Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học cây nghể điểm (polygonum lapathifolium l.)

on, quinon) Semiquinon hoặc quinon là những gốc tự do bền vững, có thể nhận điện tử và hydro từ những chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinon. Chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do để tiêu diệt chúng.[16] Trong cơ thể tồn tại nhiều gốc tự do như oxy nguyên tử, gốc peroxit, gốc hydroxyl, gốc peroxynitrit, và như vậy có rất nhiều phản ứng oxi hóa xảy ra. Để chống lại các tác hại gây ra bởi các gốc tự do này, mỗi cơ thể sống có những hệ oxy hóa nội sinh, ngoài ra còn có những chất chống oxi hóa khác được đưa vào cơ thể dưới dạng thức ăn, đồ uống,... Flavonoid là những chất như thế. Vì vậy nhiều nhà hóa sinh học cho rằng flavonoid là những chất chống oxi hóa lý tưởng đối với con người. Một trong những cơ sở hóa quan trọng nhất để flavonoid thể hiện được hoạt tính chống oxy hóa của chúng là khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động. Tuy nhiên hoạt động này thể hiện mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào đặc điểm cấu trúc và đặc trưng lập thể của từng chất cụ thể. [28] HVTH: Đào Anh Dũng - 31 - Khi đưa vào cơ thể flavonoid sẽ liên kết với các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lý (như viêm nhiễm, ung thư, lão hóa, ...) để giải tỏa điện tử trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên hợp. Từ đó sẽ hình thành các hợp chất mới bền vững hơn các gốc tự do họat động và không tham gia vào dây chuyền phản ứng oxi hóa tiếp theo. Kết quả là hạn chế quá trình bệnh lý do cắt đứt dây chuyền phản ứng oxy hóa. [28] Ví dụ, khi ở dạng quinon hay semiquinon, flavonoid loại trừ các gốc tự do hoạt động của cơ thể theo cơ chế sau: O O O O R OR O R OR OR + . + . - -- R . : gốc tự do hoạt động Như vậy kết quả là 2 gốc tự do hoạt động bị triệt tiêu và tạo thành sản phẩm không gốc. Ngoài ra, flavonoid còn kìm hãm sự phát sinh các gốc tự do hoạt động có khả năng tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp như Fe2+, Cu2+, ... để chúng không thể xúc tác cho phản ứng Fenton sinh ra các gốc họat động như OH . , O: .[62] Tương tự alpha-tocopherol (vitamin E), tác dụng chống oxi hóa của các flavonoid dựa trên cấu trúc hóa học của chúng. Theo tiến sỹ Vab Acker (Hà Lan) và các cộng sự, flavonoid có thể thay thế vitamin E như một tác nhân chống oxi hóa trong màng nhầy của các vi thể sống. Liều sử dụng của các flavonoid dẫn đến hoạt tính chống oxi hóa nằm trong khoảng 50 ÷ 800 mg, tương đương với 70 mg vitamin C, 7 ÷ 10 mg vitamin E, và 2 ÷ 3 mg carotenoid. HVTH: Đào Anh Dũng - 32 - I.3.5.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm [61, 45] Năm 1964 lần đầu tiên một nhà khoa học đa nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của flavonoid. Thí nghiệm với 24 flanonoid trên 10 chủng vi khuẩn, ông nhận thấy hầu hết các flavonoid đều ức chế hô hấp và sự tái sinh của các vi khuẩn ở nồng độ từ 1÷2 µmol trong môi trường có đường glocu. Với 24 chất thử không có chất nào không có tác dụng với dưới 9 trên 10 chủng vi khuẩn trên. Điều đó chứng tỏ flavonoid có tác dụng kháng khuẩn [61]. Các nghiên cứu khác cũng chỉ ta Quercetin có khả năng chống viêm do ức chế trực tiếp hàng loạt phản ứng khởi phát hiện này đó là ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các chất trung gian khác trong quá trình viêm và dị ứng. Cơ chế của tác dụng này là ức chế sự phân hủy collagen xảy ra do các men mà bạch cầ hoặc vi khuẩn tiết ra trong quá trình viêm nhiễm, ngăn chặn sự phóng thích và tổng hợp các hợp chất làm tăng trình trạng viêm và dị ứng, như histamin, serine proteaza, prostaglandin, leukotrien,...