũng đang bắt đầu triển khai hệ thống robot tách chiết tự động (3 hệ thống robot của hãng Tecan – Thụy Sỹ) kết hợp với sử dụng bộ kit Identifiler nhằm nâng cao hiệu quả giám định gen pháp y. Hình 1.4. Bộ kit thương mại Identifiler của hãng Applied Biosystems Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 30 Một bộ AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (200 phản ứng) bao gồm: - AmpFlSTR PCR Reaction Mix: gồm có 2 ống MgCl2, deoxynucleotide triphosphates, và bovine serum albumin in buffer with 0.05% sodium azide, dung tích: 1.1 ml/tube - AmpFlSTR Identifiler™ Primer Set: Bộ primer chuẩn gồm 01 ống dung tích 1.1 ml chứa các primer gắn huỳnh quang và các primer không gắn huỳnh quang (fluorescently labeled primers and non-labeled primers). - AmpliTaq Gold DNA Polymerase: Enzyme sử dụng nhân bộ DNA trong bộ kit là 02 lọ AmpliTaq Gold DNA Polymerase với nồng độ 5 U/µl, thể tích: 50 µL/lọ - AmpFlSTR Control DNA 9947A: 01 ống chứa 0.10 ng/µl human female cell line DNA in 0.05% sodium azide and buffer , 0.3 ml - AmpFlSTR Identifiler™ Allelic Ladder: Bộ thang DNA chuẩn gồm 01 ống dung tích 50µl chứa AmpFlSTR Identifiler Allelic Ladder của các amplified alleles. Bảng 1.3. Vị trí các locus trên NST và Dye label tương ứng [25] Locus Vị trí trên NST Genbank Dye label CSF1PO 5q33.1 c-fms proto-oncogene, 6th intron X14720 6-FAM D8S1179 8q24.13 G08710 D21S11 21q21.1 AP000433 D7S820 7q21.11 G08616 D3S1358 3p21.31 NT_005997 VIC TH01 11p15.5 Tyrosine hydroxylase, 1st intron D00269 D13S317 13q31.1 G09017 D16S539 16q24.1 G07925 D2S1338 2q35-37.1 G08202 Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 31 D19S433 19q12-13.1 G08036 NED VWA 12p13.31 Von Willebrand Factor, 40th intron M25858 TPOX 2p25.3 Thyroid peroxidase, 10th intron M68651 D18S51 18q21.33 L18333 D5S818 5q23.2 G08446 PET FGA 4q31.3 Alpha fibrinogen, 3rd intron M64982 Amelogenin X: p22.1-22.3/ Y: p11.2 Sử dụng bộ kít AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit cho kết quả có độ chính xác rất cao, khả năng phân biệt giữa các cá thể khác nhau được thể hiện rõ như trong hình 1.5. Hình 1.5. Khả năng phân biệt của các loci trong bộ kit Identifiler Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 32 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu DNA khuôn: Chúng tôi sử dụng mẫu DNA khuôn được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như máu, tóc, mô, niêm mạc miệng của 402 đối tượng thuộc dân tộc Kinh. Trong đó có 350 mẫu máu lấy vào thẻ FTA, 10 mẫu niêm mạc miệng, 10 mẫu nước bọt, 13 mẫu móng tay, 8 mẫu tóc có chân và 21 mẫu máu tổng số (có đối tượng lấy nhiều loại mẫu). 2.1.2. Hóa chất Nhóm hóa chất dùng cho tách chiết DNA Ø Chelex® 100 Resin (Bio-rad/Mỹ) Ø PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit (P/N 4392852) Ø QIAamp DNA Investigator Kit (50) (QIAGEN – Mỹ) Ø FTA card và FTA purification kit Nhóm hóa chất dùng cho PCR Ø Đệm enzyme Taq polymerase 10X Ø MgCl2 25mM Ø dNTPs 5mM Ø Taq polymerase 5U/µl Ø Nước cất khử ion và khử trùng Nhóm hóa chất dùng cho điện di Ø Agarose Ø Đệm TBE Ø Ethidium bromide Nhóm hóa chất dùng cho phản ứng nhân gen và phân tích gen Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 33 Ø AmpFℓSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (P/N 4322288) Ø GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (P/N 4322682) Ø POP-4™ Polymer (P/N 4352755) Ø Hi-DiTM Formamide (P/N 