Luận văn Nghiên cứu tạo phức hợp bao của B - Cyclodextrin với một số polyphenol định hướng ứng dụng trong y sinh

cho các chất bay hơi có thể điều nhiệt. f. Đông khô [30] Kỹ thuật đông khô thích hợp cho hoạt chất nhiệt rắn hoặc tan trong nước. Tỷ lệ chất mang yêu cầu và phân tử hoạt chất được hòa tan trong nước kèm khuấy. Dung dịch được đông khô và bột thu được được rửa bằng dung môi hữu cơ, sau đó được làm khô trong chân không. Phương pháp này có hiệu suất cao và có thể mở rộng quy mô. So với các kỹ thuật hiện có khác, kỹ thuật đông khô đã được áp dụng rộng rãi để hình thành phức hợp bao cyclodextrin, đặc biệt là hydroxyproply-β- cyclodextrin hòa tan trong nước. Một số loại tinh dầu và các hợp chất hoạt động chính tinh khiết của chúng đã được bao trong hydroxyproply-β-cyclodextrin. Chúng bao gồm quế và đinh hương, estragole (thành phần chính của tinh dầu húng quế và ngải giấm), tinh dầu hạt tiêu đen. 25 g. Phun khô [30] Chất mang và phân tử hoạt chất được hòa tan trong nước khử ion và sau đó dung dịch được làm khô bằng máy sấy phun. Máy sấy phun được vận hành trong các điều kiện thích hợp nhất như nhiệt độ đầu vào và tốc độ cấp mẫu. Khi sử dụng nhiệt độ 50–70°C, kỹ thuật này chỉ được sử dụng cho các phân tử có thể điều nhiệt. Gần đây, kỹ thuật sấy phun đã được sử dụng để đóng gói axit folic trong cyclodextrin. 1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về phức nano của β-cyclodextrin. Sử dụng cyclodextrin để tạo phức nano trong ngành dược phẩm đã bắt đầu được nghiên cứu trong vòng một thập kỷ gần đây. Một số phương pháp được áp dụng để chế tạo phức nano của cyclodextrin như: CO2 siêu tới hạn [31], đông khô [32], dung dịch [33], tạo gel ion [34]. Trong nghiên cứu của Hazuki Nerome và cộng sự, các tác giả đã tổng hợp thành công phức nano của cyclodextrin với lycopene bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn, kích thước hạt đạt được 40 nm (hình 1.9), [31]. Hình 1.9: Ảnh SEM của các hợp chất: (A) – lycopene; (B) – phức nano lycopene/βcyclodextrin sử dụng DCM làm dung môi; (C) – β-cyclodextrin;(D) – phức nano lycopene/βcyclodextrin sử dụng DMSO làm dung môi. 26 Trong công bố của Quandeel Khalid cùng các cộng sự đã nghiên cứu chế tạo phức nano của dexibuprofen với các hạt nano hydrogel β-cyclodextrin [33]. Hình 1.10: Độ tan tương đối của dexibuprofen thuần, phức hợp với β- cyclodextrin và nano hydrogel β-cyclodextrin trong các dung dịch có pH bằng 1,2; 6,8 và nước cất pha tiêm (WFI), [33]. Hình 1.11: Ảnh FE-SEM của β-cyclodextrin (a) và hạt nano hydrogel β- cyclodextrin (b), [33]. Các hạt nano hydrogel β-cylodextrin được tổng hợp bằng phản ứng trùng hợp gốc tự do, sau đó tạo phức với dexibuprofen bằng phương pháp đông khô. Khi tạo phức với β-cyclodextrin, độ tan của dexibuprofen tăng lên (1,2- 2,2 lần) so với dexibuprofen thuần. Bằng các tạo phức nano, độ tan của dexibuprofen đã được cải 27 thiện rõ rệt (6 lần), (hình 1.10). Kết quả phân tích XRD và FESEM cho thấy, các hạt nano có độ xốp khá cao với kích thước trung bình là 287 nm (hình1.11). Sự giải phóng thuốc đạt kết quả lớn nhất tại pH 1,2 và 6,8. Ở nước ta, lĩnh vực hóa học siêu phân tử đã bắt đầu nhận được sự quan tâm nghiên cứu từ 10 năm trước và có xu hướng tăng mạnh trong vài năm gần đây xét về lượng công bố và các đơn vị tham gia nghiên cứu. Đầu tiên phải kể đến nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Bùi Quang Thuật, Viện Công nghiệp thực phẩm, Bộ Công thương. Các tác giả đã xây dựng công nghệ sản xuất cyclodextrin, công nghệ chế biến và tạo các hương thơm dạng lỏng phù hợp cho các sản phẩm thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm phục vụ cho sản xuất hương liệu dạng bột, công nghệ sản xuất hương dạng bột từ cyclodextrin và các hình hương dạng lỏng [34]. Trường Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh có nhóm nghiên cứu của tác giả Huỳnh Văn Hóa chủ yếu tập trung vào nghiên cứu nâng cao sinh khả dụng của viên nén piroxicam bằng cách tạo phức với β–cyclodextrin [35, 36]. Nhóm nghiên cứu của tác giả Phùng Đức Truyền, Viện Sốt rét–ký sinh trùng- côn trùng thành phố Hồ Chí Minh công bố kết quả nghiên cứu tốc độ tan và độ tan của một số dược chất trong đó có rutin sau khi tạo phức với dẫn xuất của β-cyclodextrin [37]. Hình 1.12: Sơ đồ tạo phức chất của curcumin và β-cyclodextrin [38]. 28 Đáng chú ý phải kể đến công trình nghiên cứu của nhóm tác giả Phan Thanh Thảo, Viện Công nghệ Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tổng hợp thành công phức chất curcumin-cyclodextrin bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn [38]. Sản phẩm phức có độ bền sáng và khả năng hòa tan trong nước cao gấp nhiều lần so với curcumin, cụ thể, kích thước hạt phức chất curcumin-β- cyclodextrin trung bình 2,3 µm, độ tan cải thiện gấp 300 lần so với curcumin tự do. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa DPPH cho thấy phức chất curcumin- cyclodextrin cho khả năng kháng oxy hóa cao, với giá trị IC50 đạt 12,67 (μg/mL). Hình 1.13: Hình ảnh minh họa cơ chế tạo phức nano của β-cyclodextrin với alginat [39]. Các nghiên cứu kết hợp chitosan với cyclodextrin ở nước ta hầu như chưa có. Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Công Hào và cộng sự (Viện Công nghệ hóa học - Viện Hàn lâm KH&CNVN) đã thu được những kết quả hết sức khả quan trong ngành công nghệ sinh học nano, chế tạo thành công nano β- cyclodextrin-alginat làm vật liệu vận chuyển thuốc chữa bệnh [39] (hình 1.13). Kết quả phân tích SEM cho thấy, các hạt β-cyclodextrin và alginat/Ca2+ khi tồn tại riêng rẽ có kích thước micromet và phân tán không đều (hình 1.14 a,b) 29 Hình 1.14: Ảnh SEM của β-cyclodextrin (a), alginat/Ca2+(b) và alginat/Ca2+/βcyclodextrin (c) [36]. Khi kết hợp với nhau, các hình cầu có cấu trúc dày đặc, kích cỡ đồng đều với độ lớn dưới 100 nm được hình thành bởi lực tương tác tĩnh điện của các oligosaccarit với các ion Ca2+ (hình 1.14c), [39]. Sau đó, các hạt alginat/Ca2+/β- cyclodextrin được nghiên cứu chế tạo phức hợp với ketoprofen [25]. Kết quả phân tích SEM và TEM cho thấy, các hạt phức nano ketoprofen/alginat/Ca2+/β- cyclodextrin có kích thước khá đồng đều với độ lớn 61,25nm (hình 1.15). Sự giải phóng thuốc đạt kết quả tốt nhất 69% tại pH 5, [39]. Hình 1.15: Ảnh SEM (a) và TEM với độ phóng đại 30000 (b) lần và 100000 (c) lần phức của ketoprofen với hạt nano alginat/Ca2+/β-cyclodextrin [40]. Tác giả Nguyễn Cao Hiền và cộng sự đã tổng hợp hệ nano hydroxypropyl- betacyclodextrin/alginate làm vật liệu mang thuốc [41]. Kết quả cho thấy, hệ nano mới được hình thành từ alginate và hydroxypropyl-β-cyclodextrin bằng phương 30 pháp gel ion hóa qua tương tác tĩnh điện giữa Ca2+/alginate và hydroxypropyl-β- cyclodextrin. Với kích thước hạt nano thu được khá đồng đều trong khoảng 50 - 80 nm. Artesunate (thuốc điều trị sốt rét) được chọn làm mẫu tạo phức với vật liệu, hiệu suất mang thuốc đạt được 88%. 