[45]. Chang-Qi Hu và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế virut HIV ở các tế bào H9 của 35 flavonoid chiết xuất từ thực vật và tổng hợp, đã nhận thấý các chất có nối đôi ở các vị trí C2 – C3 và các nhóm OH ở vị trí C5 và C7 thể hiện hoạt tính cao hơn. Sự có mặt của các nhóm thể hydroxyl hoặc halogen ở vòng B thường làm giảm hoạt tính. I.3.5.3 Tác dụng kháng ung thư [2, 18, 17] Trong một chương trình sàng lọc chất có tác dụng với các khối u đã phát hiện một số flavonoid có tác dụng đối với một số dạng ung thư như Eupatin, Eupatorenin, Centaureidin đều có tác đối với các Carcinoma của ung thư vòm họng [2]. HVTH: Đào Anh Dũng - 33 - O OOH H3CO H3CO OH OH OCH3 Eupatin O OOCH3 H3CO H3CO OH OH OCH3 Eupatoretin O OOH H3CO HO OCH3 OH OCH3 Centaureidin Khi đưa ra một số chất flavonoid vào vận chủ mang khối u thì người ta thấy chúng có tác dụng nhu những tác nhân hóa trị liệu. Chất này có tác dụng kìm hãm các enzyme oxy hóa khử, kìm hãm quá trình glycolyse và hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn chế sự phá vỡ cân bằng của các quá trình trao đổi bình thường trong tế bào [18]. Gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm trên in vivo và in vitro của flavonoid lên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau và nhận thấy các flavonoid có oxy ở vị trí 7,8 và 4’ thể hiện tác dụng chống khối u [17]. I.3.5.4 Tác dụng đối với các bệnh tim mạch [2, 26] Trong quá trình phân lập vitamin C, một nhà sinh hóa nổi tiếng nhất thế kỷ 20: Albert Szent-Gyorgyi (1893 ÷ 1986) đã khám phá ra các flavonoid. Một người bạn của ông đã ngừng chảy máu nướu răng sau khi đã dùng dịch chiết giàu vitamin C từ nước chanh. Như vậy, đã có sự tham gia của một chất khác bên cạnh vitamin C trong dịch chiết nước chanh và Albert Szent-Gyorgyi đã phân lập được chất này, giúp bạn ông chống chảy máu nướu răng hữu hiệu. Ban đầu Albert Szent-Gyorgyi gọi chất này là “vitamin P” do khả năng làm giảm tính thấm thành mạch của nó (vascular permeability) – một trong những triệu chứng thường gặp của bệnh Scurvy do thiếu vitamin C. Sau đó ông đã công bố bệnh Scurvy xảy ra không chỉ do thiếu vitamin C mà còn do thiếu flavonoid [2]. Tuy nhiên vì flavonoid không có đầy đủ các tính chất của một vitamin nên sau này người ta bỏ tên “vitamin P” này đi. Tác động của flavonoid đối với các HVTH: Đào Anh Dũng - 34 - bệnh về tim mạch có thể do khả năng của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp dưới hình thức xơ vữa động mạch. Uống flavonoid làm giảm các nguy cơ tử vong do bệnh tim mạch vành ở phụ nữ sau mãn kinh hoặc ở đàn ông có tuổi. Các flavonoid có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm sức thấm vào mao mạch, ngăn cản không cho protit của máu thấm qua các mô khác, có tác dụng dự phòng vỡ mao mạch, gây xuất huyết phù thũng [26]. Thực nghiệm cho thấy các flavonoid có nhóm OH tự do ở các vị trí 3’,4’ có tác dụng tốt đối với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch. Rutin là một trong những hợp chất tiêu biểu về tác dụng này [2]. I.3.5.5 Tác dụng estrogen [22] Khi nghiên cứu về hiện tượng xảy thai của cừu ở Úc, người ta nhận thấy nguyên nhân chủ yếu gây ra hiện tượng này là do cừu ăn một loại cây Trifolium subterraneum có chứa isoflavone là genistein với hàm lượng là 0,7% trong lá. Thực nghiệm cũng chỉ ra chất này có tác dụng estrogen trên chuột nhắt. Năm 1957, Bickoff và cộng sự đã phân lập được từ Trifolium repens một số chất có tác dụng estrogen mạnh gấp 80 ÷ 100 lần so với isoflavon của Trifolium subterraneum. Whalley cho rằng tác dụng estrogen của các chất đó có thể hiểu được do sự giống nhau về cấu trúc hóa học giữa chúng với một chất estrogen tổng hợp là dietylstilbestrol [22]. Pretorius, năm 1958, đã nghiên cứu tác dụng estrogen của một số nhóm chất flavonoid cho thấy các glucozit quercetin và kaempferol đều có tác dụng estrogen. Tác dụng của 50 mg các hợp chất này tương đương với tác động của 34 mg dietylstilbestrol. HVTH: Đào Anh Dũng - 35 - OHO OH OH O Genistein OHO OH O OH OH Kaempferol OHO OH O OH OH Quercetin OH H3C HO OH OH Diethyl stilbestrol OH CH3 I.3.5.6 Tác dụng đối với các enzym [25] Khả năng tương tác với protein là một trong những tính chất quan trọng nhất của các hợp chất phenolic, quyết định hoạt tính sinh học của chúng. Phản ứng xảy ra giữa nhóm hydroxyl phenolic và các oxycacbonyl của các peptit để tạo thành liên kết hydro. C O HN H O R Tính bền vững của liên kết này phụ thuộc vào số lượng và vị trí các nhóm OH