4311320) 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị Ø Máy ly tâm (Mikro 200 – Hittich/Đức) Ø Máy PCR 9700 (ABI – Mỹ) Ø Máy PCR iCycler (Biorad – Mỹ) Ø Bộ điện di Agarose: Nguồn 300V, bể điện di (biorad – Mỹ) Ø Lò vi sóng Ø Tủ hút Ø Buồng thao tác PCR Ø Block gia nhiệt Ø Máy khuấy từ Ø Máy cất nước 2 lần Ø Máy định lượng acid nucleic: Nanodrop Ø Máy điện di mao quản: sequnencer 3130XL Dụng cụ Ø Pipet các loại Ø Ống Eppendorf các loại Ø Plate 96 giếng Ø Đầu côn các loại Ø Găng tay cao su Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu (1) Thu mẫu (máu, tóc, mô) (2) Tách chiết DNA (3) Định lượng DNA bằng máy quang phổ, Nanodrop (4) PCR nhân gen bằng bộ kít Indentifiler (5) Chạy Fragment trên máy ABI 3130XL (6) Phân tích kết quả và xử lý số liệu Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp tách chiết DNA 2.2.1.1. Phương pháp tách DNA bằng Chelex Chelex® 100 Resin có khả năng loại bỏ các chất ức chế kim loại mà không làm thay đổi nồng độ các ion không kim loại của dung dịch tinh sạch. Resin được tạo thành bởi hai polymer styrene và divinylbenzene chứa các liên kết imino vì vậy có khả năng bám các kim loại cao. Phương pháp tách DNA bằng chelex 100 đơn giản, cho hiệu quả cao và có thể áp dụng với nhiều đối tượng mẫu khác nhau. Chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết DNA bằng chelex 100 để tách DNA trên các mẫu máu thu bằng thẻ thu mẫu FTA card. Quy trình tách chiết bằng chelex 100 như sau: 1. Cắt khoảng 3x3 mm mẫu trên thẻ FTA card cho vào ống ly tâm 1,5 ml 2. Cho 1 ml nước tinh khiết đã khử ion vào ống 3. Trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 – 30 phút để rửa mẫu 4. Chuẩn bị dung dịch chelex 100 5% bằng cách pha 5 g chelex vào 100 ml nước khử ion 5. Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong khoảng 3 phút 6. Hút loại bỏ toàn bộ dịch nổi 7. Thêm 200 µl dung dịch chelex 5% vào ống đựng mẫu 8. Ủ hỗn hợp ở 56oC trong vòng 30 phút 9. Trộn bằng vortex trong 5 giây 10. Ủ hỗn hợp ở 100oC trong khoảng 8 phút 11. Trộn bằng vortex trong 5 giây Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 35 12. Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong 3 phút 13. Thu dịch nổi cho sang ống mới. 2.2.1.2. Phương pháp tách chiết bằng PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit là bộ kit chuyên dụng, dùng để tách các mẫu khó thu DNA hoặc các mẫu có hàm lượng DNA thấp như mẫu tóc, mẫu nước bọt, mẫu kẹo cao su, mẫu móng chân, móng tayMột bộ kít hoàn chỉnh (100 phản ứng) bao gồm các thành phần như sau [40, 42]: PrepFiler TM Lysis Buffer 50 ml PrepFiler TM Isopropanol Chai 60 ml PrepFiler TM Magnetic Particles 1.5 ml PrepFiler TM Wash Buffer Concentrate 2x26 ml PrepFiler TM Elution Buffer 12.5 ml PrepFiler TM Filter Columns 100 PrepFiler TM Spin Tubes 300 Hình 2.2. Bộ kít tách DNA PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit Quy trình tách chiết DNA bằng DNA PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit gồm các bước cơ bản sau: Hình 2.3. Quy trình tách chiết DNA bằng PrepFiler extraction kit Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 36 Đầu tiên các mẫu được ủ với dung dịch PrepFiler Lysis buffer để phá vỡ màng tế bào giải phóng DNA ra ngoài môi trường. Tiếp theo tiến hành loại bỏ xác tế bào và thêm hạt từ tính, isopropanol vào dung dịch. Các DNA sẽ bị tủa và bám vào hạt từ tính bằng lực hút tĩnh điện. Tiến hành rửa nhiều lần bằng PrepFiler Wash buffer, sau đó thêm PrepFiler Elution buffer để tách DNA ra khỏi hạt từ tính. Cuối cùng là bước tinh sạch và thu DNA. Tùy theo từng loại mẫu khác nhau mà chúng ta có thể tăng hoặc giảm thể tích Lysis buffer cũng như thời gian ủ thích hợp. Đối với các mẫu thông thường như mẫu máu, mẫu tócthì thời gian ủ thường từ 30 – 60 phút. Với các mẫu đặc biệt như mẫu răng, xươngthì đòi hỏi thời gian ử lâu hơn, có thể lên đến 12-18 tiếng. 