1.3. PHỨC HỢP BAO CỦA Β-CYCLODEXTRIN VỚI NHÓM QUERCETIN Phức của rutin và quercetin với cyclodextrin đã được tổng hợp bằng một số phương pháp: nghiền ướt, trộn khô, đồng kết tủa [42-44]. Trong đó, phức thu được theo phương pháp đồng kết tủa bền vững hơn, tuy nhiên hiệu suất phản ứng lại rất thấp (<23%) [42,43]. Trong nghiên cứu gần đây, nhóm tác giả T.V. Ilyich và cộng sự đã tổng hợp phức hợp bao quercetin/βCD, quercetin/HPβCD bằng cách hòa tan quercetin (50 mg) và CD (250 mg) trong ethanol 96% (50 mL) [45]. Hỗn dịch được khuấy trên máy khuấy từ trong 24 giờ, tốc độ 60 vòng / phút ở 20°C. Kết quả đã chứng minh sự hình thành phức hợp đi kèm với khả năng hòa tan quercetin tăng lên, tuy nhiên, khả năng hòa tan của quercetin/HPβCD cao hơn quercetin/βCD. Kết quả mô hình hóa lượng tử cho thấy của các phân tử quercetin chui vào trong khoang rỗng của βCD, chứng minh sự hình thành phức hợp xảy ra do hình thành liên kết hydro giữa một số nhóm chức của quercetin và βCD dẫn đến sự thay đổi hình học (sự xoắn), tính chất phân tử (mômen lưỡng cực và hiệu ứng nhiệt của phản ứng) của quercetin và kích thước của khoang. Những kết quả này cho thấy kích thước khoang rỗng của HPβCD lớn hơn βCD dẫn đến sự khác biêt về tính chất giữa hai phức này. Phản ứng tạo phức của rutin với các cyclodextrin là phản ứng tự phát (G<0) và tỏa nhiệt (ΔH <0) [46]. Sự khác biệt giữa đường kính lỗ hổng tâm phân tử cyclodextrin và kích thước phân tử rutin ảnh hưởng khá nhiều đến độ bền của phức chất, cụ thể, phức của rutin với β-cyclodextrin có độ bền lớn hơn cả so với phức của α- và γ-cyclodextrin [47]. Theo tác giả bài báo, khoang của α-cyclodextrin quá nhỏ gây khó khăn cho việc hình thành phức hợp dạng « lồng nhau », trong khi khoang phân tử γ-cyclodextrin lại khá lớn không giữ được phân tử rutin một cách « chặt chẽ » ở bên trong. Khi tạo phức hoạt tính chống oxy hóa của rutin tăng lên, phức khá bền trong dung dịch cũng như dưới các tác nhân bên ngoài như tia cực 31 tím. Một số nghiên cứu đã chứng minh vòng A của rutin nằm trọn trong khoang của cyclodextrin trong phức hợp [46, 47]. Từ tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước có thể thấy rutin đã được tinh chế bằng nhiều phương pháp như nước, kiềm hoặc axit. Trong đó phương pháp kết tủa bằng axit HCl được biết đến nhiều hơn. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là độc hại và ăn mòn thiết bị của axit. Bên cạnh đó, việc chế tạo phức có kích thước nano của rutin và quercetin nhằm tăng sinh khả dụng lại chưa được quan tâm thỏa đáng. Do đó, đề tài này sẽ tập trung nghiên cứu tinh chế rutin từ hoa hòe có hàm lượng cao, bán tổng hợp rutin để thu được quercetin; sau đó sẽ tổng hợp phức nano của cyclodextrin với rutin và quercetin nhằm tăng độ tan của dược chất, đồng thời khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của rutin trước và sau khi tạo phức. 32 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 2.1.1 Thiết bị - Máy siêu âm (Saehan Sonic). - Máy cất quay dung môi (SIBATA Model RE-10E-100). - Máy khuấy từ gia nhiệt (Heating Magnetic Stirrer–VELP Scientifica). - Máy đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Nicolet Nexus 670). - Phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân (AVANCE III-Bruker BioSpin- Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam). - Máy đo nhiệt lượng kế vi phân (DSC, DSC204F1-NETZSCH-Germany). - Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) số hiệu JSM-6510LV Jeol, Nhật Bản). - Tủ sấy thường, cân thường và cân vi lượng. 