và kích thước phân tử của hợp chất. Là một hợp chất phenolic nên flavonoid cũng có thể tương tác với protein enzym, làm thay đổi hoạt tính của nhiều enzym trong các hệ thống sinh học. Các flavonoid khi ở trong cơ thể động vật có thể tồn tại ở dạng oxy hóa hoặc khử và chịu nhiều biến đổi phức tạp khác nhau cho nên có thể thể hiện nhiều hoạt tính sinh học khác nhau: kìm hãm hay kích thích hoạt động của enzym hoặc kích thích có mức độ và có điều kiện theo những cơ chế phức tạp hơn trong nghiên cứu in vitro [25]. HVTH: Đào Anh Dũng - 36 - Ngoài ra, một số flavonoid còn có tác dụng ức chế men Xanthin oxydaza - một loại men kích thích tổng hợp acid uric gây nên bệnh Gout, hay quercertin ức chế men aldose reductaza, men có nhiệm vụ chuyển glucoza máu thành sorbitol - một hợp chất gây nên các biến chứng đái tháo đường như đục thủy tinh thể, thương tổn thần kinh, bệnh võng mạc. HVTH: Đào Anh Dũng - 37 - CHƯƠNG II – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Tổng quan chung về phương pháp chiết II.1.1 Đặc điểm chung của phương pháp chiết Khái niệm : Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hòa tan nó. Mục đích : Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu. Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên. II.1.2 Cơ sở của quá trình chiết [2] Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hòa tan lẫn nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng. Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst : KA = CA/CB\ KA : Hằng số phân bố CA,CB : Nồng độ các chất hòa tan trong chất lỏng A, B không hòa tan lẫn nhau II.1.3 Quá trình chiết thực vật II.1.3.1 Chọn dung môi chiết Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng cho quá trình chiết phải được chọn lựa rất cẩn thận, nó cần hòa tan các chất nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất HVTH: Đào Anh Dũng - 38 - nghiên cứu), không độc hại, khó bốc cháy. Các dung môi này nên được cất (làm sạch) trước khi sử dụng cho quá trình chiết để không ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hydrocarbon thế. Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên mang tế bào, do vậy quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Ngược lại, khả năng phân cực của clorofome thấp hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết với ancol thì các chất này sẽ bị hòa tan đồng thời. Thường dung môi cồn trong nước, dường như có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ , thường dùng dung dịch nước của methanol. Sau khi chiết dung môi được tách ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30 ÷ 40oC, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn. II.1.3.2 Quá trình chiết Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau a) Quá trình chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Soxhlet : Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi. b) Chiết ngâm : Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra (chiết nguội). Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Việc kết thúc quá trình được xác định bằng một số cách như sau : HVTH: Đào Anh Dũng - 39 - • Với các ankaloid, có thể kiểm tra sự xuất hiện của các loại hợp chất này bằng sự tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như : Dragendorff, Mayer,... • Với các flavanoid thường là những chất màu, nên khi dịch chảy ra mà không có chất màu thì cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết. • Trong trường hợp các lacton của sesquitecpen và các glucozit trợ tim, phản ứng kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat, sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể biết khi nào quá trình chiết kết thúc. Như vậy tùy thuộc mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp, và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao. II.2 Tổng quan chung về phương pháp sắc ký [2] Sắc ký là phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng. II.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký. HVTH: Đào Anh Dũng - 40 - II.2.