2.2.1.3. Phương pháp tách chiết DNA bằng QIAamp DNA Investigator Kit Bộ QIAamp DNA Investigator kit (50 phản ứng) bao gồm [44]: QIAamp MinElute® Columns 50 Collection Tubes (2 ml) 200 Buffer ALT 50 ml Buffer AL 33 ml Buffer AW1 19 ml Buffer AW2 13 ml Buffer ATE 12 ml Carrier RNA (red cap) 310 µg Proteinase K 1.25 ml Hình 2.4. Thành phần và các bước tách DNA cơ bản của bộ QIAamp DNA Investigator kit Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 37 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu, nước bọt, tóc, móng tay: Chuẩn bị buffer AW1 và AW2 - Thêm 25 ml ethanol (96 – 100%) vào ống chứa 19 ml Buffer AW1 - Thêm 30 ml ethanol (96 – 100%) vào ống chứa 13 ml Buffer AW2 Quy trình tách chiết mẫu máu, nước bọt: 1. Hút 50 µl máu tổng số hoặc nước bọt vào ống ly tâm 1.5ml 2. Thêm 50 µl buffer ALT 3. Thêm 10 µl proteinase K 4. Thêm 100 µl buffer AL, đóng nắp và lắc nhẹ trong vòng 15 giây 5. Ủ và lắc nhẹ ở 56oC trong vòng 10 phút 6. Ly tâm nhẹ để loại bỏ dung dịch dính trên nắp ống 7. Thêm 50 µl ethanol (96-100%), đóng nắp và lắc đều trong vòng 15 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút 8. Ly tâm nhẹ để loại bỏ dung dịch dính trên nắp ống 9. Đặt ống QIAamp MinElute vào trong ống 2 ml collection tube, chuyển toàn bộ dung dịch trong ống ly tâm 1.5 ml sang ống MinElute, đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống collection đã dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection mới. 10. Cẩn thận mở nắp ống QIAamp MinElute và thêm 500 µl buffer AW1. Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống collection đã dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection mới. 11. Cẩn thận mở nắp ống QIAamp MinElute và thêm 700 µl buffer AW2. Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống collection đã dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection mới. 12. Cẩn thận mở nắp ống QIAamp MinElute và thêm 700 µl ethanol (96-100%). Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 38 collection đã dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection mới. 13. Ly tâm ở tốc độ tối đa 14000 vòng/phút trong vòng 3 phút để làm khô và loại bỏ hoàn toàn ethanol 14. Đặt ống QIAamp MinElute vào ống ly tâm 1.5 ml sạch, cẩn thận mở nắp và để ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút hoặc ủ ở 56oC trong vòng 3 phút. 15. Thêm 40 µl buffer ATE hoặc nước cất vào giữa màng của ống QIAamp MinElute 16. Đóng nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở 14000 vòng/phút trong vòng 1 phút. 2.2.1.4. Quy trình tách chiết bằng hạt từ tính Hạt từ tính có gắn Sitica tích điện (+) trên bề mặt sẽ gắn với DNA và một số thành phần tích điện (-) nên tách được DNA ra khỏi các tạp chất tích điện (+) khác. Sau khi thu được phức hợp "hạt từ tính - thành phần mang điện tích (-)”, sử dụng Wash Buffer rửa nhiều lần, để lại phức hợp "hạt từ tính - DNA". Cụ thể các bước như sau: + Bước 1: Cắt nhỏ phần chân tóc cho vào ống nghiệm. + Bước 2: Thêm Lysis Buffer, ủ 70oC trong 30 phút để hoà tan mẫu. + Bước 3: Ly tâm để loại bỏ bớt tạp chất. + Bước 4: Thêm hạt từ tính để tạo phức hợp "hạt từ tính-thành phần tích điện (-)". + Bước 5: Đặt ống nghiệm vào giá từ tính để lọc lấy phức hợp. + Bước 6: Rửa nhiều lần bằng Wash Buffer để thu phức hợp "hạt từ tính - DNA" + Bước 7: Để khô ở nhiệt độ phòng để loại bớt nước. + Bước 8: Thêm Elution Buffer và ủ ở 650C trong 5 phút để tách DNA ra khỏi hạt từ tính. + Bước 9: Thu dung dịch DNA. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 39 Sau khi thu được mẫu DNA, chúng tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp định lượng trên máy đo quang phổ Nanodrop. 2.2.2. Phương pháp định lượng DNA Sản phẩm DNA thu được sau quá trình tách chiết được định lượng trên máy Nanodrop ở bước sóng 260 và 280 nm để định lượng và kiểm tra độ tinh sạch. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm của các mẫu cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu đo. Độ tinh sạch của dung dịch dựa vào tỷ số OD 260nm/280nm. Một dung dịch axit nucleic được coi là sạch khi tỷ số OD là 1,8-2,0. Cách tiến hành - Lấy 1µl nước cất cho vào mắt đọc của máy để chuẩn máy trước khi đo DNA - Sau đó lấy 1µl dung dịch có chứa DNA đã được tách chiết cho vào mắt đọc và đo ở các bước sóng 260nm và 280nm. Đọc kết quả trên màn hiển thị nồng độ DNA tính bằng ng/µl và giá trị OD (260/280). 2.2.3. Phương pháp PCR Đại cương về phương pháp PCR. Kỹ thuật PCR do Karry Mullis phát minh vào năm 1985 đã đánh dấu những bước đột phá trong công nghệ sinh học bởi khả năng áp dụng của nó trong phân tích DNA. Nhờ có PCR người ta có thể nhân một đoạn DNA đích ban đầu lên hàng triệu bản sao chỉ trong vài giờ. Lượng DNA sau nhân bội đủ lớn để có thể phát hiện được bằng các phương pháp thông thường. Với những ưu điểm nổi bật, PCR đã nhanh chóng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực khoa học hình sự. Kỹ thuật này đã thay thế kỹ thuật RFLP vì những lý do sau: 1. Độ nhạy và tính đặc hiệu cao 2. Tiết kiệm thời gian và dễ dàng trong công tác giám định Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 40 3. Có thể xác định được đối với cả những mẫu có số lượng ít, chất lượng bị suy giảm 4. Có thể đồng thời xác định được nhiều locus khác nhau và tự động hóa được quy trình phân tích Thành phần và điều kiện PCR bao gồm: Đoạn DNA khuôn Đó là các đoạn DNA sau tách chiết từ các mẫu xét nghiệm. DNA mạch đơn hay mạch đôi đều có thể sử dụng được trong phản ứng PCR. Nguồn DNA khuôn có thể được lấy từ các mô hoặc các tổ chức khác nhau của cơ thể., hàm lượng DNA nhân thu được sau tách cũng khác nhau tùy thuộc vào từng mô, tổ chức cụ thể. Bảng 2.1. Hàm lượng DNA trong các loại mô khác nhau [25] Dạng mẫu Hàm lượng DNA/ số lượng mẫu Nhung mao màng đệm (phôi) 1-3 µg/ 5 mg Mẫu dịch âm đạo sau khi giao hợp 10 – 3000 ng/mẫu Tế bào niêm mạc miệng 0.5 – 1 µg/ 1 lần súc miệng Tóc bị đứt còn chân 1 – 750 ng/ chân tóc Tóc rụng còn chân 1 – 10 ng/ chân tóc Máu toàn phần 20000 – 40000 ng/ml Vết máu 250 – 500 ng/cm2 Tinh dịch 150000 – 300000 ng/ml Nước bọt 1000 – 10000 ng/ml Nước tiểu 1 – 20 ng/mg Xương 3 – 10 ng/mg Mảnh tổ chức 50 – 500 ng/mg Một phản ứng PCR thông thường sử dụng lượng DNA khuôn trong khoảng từ 10ng đến 1µg Mồi (primer) Mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn dài 15 – 30bp có trình tự bổ sung với trình tự bazơ của hai đầu đoạn (locus) DNA để khởi đầu quá trình tổng Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 41 hợp DNA. Mồi được thiết kế để chỉ gắn vào vị trí duy nhất trên DNA. Mồi càng dài thì khả năng tổng hợp chính xác đoạn DNA đích càng lớn. Các nucleotide (dNTPs) dNTPs là nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. Chúng gồm hỗn hợp của bốn loại nu dATP, dTTP, dCTP và dGTP. Ngoài bốn loại nêu trên người ta có thể sử dụng một số nucleotide được gắn thêm biotin hoặc dioxygenin tùy theo mục đích sử dụng và nghiên cứu. Nồng độ dNTPs thường dùng cho phản ứng PCR cơ bản từ 10 - 200µM cho mỗi loại nucleotide. Taq – DNA polymerase Taq-DNA polymerase là enzyme chịu nhiệt được chiết xuất từ vi khuẩn suối nước nóng có tên khoa học là Thermus aquaticus. Đặc điểm nổi bật của loại enzyme này là không bị bất hoạt ở nhiệt độ cao và có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp DNA. Taq-DNA polymerase có trọng lượng phân tử 94kDa, có hoạt tính 5’-3’ exonuclease và hoạt động tốt nhất ở 70 – 80oC. Tốc độ tổng hợp trung bình đạt 75 nucleotide trong 1 giây. Nồng độ Taq- DNA polymerase trong phản ứng PCR cơ bản là 1 – 1.5UI. Dung dịch đệm (buffer) Thành phần dung dịch đệm thay đổi tùy theo loại enzyme được sử dụng trong phản ứng PCR, nhưng quan trọng nhất là ion Mg2+. Bởi vì, ion Mg2+ rất cần thiết cho quá trình liên kết các dNTPs và hoạt tính enzyme Taq-DNA polymerase. Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng PCR cơ bản thay đổi từ 0.5 – 5.0mM. Một quá trình PCR đặc trưng bao gồm một số chu kỳ để nhân bội một trình tự DNA đặc hiệu. Trước chu kỳ đầu tiên thường có một bước khởi động nóng ở 94oC trong vòng 4 – 5 phút để làm biến tính hoàn toàn DNA khuôn. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước lặp lại sau: 1. Bước 1 (biến tính): DNA sợi khuôn được biến tính ở nhiệt độ 94 – 95oC trong khoảng 30 giây – 1 phút. Khi đó các liên kết Hydro trong phân tử bị bẻ gãy và DNA sợi kép bị tách thành hai sợi đơn. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 42 2. Bước 2 (gắn mồi): Mồi là các đoạn oligonucleotide dài từ 15 – 30 nucluotide có trình tự bổ sung với DNA khuôn. Nhiệt độ gắn mồi khoảng 40 – 70oC (tùy thuộc Tm của mồi) và kéo dài khoảng 1 phút. 3.Bước 3 (kéo dài chuỗi): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC là nhiệt độ thích hợp để cho DNA polymerase kéo dài chuỗi. Thời gian phản ứng tùy thuộc độ dài của đoạn DNA cần nhân bản, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút. Sau khi thu được các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR khuếch đại các mẫu bằng bộ kit AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit. Đây là bộ kit đặc hiệu nhân cùng lúc 15 locus STR và 1 marker giới tính, thành phần của mỗi một phản ứng theo gồm có: Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR Thành phần Thể tích AmpFlSTR PCR Reaction Mix 5,25 µl AmpliTaq Gold DNA Polymarase 0,25 µl AmpFlSTR Identifiler Primer Set 2,75 µl Mẫu - Nước - Tổng 12,5 µl Hỗn hợp phản ứng được chạy trên máy PCR 9700 với chu trình nhiệt như sau: Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 95oC 11 phút 1 chu kỳ 94oC 1 phút 28 chu kỳ 59oC 1 phút 72oC 1 phút 60oC 60 phút 1 chu kỳ 4oC ∞ 1 chu kỳ Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 43 2.2.4. Phương pháp điện di huỳnh quang Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành xác định kiểu gen của các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp điện di huỳnh quang (hay còn gọi là điện di mao quản) trên máy giải trình tự gen 3130XL của hãng Applied Biosystems. Các cặp mồi được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các locus được gắn các chất nhuộm huỳnh quang tương ứng. Các locus này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang. Màu xanh (blue), xanh lá cây (green), vàng (yellow), đỏ (red) và cam (orange) tương ứng với các dye 6-FAM, VIC, NED, PET và LIZ. Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng của chất nhuộm màu huỳnh quang. Các hạt huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn). Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó. Bảng 2.3. Đặc điểm của các chất nhuộm màu huỳnh quang sử dụng trong bộ kit Identifiler Dye Chemical name Excitation Maximum nm Emission Maximum nm 6-FAM 6-carboxy fluorescein 493 522 VIC Proprietary to Applied Biosystems 538 554 NED Proprietary to Applied Biosystems 546 575 PET Proprietary to Applied Biosystems 558 595 LIZ Proprietary to Applied Biosystems 638 655 Các dye VIC, NED, PET, LIZ là các dye được đăng ký độc quyền của hãng Applied Biosystems. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 44 Hình 2.5. Các dye trong kỹ thuật điện di huỳnh quang 5 màu Với kỹ thuật điện di huỳnh quang 5 màu, các băng có kích thước tương tự nhau được chia ra ở các màu khác nhau vì vậy có thể dễ dàng xác định được kích thước chính xác của từng locus sau quá trình hiện băng. Các băng màu xanh (blue) gồm các locus D8S1179, D21S11, D7S820 và CSF1PO phát xạ mạnh nhất ở bước sóng 522nm. Băng màu xanh (green) gồm các locus D3S1358, TH01, D13S317, D16S539 và D2S1338 phát xạ mạnh nhất ở bước sóng 554nm. Băng màu vàng gồm các locus D19S433, vWA, TPOX và D18S51 phát xạ mạnh nhất ở bước sóng 575nm. Băng màu đỏ gồm 2 locus D5S818, FGA và một marker giới tính Amelogenin được đo ở bước sóng 595nm. Còn lại các băng màu cam là đại diện cho thang alen chuẩn phát xạ mạnh nhất ở bước sóng 655nm. Hình 2.6. Các locus tương ứng với các màu trong kỹ thuật điện di huỳnh quang Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 45 Sau quá trình điện di, các kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm Genemapper ID 3.2 để xác định các alen của mỗi locus. Chuẩn bị mẫu trước khi điện di: Ngoài các mẫu nghiên cứu, chúng tôi chuẩn bị thêm hỗn hợp phản ứng cho thang alen chuẩn. Thành phần và tỷ lệ thể tích từng hỗn hợp phản ứng như sau: Thành phần Thể tích Hi-DiTM Formamide 8,7 µl GeneScan™ 500 LIZ® 0,3 µl Mẫu (Thang alen) 1,5 µl Tổng 10,5 µl Hỗn hợp phản ứng được biến tính trên máy PCR 9700 ở 95oC trong vòng 4 – 5 phút, sau đó lấy ra và ủ ngay vào đá lạnh trong 3 phút. Quá trình biến tính và làm lạnh đột ngột này đảm bảo hầu hết DNA từ dạng mạch đôi sẽ chuyển sang dạng mạch đơn hoàn toàn. 2.2.5. Phương pháp phân tích và tính tần suất alen 2.2.5.1. Phương pháp phân tích alen Sau quá trình điện di huỳnh quang, chúng tôi thu được các băng DNA khác nhau. Để xác định chính xác kiểu gen của mỗi locus chúng tôi tiến hành so sánh băng thu được với băng chuẩn của thang alen AmpFlSTR Identifiler™ Allelic Ladder . Thang alen chuẩn này chứa toàn bộ các alen chuẩn của từng locus như trên hình 11. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 46 Hình 2.7. Các alen trong thang alen chuẩn AmpFlSTR Identifiler™ Allelic Ladder Có 3 trường hợp sau: 1. Nếu locus nghiên cứu thu được hai băng khác nhau thì kiểu gen của locus đó là dị hợp tử 2. Nếu locus nghiên cứu thu được một băng duy nhất thì kiểu gen của locus đó là đồng hợp tử 3. Trường hợp băng thu được không có trong thang alen chuẩn, có thể đó là alen hiếm gặp trong quần thể. Khi đó việc xác định kiểu gen của locus sẽ dựa vào kích thước băng thu được, các alen hiếm sẽ được gọi tên theo kích thước của chúng. 2.2.5.2. Phương pháp tính tần suất alen Sau khi thu được kiểu gen của từng locus, chúng tôi tiến hành tính toán tần suất alen, tần số dị hợp tử thực tế, tần số dị hợp tử lý thuyết và khả năng phân biệt của từng locus theo các công thức sau: Tần số dị hợp tử quan sát (Observed Heterozygosity) Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 47 Tần số dị hợp tử quan sát H(ob) là tổng tần số các kiểu gen dị hợp tử quan sát được trong toàn bộ mẫu nghiên cứu. Tần số này được tính theo công thức: H(ob) = Số cá thể dị hợp tử Tổng số cá thể quan sát Tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected Heterozygosity) Tần số dị hợp tử lý thuyết H(ex) được tính theo công thức: H(ex) = 1 - å i=1 k P2i Trong đó: k là tổng số alen nghiên cứu Pi là tần số của alen thứ i trong k alen Khả năng phân biệt (Power of Discrimination) Khả năng phân biệt Pd được tính theo công thức: Pd = 1 – Pi Trong đó: Pi là khả năng trùng lặp (Power of Inclusion), nghĩa là khả năng nếu 2 cá thể được chọn một cách ngẫu nhiên trong quần thể sẽ có cùng một kiểu gen. Pi được tính bằng tổng bình phương tần số các kiểu gen theo lý thuyết trong quần thể. Ví dụ: Quần thể A có tần số các kiểu gen như sau: Genotype Expected Frenquency AA 0.053 AB 0.136 AC 0.218 BB 0.087 BC 0.280 CC 0.226 Xác xuất để hai cá thể được lấy ngẫu nhiên từ quần thể A có kiểu gen giống nhau là: Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 48 Pi = (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AA)2 + (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AB)2 + (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AC)2 + (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của BB)2 + (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AC)2 + (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của CC)2 = (0,053)2 + (0,136)2 + (0,218)2 + (0,087)2 + (0,280)2 + (0,226)2 = 0,206 Khả năng phân biệt: Pd = 1 - Pi = 1 – 0,206 = 0,794 Tần số Pi càng thấp thì tần số Pd càng cao, chứng tỏ khả năng phân biệt các cá thể khác nhau trong quần thể càng lớn. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ K17 – Sinh học 49 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Với mục đích nghiên cứu đa hình các locus STR ở người Việt Nam, chúng tôi tiến hành thu mẫu và tách DNA của 402 mẫu nghiên cứu, trong đó có 350 mẫu máu khô được bảo quản bằng thẻ thu mẫu FTA card, 10 mẫu niêm mạc miệng, 10 mẫu nước bọt, 8 mẫu tóc, 8 mẫu xương, 5 mẫu móng tay, còn lại là 21 mẫu máu tổng số thu trực tiếp từ đối tượng. Với mỗi một loại mẫu khác nhau, chúng tôi sử dụng các phương pháp tách chiết DNA khác nhau, phù hợp với từng đối tượng cụ thể. Sau khi thu được DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng cách đo nồng độ DNA trên máy Nanodrop, các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR multiplex nhân đồng thời 16 locus STR bằng bộ kít AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit. Sản phẩm sau PCR tiếp tục phân tích bằng phương pháp điện