2.1.2 Dụng cụ - Bình tam giác loại 50 mL, 100 mL, 250 mL. - Bescher loại 50 mL, 100 mL, 250 mL. - Ống hút, pipet, đũa thủy tinh, cá từ, lọ thủy tinh, chai đựng mẫu, ống đong 50 mL, 25 mL, 10 mL, 5 mL. - Bình định mức 100 mL, 500 mL. 2.2. CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ RUTIN TỪ HOA HÒE Rutin được chiết xuất, tinh chế từ nụ hoa hòe theo sơ đồ sau: 33 Hình 2.1: Sơ đồ chiết xuất, tinh chế từ nụ hoa hòe. 2.2.1 Phương pháp chiết xuất rutin Hoa hòe sau khi thu hái được phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở nhiệt độ 60-70oC đến khi khô hoàn toàn. Thực hiện chiết xuất rutin từ nụ hoa hòe bằng dung dịch kiềm Na2CO3 2%. Phương pháp chiết xuất bằng dung dịch kiềm được thực hiện như sau: Rửa bằng HCl 0,5% rồi rửa bằng nước cho hết axit. Cho 100g hoa hòe đã giã dập vào 800 mL dung dịch Na2CO3 2%, đun sôi trong 30 phút. Đem lọc trên phễu Buchner thu dịch chiết; tiếp tục chiết thêm 1 lần với 500mL dung dịch Na2CO3 2%. Gộp hai 34 phần dịch chiết lại, dùng dung dịch HCl 10% điều chỉnh đến pH=2, để lạnh thấy xuất hiện kết tủa màu vàng. Lọc thu lấy kết tủa, sau đó rửa lại bằng nước cất đến khi pH=6-7. Sấy kết tủa thu được ở nhiệt độ 40-50oC trong 24h thu được sản phẩm thô. Hình 2.2: Chiết xuất rutin trong Na2CO3 2%. 2.2.2 Tinh chế rutin Sau khi thu được rutin thô từ các phương pháp chiết xuất rutin từ hoa hòe, tiến hành tinh chế trong các điều kiện và dung môi khác nhau dựa vào tính chất và độ tan của rutin. Hai phương pháp tinh chế được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: tinh chế rutin bằng cồn và tinh chế rutin bằng acid-base. Hiện nay, các nghiên cứu vẫn chủ yếu sử dụng axit HCl để kết tủa rutin trong dung dịch kiềm, tuy nhiên HCl có nhiều mặt hạn chế (độc hại, ăn mòn thiết bị). Vì vậy, trong nghiên cứu này rutin được kết tủa bằng axit acetic để khắc phục những nhược điểm trên. Trong lĩnh vực dược phẩm, axit acetic là một trong số ít những axit được ưu tiên lựa chọn vì tính an toàn cho người trực tiếp sản xuất và người sử dụng. Phương pháp tinh chế rutin bằng acid-bazo: Chuẩn bị 5 cốc thủy tinh chứa 100mL dung dịch Na2CO3 2%, đun đến sôi. Thêm từ từ rutin thô vào bình chứa 35 dung dịch Na2CO3 sôi đến khi đạt trạng thái bão hòa. Lọc các dung dịch qua phễu Buchner loại bỏ cặn và tạp chất, sau đó đun nóng ở 70oC. Chuẩn bị 5 cốc chứa dung dịch acid acetic ở các nồng độ 10%-20%-30%-40% và 50%, đun nóng đến 70oC. Thêm từ từ acid acetic các nồng độ vào lần lượt từng bình chứa dung dịch rutin đến khi đạt pH=4-5. Khuấy lắc mạnh đến khi xuất hiện tủa màu trắng đục. Để nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng, lọc qua phễu Buchner thu kết tủa; rửa lại kết tủa bằng nước cất đến pH=6-7 thu được rutin sạch. Sấy khô ở nhiệt độ 40-45oC thu được sản phẩm. Hình 2.2: Rutin thu được sau tinh chế bằng phương pháp acid-base. 2.3. BÁN TỔNG HỢP QUERCETIN Sau khi thu được rutin tinh khiết, tiến hành bán tổng hợp quercetin bằng dung dịch HCl nồng độ thấp. Đây là phương pháp đơn giản, các điều kiện thực hiện không yêu cầu kỹ thuật cao; tuy nhiên thiết bị thực hiện cần có khả năng chống acid ăn mòn. Phương pháp bán tổng hợp quercetin : chuẩn bị 10g rutin tinh cho vào bình cầu chứa 100ml dung dịch HCl có nồng độ 5%. Tiến hành đun sôi cách thủy các bình cầu, có hồi lưu dung môi. Sau 2h, rutin trong dung dịch HCl 5% đã chuyển 36 hóa toàn bộ thành quercetin, kiểm tra quá trình biến đổi bằng phương pháp sắc ký bản mỏng. Phương pháp tinh chế quercetin: hòa tan quercetin thu được trong 50ml cồn 96o đun sôi, thêm từ từ 100 ml nước cất vào dung dịch đến khi xuất hiện kết tủa. Giữ bình ổn định ở điều kiện thường trong 1h đến khi nhiệt độ bình bằng nhiệt độ phòng. Lọc qua phễu lọc Buchner thu kết tủa màu vàng xanh, rửa tủa với nước cất lạnh thu được quercetin tinh. Hình 2.4: Quercetin thu được sau tinh chế. 2.4. TỔNG HỢP PHỨC NANO CỦA Β-CYCLODEXTRIN VỚI RUTIN VÀ QUERCETIN Dung dịch cyclodextrin được thêm vào các dung dịch chứa RuT và Quer, mỗi lần 10 mL và được khuấy bằng máy khuấy từ trong 24 giờ ở 25oC. Hỗn hợp dung dịch sau phản ứng được lưu giữ trong vòng 48h ở 4oC để tạo kết tủa màu vàng mịn. Kết tủa được rửa nhiều lần với DMSO và được đem đi đông khô trong vòng 48 giờ. 2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.5.1 Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Các phức hợp [RuT-βCD], [Quer-HPβCD] được phân tích cấu trúc bằng phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) trên máy Nicolet Nexus 670 bằng cách ép viên 37 với KBr. Các mẫu được quét phổ ở vùng 400 cm-1 – 4000 cm-1. Phổ FTIR được ghi dưới dạng đường cong phụ thuộc phần trăm truyền qua vào số sóng (1/λ) sau khi đã bù trừ phổ nền của không khí. Các hoạt chất và cyclodextrin cũng được phân tích đồng thời để đối chứng. Trong hỗn hợp với KBr, hàm lượng của các mẫu đều bằng 6% khối lượng. 2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 2.5). Các bước tiến hành định tính RuT và Quer bằng sắc ký lớp mỏng (Hình 2.6): Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng sử dụng trong nghiên cứu là bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, kích thước 20×20 cm, dày 0,2 mm. Bản mỏng trước Hình 2.5: Cách tính giá trị Rf. Rf = 38 khi dùng phải hoạt hóa trong tủ sấy và sấy ở 105-110°C trong một giờ. Dùng bút chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đường chấm chất phân tích (cách mép dưới của bản mỏng 1,2 cm), đường giới hạn di chuyển của dung môi (cách mép trên của bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm). Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet chấm dung dịch RuT và Quer lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ, lượng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng không quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử. Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy kín và đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Hệ dung môi triển khai đối với rutin: Ethyl acetate-methanol: 7-3, hệ dung môi triển khai đối với quercetin: hexane-ethanol: 4-6. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết. Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong nghiên cứu là Ce(SO4)2). 2.5.3 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR Mẫu rutin và quercetin thu được từ quá trình chiết xuất và bán tổng hợp được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C- Hình 2.6: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng. 39 NMR bằng phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân AVANCE III, hãng Bruker BioSpin, Thụy Sĩ. Phổ 1H-NMR cho biết môi trường hoá học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hoá học khác nhau sẽ có chuyển dịch hoá học khác nhau, thường nằm trong khoảng 0 – 14 ppm (Hình 2.7). Hình 2.7: Khoảng chuyển dịch hóa học của một số proton. Phổ 13C-NMR cung các cấp thông tin về môi trường hoá học của carbon. Độ chuyển dịch của carbon nằm trong khoảng 0 – 240 ppm (Hình 2.8). Đây là ưu điểm rất lớn của phổ 13C-NMR vì các tín hiệu phổ sẽ ít bị trùng lặp và đặc trưng đối với mỗi chất. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với 1 carbon (hơn 1 carbon nếu chúng có chung môi trường hoá học) của phân tử. 40 Hình 2.8: Khoảng chuyển dịch hóa học các dạng carbon chọn lọc. 2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Quá trình sắc ký xảy ra do các cơ chế: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử. Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại cho pic trên sắc ký đồ. 2.5.5 Phương pháp phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis Cường độ của tia đơn sắc trước và sau khi đi qua môi trường hấp thụ được liên hệ với nhau bởi định luật Lambert-Beer. A = -lg(I/I0) = ɛ.l.C 41 Trong đó A: mật độ quang; C: nồng độ dung dịch (mol/l); l: chiều dài lớp dung dịch (chiều dày cuvet đựng mẫu), (cm); ɛ: hệ số hấp thu phân tử có thứ nguyên hay hệ số hấp thu mol đặc trưng cho cường độ hấp thu của chất nghiên cứu ở bước sóng đã cho (l/mol.cm); I: cường độ chùm sáng đi qua dung dịch; I0: cường độ chùm sáng đi qua dung môi. Phương pháp quang phổ tử ngoại- khả kiến được áp dụng để xác định định tính (nhận biết), xác định định lượng, cấu trúc trong nghiên cứu phức chất. Trong khuôn khổ đề tài này, rutin, quercetin và các phức hợp tương ứng được phân tích bằng phương pháp phổ tử ngoại-khả kiến (UV-Vis) trên máy CINTRA 40, GBC (Mỹ). a) Xác định độ hòa tan của dược chất trước và sau khi tạo phức Độ hòa tan của các dược chất được khảo sát theo thời gian trong môi trường pH 7,4 – tương ứng với môi trường vùng dịch tá tràng. Trước khi xác định được độ tan của các dược chất ta cần phải xây dựng phương trình đường chuẩn của rutin trong dung dịch đệm pH 7,4. Phương pháp như sau: Tiến hành ghi phổ UV-Vis của các dung dịch RuT có nồng độ chính xác để xác định mật độ quang tại bước sóng cực đại 365 nm đối với RuT. Dựng phương trình phụ thuộc của mật độ quang với nồng độ dung dịch RuT tương ứng bằng phần mềm Origin. Khảo sát độ tan của các dược chất: Một khối lượng chính xác của vật liệu được đưa vào bình có dung tích 500 ml chứa dung dịch đệm ở 370C. Sau các khoảng thời gian cố định (5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút) để lắng và hút chính xác 5 ml phần dung dịch phía trên bình phản ứng, lọc qua giấy lọc và đem đi đo phổ UV-Vis. Từ phương trình đường chuẩn đã xây dựng ở trên xác định được chính xác nồng độ của rutin trong dung dịch tại từng thời điểm lấy mẫu. Độ hòa tan của các mẫu tại thời điểm t được tính toán như sau: % hòa tan = m ở thời điểm t/ m chứa trong mẫu · 100% 42 b) Xây dựng giản đồ pha hòa tan Giản đồ pha hòa tan được xây dựng theo phương pháp Higuchi-Connors [52]. Đây là phương pháp khá phổ biến trong hóa học phức chất siêu phân tử. Lượng dược chất dư được thêm vào 25ml các bình cầu có chứa CD với nồng độ dao động trong khoảng từ 0 đến 9mM. Lắc các ống nghiệm liên tục trong 24 giờ ở 25 ± 1oC. Để xác định nồng độ của hoạt chất đã hòa tan trong các mẫu, thu hồi và lọc qua màng có đường kính lỗ trống 0,45 μm. Sau đó pha loãng phần dung dịch thu được đến nồng độ cần thiết và xác định độ hấp thụ ở 256 nm (với rutin) và 370 nm (với quercetin) bằng phương pháp quang phổ UV-Vis. Hằng số bền của các phức chất (Ks) được xác định từ giản đồ pha của quá trình hoà tan theo phương trình sau: Trong đó, S0 là độ hoà tan của dược chất ở 25oC khi không có cyclodextrin; Slope được xác định bằng hệ số góc từ đồ thị phụ thuộc nồng độ (mol/l) dược chất đã hòa tan với nồng độ (mol/l) của CD trên biểu đồ pha hòa tan. 2.5.6 Phương pháp nhiệt lượng quét vi sai DSC Đo nhiệt lượng quét vi sai (DSC) là một kỹ thuật cho phép nhận biết những hiện tượng năng lượng xảy ra trong quá trình làm nóng hoặc làm lạnh của một chất (hoặc hỗn hợp nhiều chất) và xác định biên thiên enthalpy, nhiệt dung riêng và nhiệt độ ở đó xuất hiện các hiện tượng này. Kỹ thuật được dùng để xác định chênh lệch tốc độ nhiệt giải phóng hoặc hấp thu bởi chất khảo sát so sánh với mẫu đối chiếu theo sự thay đổi của nhiệt độ. Mục đích của phương pháp đo nhiệt lượng quét vi sai (DSC) trong nghiên cứu này là đo biến đổi thành phần hóa học, chứng minh rutin và quercetin đã được bao bọc bởi các cyclodextrin. Rutin, quercetin, cyclodextrin và các phức hợp được phân tích nhiệt bằng máy đo nhiệt lượng kế vi phân (DSC, DSC204F1 (NETZSCH-Germany). Cân chính xác các mẫu rắn (khoảng 3-4mg) trong chảo nhôm và quét từ nhiệt độ phòng 43 (25oC) đến 350°C với tốc độ gia nhiệt không đổi 10°C/phút trong môi trường khí trơ (ni-tơ). 2.5.7 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM) Kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho phép kiểm tra hình thái học của vật chất bằng hình ảnh trực tiếp. Các kỹ thuật dựa trên kính hiển vi điện tử cung cấp nhiều ưu điểm trong phân tích hình thái và kích thước. Hình thái cấu trúc của các hạt phức nano [RuT-βCD] và [Quer-HPβCD] được khảo sát bằng thiết bị kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) số hiệu JSM-6510LV (Jeol, Nhật Bản). Các mẫu được phủ bạch kim trước khi đo. 2.5.8 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại (517 nm). Giá trị mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao. Quy trình thí nghiệm thực hiện như sau: Bổ sung 5 ml DPPH (0,18 mM, pha trong ethanol) vào mỗi ống nghiệm đã chứa 2 ml dung dịch hoạt chất tại các nồng độ khác nhau (4.10-6M – 83.10-6M), lắc đều và ủ 30 phút trong điều kiện không có ánh sáng. Sau đó, tiến hành đo mật độ quang OD tại bước sóng 517 nm trên máy quang phổ UV-Vis. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa của mẫu. Tỉ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa được xác định theo công thức sau: Tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH = % Trong đó, ODm: giá trị mật độ quang OD của mẫu thử; ODc: giá trị mật độ quang OD của chứng âm. Từ tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, chúng tôi xây dựng phương trình tương quan tuyến tính, từ đó chúng tôi xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà tại đó bắt 50% gốc tự do DPPH) để làm cơ sở so sánh khả năng