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir : n = n∞bC/(1+bC) n : lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng n∞ : lượng chất cực đại của chất bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó b : hằng số C : nồng độ II.2.3 Phân loại các phương pháp sắc ký Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn : Sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký người ta chia thành các phương pháp sắc ký chủ yếu sau II.2.3.1 Sắc ký cột Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion,... Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết và khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng phân tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu trọng lực không đủ lớn sẽ gây hiện tượng tắc cột (dung môi HVTH: Đào Anh Dũng - 41 - không chảy được), khi đó ta phải sử dụng áp suất (áp suất trung bình - MPC, hoặc áp suất cao - HPLC). Tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L), L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách – tức là phụ thuộc vao lượng chất và chất cụ thể. Tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi là Rf, đối với mỗi chất sẽ có Rf khác nhau. Nhờ sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp. Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến nhất là tẩm chất và silicagel rồi làm khô, đến tơi hoàn toàn và đưa lên cột. Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu. Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột : 1. Nhồi cột khô : theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp lên cột khi còn khô, sau đó dùng vật mềm gõ nhẹ lên thành cột mục đích để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để rửa giải. 2. Nhồi cột ướt : theo cách này, chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạt cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết. Khi chuẩn bị cột cần lưu ý không để có bọt khí trong cột (nếu có, sẽ gây ra hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), cột cũng không được nứt, gẫy, dò. Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ chảy quá thấp sẽ kéo dài thời gian, ảnh hưởng nhiều đến tiến độ công việc. HVTH: Đào Anh Dũng - 42 - II.2.3.2 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tích dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở các vị trí khác nhau. Chất hấp phụ thường được sử dụng trong SKLM là silicagel tráng trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Trong quá trình hấp phụ, sẽ xảy ra sự tranh giành giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ, và khi đạt được cân bằng, mỗi chất tan sẽ ở một vị trí khác nhau trên bản mỏng. Để tiến hành sắc ký, chất tan được chấm lên bản thành từng vết chấm nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ dung môi thích hợp trong một bình triển khai kín. Để kiểm tra vết chất có thể sử dụng thuốc thử hiện màu hoặc soi bằng đèn UV. Thuốc thử hiện màu có thể là hơi amoniac hoặc dung dịch acid sunfuric 10%. Để hiện vết người ta nhúng bản vào thuốc thử hoặc phun lên bản mỏng, sau đó hơ bản trên bếp điện hoặc sấy nóng đê vết xuất hiện từ từ. Phương pháp này được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. Một hình thức SKLM khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên là SKLM điều chế, dùng để điều chế, thu chất trực tiếp (thường triển khai khi lượng hợp chất mong muốn là ít). Ở phương pháp này, quá trình thực hiện tương tự SKLM và sau khi triển khai xong, tiến hành soi UV để xác định vết chất rồi cạo lấy lớp silicagel chứa chất cần điều chế, tiến hành rửa giải để thu chất. II.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất [4] Khi đã phân lập được một hợp chất hữu cơ, điều quan trọng là phải xác định được cấu trúc của chúng. Để thực hiện điều này cần phải phân tích bằng nhiều phương pháp kết hợp với nhau. HVTH: Đào Anh Dũng - 43 - Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp. Trong một số trường hợp để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa học, kết hợp với các phương pháp sắc kí so sánh,... II.3.1 Phổ hồng ngoại IR [7] Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng 10.000 ÷ 100.000 cm-1 và biến thành năng lượng của dao động phân tử. Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa trên sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Như vậy phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của 2 dạng năng lượng là năng lượng dao động và năng lượng quay. Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của nguyên tử, liên kết và vào cấu trúc hình học của chúng. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ, dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong nhóm hydroxyl là 3300 ÷ 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl trong khoảng 1700 ÷ 1750 cm-1. II.3.2 Phổ tử ngoại UV-VIS [7] Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến của hợp chất hữu cơ phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Sự hấp phụ ấy gây ra sự chuyển dịch các điện tử từ orbitan ở trạng thái cơ bản lên các orbitan có năng lượng cao hơn ở trạng thái kích thích. Tuy nhiên chỉ có một số dạng cấu trúc trong hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ ấy nên việc ứng dụng phổ UV cũng bị giới hạn trong một số chất mà chủ yếu là các hợp chất có hệ thống nối đôi liên hợp. Đặc điểm của phổ tử ngoại là phổ của một hợp chất phức tạp có thể giống với một chất đơn giản nếu hai chất ấy có cùng một nhóm cấu trúc giống nhau. HVTH: Đào Anh Dũng - 44 - Chính vì thể phổ tử ngoại thường được dùng để xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ một cách sơ bộ II.3.3 Phổ khối lượng MS [7] Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các peak ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc của hợp chất. Hiện nay có rất nhiều các loại phổ khối lượng, phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây : 1. Phổ khối lượng va chạm điện tử EI-MS : dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV 2. Phổ phun mù điện tử ESI-MS : phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là peak ion phân tử và các peak đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ. 3. Phổ bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp FAB-MS : với việc bắn phá nguyên tử nhanh, do đó phổ thu được cũng thường là các peak ion phân tử. 4. Phổ khối lượng phân giải cao HR-MS : cho phép xác định các peak ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao. Ngoài ra hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết hợp với phổ khối lượng khác như : GC-MS (sắc ký khí – khối phổ), LC-MS (sắc ký lỏng – khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu dụng khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược). II.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [7] Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai HVTH: Đào Anh Dũng - 45 - chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lí chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift, δ). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).  Phổ 1H-NMR : trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học δ của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 ÷12 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học δ và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất.  Phổ 13C-NMR : phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một từ trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0 ÷230 ppm. • Phổ DEPT : Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các loại cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135o. Trên phổ DEPT 90o chỉ xuất hiện phổ của các CH. • Phổ 2D-NMR Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác nằm trên đinht các ô vuông trên phổ. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau : HVTH: Đào Anh Dũng - 46 - − Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) : biểu diễn các tương tác trực tiếp H-C. − Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) : đây là phổ biểu diễn các tương tác xa giữa C và H trong không gian phân tử (qua 2 hoặc 3 liên kết). Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. − Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy) : phổ này biểu diễn các tương tác của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân t