Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học của loài ngải cứu (artemisia vulgaris l.) ở thành phố Thái Nguyên

như Bacillus cereus, Eschricha colo, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus. 11 Tinh dầu nhục đậu khuẩn (Elattaria cardimomum) có chứa limonen ức chế rất hiệu quả vi khuẩn propionbacterium acne. Vi khuẩn này gây bệnh viêm cơ, các vết phát ban màu xanh lợt đỏ thấy trên mặt da đầu, bàn tay dẫn đến sưng nặng thường kết hợp với bệnh ung thư bên trong. Ngoài ra, trong một số báo cáo gần đây (2003), cho thấy một số tinh dầu có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư, có hoạt tính kháng HIV. 1.3.3.7. Kháng oxi hóa Sự oxi hóa thường xuất hiện trong thực phẩm để lâu ngày vì trong đó chứa rất nhiều hợp chất bão hòa, và những hợp chất dễ bị oxi hóa bởi oxi không khí. Sự oxi hóa này dễ đưa đến sự hư thối, mất phẩm chất của thực phẩm. Những tinh dầu có chứa các dẫn xuất phenol như hương nhu, đinh hương, sage (hoa xôn), savory (húng), thyme (cỏ xạ hương)... ngoài khả năng chống oxi hóa trong thực phẩm còn có khả năng tiêu diệt vi trùng. Ở Ấn Độ, đã có những nghiên cứu nhận thấy rằng tinh dầu tỏi ức chế sự peroxy hóa lipit, tinh dầu này có chứa dẫn xuất phenol, có khả năng bắt lấy gốc tự do, không cho phản ứng peroxy hóa xảy ra, bảo vệ các lipit [7]. 1.3.3.8. Dược phẩm. Tinh dầu là loại dược phẩm được sử dụng nhiều nhất trong y học cổ truyền. Nhờ có chứa tinh dầu mà một số thảo dược có mùi thơm đặc trưng. Một số loại tinh dầu như: + Tinh dầu bạc hà (Mentha sp.) chứa chủ yếu là hàm lượng mentol, có tác dụng kích thích dây thần kinh gây cảm giác lạnh, giảm đau tại chỗ. + Tinh dầu hương nhu (Ocimum gratissimum) là nguồn cung cấp eugenol. Trong y học, eugenol dùng làm thuốc sát trùng, thuốc giảm đau, chất dùng trong việc trám răng tạm thời. + Tinh dầu thuộc họ hồ tiêu như tinh dầu hồ tiêu được dùng làm thuốc kích thích giúp tiêu hóa tốt, tinh dầu lá lốt, lá ngải cứu dùng làm hương liệu cho các chế phẩm thuốc. 12 + Tinh dầu hương diệp (Pelaeganium roseum) có thành phần chính là geraniol có thể làm thuốc sát trùng, hạ huyết áp...[10]. 1.3.4. Cách sử dụng Liệu pháp tại chỗ (Bôi, mát xa): Sử dụng tinh dầu để bôi: Chỉ có một số loại tinh dầu để bôi được trực tiếp lên da như dầu tràm (Tràm trà: Tea Tree Oil; Tinh dầu tràm gió: Cajeput), tinh dầu oải hương là có thể sử dụng được trực tiếp trên da. Sử dụng tinh dầu để mát xa: Mát xa với tinh dầu là 1 liệu pháp hiệu quả để giảm trừ căng thằng và chăm sóc da. Thường tinh dầu không mát xa trực tiếp được lên da mà phải sử dụng kết hợp với dầu nền (dầu dừa, dầu jojoba, dầu hạnh nhân, dầu thầu dầu...) để pha với nhau mới có thể mát xa trực tiếp được lên da. Tỷ lệ pha trộn: Dầu nền 30 giọt pha với 1 giọt tinh dầu nguyên chất. Liệu pháp hương thơm (hít, xông, khuếch tán, xịt) - Các dùng để hít: Nhỏ 3 đến 5 giọt tinh dầu vào khăn có chất liệu vải cotton để ở nơi mà bạn cần tạo mùi. Tinh dầu sẽ bay hương và lan tỏa những nơi gần đó. - Cách dùng để xông: Vì tinh dầu chỉ bay hơi ở nhiệt độ cao nên phải dùng thêm công cụ đó là đèn khuếch tán tinh dầu (Bằng điện hoặc bằng nến). - Dùng để xịt: Do tinh dầu không tan trong nước chỉ tan trong cồn và dầu nền. Nên muốn làm để xịt thì phải pha với cồn y tế 70 độ hoặc 90 độ. Liệu pháp bên trong (ăn, uống, ngậm...) Các loại tinh dầu chất lượng cao (Tinh dầu trị liệu) hầu hết dùng được bên trong (theo hàm lượng nhất định) Thường tinh dầu nguyên chất không được chỉ định đường uống do tinh dầu nguyên chất rất đậm đặc nên cần phải pha chế theo công thức, liệu lượng chuẩn thì mới đảm bảo an toàn. 13 1.3.5. Tính chất vật lý của tinh dầu Để xác định tính chất vật lý của tinh dầu, thông thường người ta tiến hành xác định các chỉ số như tỷ trọng, chiết suất, tỷ lệ hòa tan trong cồn 90o ở 250oC, nhiệt độ sôi, năng suất quay cực, màu sắc. Hầu hết tỷ trọng của các loại tinh dầu thường nhỏ hơn 1, do vậy chúng thường nhẹ hơn nước. Tuy nhiên, cũng có một vài tinh dầu có khối lượng riêng lớn hơn nước (như tinh dầu quế, tinh dầu đinh hương). Tinh dầu không tan hoặc rất ít tan trong nước nhưng chúng hòa tan tốt trong đa số các dung môi hữu cơ như eter, cồn... Chúng có nhiệt độ sôi khoảng 800o C đến 1500o C, dễ bay hơi và có mùi thơm. Về màu sắc, tinh dầu thường không màu hoặc có màu vàng nhạt. Một số ít tinh dầu có màu (ví dụ: tinh dầu ngải cứu có màu xanh lơ, tinh dầu quế có màu nâu sẫm). Còn mùi và vị của tinh dầu chủ yếu gây ra do các cấu tử bị oxy hóa [9]. 1.3.6. Thành phần chủ yếu của tinh dầu Tinh dầu ở thường ở thể lỏng được tinh chế (bằng cách chưng cất bằng hơi hoặc nước) từ lá cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, hoặc những thành phần khác của thực vật. Bất kỳ một loại tinh dầu nào cũng đều có những thành phần sau [3],[5]: 1.3.6.1. Monoterpenes Tìm thấy trong hầu hết các loại tinh dầu, Monoterpenes có công thức phân tử là C10 H16 mạch hở: Tiêu biểu như là miaxene, oximene, có trong tinh dầu hoa nguyệt quế. Miaxene Oximene 14 Monoterpenes là chất khử trùng và thuốc bổ trong tự nhiên. Chúng lọc không khí tốt. Monoterpenes có mặt trong hầu hết các loại tinh dầu. 1.3.6.2. Sesquiterpene Mặc dù không phải là chất dễ bay hơi như Monoterpenes, các sesquiterpene mạch thẳng và vòng tiêu biểu là farnesene, Zingiberene (tinh dầu gừng) Farnesene Sesquiterpene có khoảng 15 nguyên tử carbon trong đó. Và có tác dụng làm dịu, chống viêm và chống nhiễm trùng. 1.3.6.3. Phenol Một số chất phenol trích từ các loại tinh dầu như: Thymol, Estragol, Eugenol, Thymol Estragol Eugenol Các chất khử trùng hầu hết có trong thực vật, kích thích cơ thể, phenol có tác dụng khi sử dụng với liều lượng nhỏ. Tuy nhiên, liều lớn có thế là một chất độc cho hệ thần kinh và có thể gây kích ứng da . 1.3.6.4. Ancol Một số ancol quan trọng trích từ tinh dầu thường gặp như: menthol, α- terpineol, geraniol Menthol α- Terpineol Geraniol 15 Rất nhiều ancol cùng có mặt trong các loại tinh dầu. Làm chất sát trùng, kháng khuẩn, chống nấm và thuốc kháng sinh, thuốc bổ rất tốt cho hệ thần kinh và kích thích phản ứng miễn dịch trong cơ thể. 1.3.6.5.Este Các este bốc hơi nhanh và tạo độ ngát cho hương. Một số este có trong tinh dầu: etyl anthranilate, benzyl, acetat, Etyl anthranilate Benzyl acetat Este có tính chất chống co thắt, kháng khuẩn và chống viêm, dùng este nhẹ nhàng trên da sẽ giúp đỡ trong việc tái cân bằng của hệ thần kinh có hiệu quả. 1.3.6.6. Aldehyt Trong tinh dầu có rất nhiều aldehyt, song hiện nay các aldehyt đều thu được qua tổng hợp hóa học. Chỉ có aldehyt như aldehyt cuminic, citral và citronellal được ly trích từ nguyên liệu tự nhiên. Andehyt cuminic (Z)-Citral (neral) (E)-Citral (geranial) Citronellal 16 Aldehyt chống viêm, có tính chất tương tự như ancol. Tuy nhiên, lượng aldehyt có thể gây ra kích thích lớn cho da và các màng nhầy. 1.3.6.7. Các hợp chất khác Ngoài các hợp chất nói trên, trong các loại tinh dầu còn có các hợp chất thuộc nhóm oxit như: (eucalyptus) và các aminoaxit (axit antranilic), các lacton (coumarin, ambretolit), các hợp chất có lưu huỳnh như: (anlylisosulfocyannat), hợp chất có nitơ (metyl antranilat). 1.3.7. Kiểm định và cách bảo quản tinh dầu Kiểm định: - Để kiểm tra tinh dầu có tự nhiên hay không, chúng ta hãy làm một thử nghiệm nhỏ dưới đây. Nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy trắng và để khô. Nếu thấy sinh ra một vòng dầu loang bao quanh thì đó không phải là tinh dầu nguyên chất. - Tinh dầu có nguồn gốc đầy đủ tự nhiên nên mùi hương dễ chịu, không nồng, khi ngửi thấy sảng khoái. - Độ nhớt của tinh dầu hhi chúng ta nhỏ tinh dầu từ ống nhỏ giọt chuyên dụng mà thấy tốc độ nhỏ giọt khá chậm thì đó là tinh dầu chất lượng tốt. Cách bảo quản tinh dầu thiên nhiên: Tinh dầu nên được bảo quản trong lọ thủy tinh kín và tối màu ở nhiệt độ mát mẻ, tránh anh sáng mặt trời trực tiếp. Hầu hết các loại tinh dầu có thể được sử dụng một cách an toàn trong 1-2 năm trở lên sau khi mở nắp. 1.4. Tổng quan về flavonoid 1.4.1.Đại cương Flavonoid là những chất màu thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa.. Phần lớn các flavonoid có màu vàng (do từ flavus : nghĩa là màu vàng), tuy vậy một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu vì chúng có khung sườn căn bản, có cấu trúc cơ 17 bản kiểu C6-C3-C6, trong đó C6 là một vòng benzen gắn với C3 (I). Cấu trúc có thể là một vòng kín hoặc mở. Khung sườn của flavonoid Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do đã thay thế một phần, vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính acid. Các polyphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxy để tạo thành các phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các oza (dạng glycozid) hoặc protein. Các flavonoid thường rễ kết tinh và thường có màu. Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam ; flavonol có màu vàng đến vàng nhạt ; chalcol có màu vàng đến cam đỏ. Các isoflavon, flavanon, flavanonol, catechin kết tinh không màu. Autocyanidin thường hiện diện ở dạng gucosid (pelargonidin, cyanidin. ) màu xanh dương, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái. 1.4.2. Vai trò của flavonoid trong cây 1.4.2.1. Các nhóm phenol của flavonoid có vai trò trong sự hòa tan các chất và di chuyển rễ dàng qua các màng sinh lí. Một số flavonoid có tác dụng như những chất chống oxi hóa, bảo vệ acid ascocbic, là thành phần quan trọng trong tế bào thực vật. Một số có tác dụng ức chế các enzym và các chất độc của cây. 18 1.4.2.2. Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng ức chế và kích thích sinh trưởng cây của flavonoid. Nhóm chức -OH có vai trò quết định về tác dụng này. Ví dụ trong cây ổi, các flavonoid có nhóm OH ở vị trí 4’ làm tăng cường hoạt tính của các enzym trong khi các flavonoid có nhóm 3’ lại có tính ức chế. Flavonoid còn tham gia vào quá trình hô hấp, quang hợp. 1.4.2.3. Vai trò tạo màu sắc Flavonoid đóng vài trò tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, góp phần thúc đẩy sự sinh tồn của cây và phát triển hoa, quả. Các flavon, flavonol, auron, chalcon cho màu vàng trong khi các autoxyannin cho các màu hồng, đỏ, tím hoặc xanh thẫm. 1.4.2.3.Vai trò bảo vệ cây Một số flavonoid không màu có trong lá đóng vai trò 1 chất bảo vệ cây, cản trở đối với động vật ăn cỏ. Vị đắng và khó chịu của flavonoid làm cho động vật khi ăn phải có cảm giác mất ngon và không thích ăn loại cây này. Quecetin với nồng độ thấp đã có cảm giác mất ngon, nhưng với liều 0,2% sẽ ức chế sự bài tiết của nước bọt. 1.4.3.Vai trò của flavonoid trong y học Powera (1964) đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của 24 loại flavonoid trên 10 chủng vi khuẩn. Hầu hết các flavonoid đều ức chế hô hấp và sự tái sinh sản ở nồng độ 1- 2 micro mol trong môi trường có glucoza. Với 24 chất thử thì không có chất nào không có tác dụng dưới 9 trong số 10 vi khuẩn thử. Trong chương trình sàng lọc chất tác dụng với khối u đã phát hiện một số flavonoid có tác dụng với một số dạng ung thư. Eupatin (II) và Eupatoretin (III) (Kupechan, 1969). Centaureidin (IV) (Kupelian và Bauerachmidt, 1971) đều có tác dụng đối với carcinoma của ung thư vòm họng. 19 Tác dụng này có liên quan đến cấu trúc của flavonoid. Thực nghiệm cho thấy các flavonoid có nhóm OH tự do ở vị trí 3’, 4’ có tác dụng tốt đối với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch. Rutin là chất tiêu biểu về tác dụng này. (II) Eupatin: R=H (IV) Centaureidin (III) Eupatoretin: R=Me Hiện tượng xẩy thai của Cừu ở Úc là một vấn đề lớn đã được nghiên cứu ở nước này. Nguyên nhân chủ yếu gây ra hiện tượng này là cừu ăn phải một loại cây (Trifolium có một chất isoflavon là genistein (V) với hàm lượng 0,7% trong lá (Brabdury và White, 1951). Trên thực nghiệm chất này có tác dụng estrogen trên chuột nhắt. (V) Genistein 1.4.4. Phân loại Dựa trên khả năng oxi hóa vòng pyran trung tâm để phân loại flavonoid. 1.4.4.1. Flavone Flavone có cấu trúc 2 vòng benzen A và B. Vòng B gắn vào vòng C (pyran) qua dây nối ở C2 (VI) 20 Khung sườn của flavonoid Flavone thường gặp nhất là Apigenin (VII) và Luteolin (VIII) VII) Apigenin (VIII) Luteolin Đã biết khoảng 130 hợp chất flavon ( Mabry,1975) ở dạng tự do cũng như glycozid). 1.4.4.2. Flavanon Khác với flavon là flavanon thiếu dây nối ở C2 và C3 (IX). Tất cả flavanon phát hiện cho đến nay đều có nhóm OH ở vòng A hoặc B. Trong tự nhiên chúng thường có bên cạch flavon tương ứng, có nhiều trong các họ Rosacoase, Rutaceac, Leguminoeac, Asteraceac. Ba chất tiêu biểu là Naringin (X), prunin (XI), Heaperidin (XII). (IX) Cấu trúc chung của flavanon (X) Naringin 21 (XI) Prunin (XII) Heaperidin 1.4.4.3. Flavonol Khác với flavon là có thêm nhóm –OH ở vị trí C số 3 (XIII). (XIII) Flavonol rất phổ biến trong tự nhiên. Ba chất quan trọng nhất thường gặp là Kaempferol (XIV) Quecxetin (XV) và Mirixetin (XVI). Đặc biệt có nhiều trong thực vật hạt kín. (XIV) (XV) (XVI) Thống kê trên 1000 loài thuộc thực vật hạt kín thì có 48% loài có Kaempferol và 26% Quecxetin và 10% là Mirixetin trong tống số loài có flavonol. 22 1.4.4.4. Dihydroflavonol Cấu trúc cơ bản giống flavonol nhưng không có nối đôi ở C2-C3 (XVII). Còn gọi là 3-hydroxyflavonol hoặc flavanonol. Chất phổ biến và đơn giản nhất là - hydroxyflavonol (XVIII). (XVII) (XVIII) Thường gặp chúng ở các họ Leguminaceae, Rutaceae, Moraceae. 1.4.4.5. Chalcon Là flavonoid vòng mở, 2 nhân thơm kết hợp nhau qua 1 dãy 3 cacbon  , - không bão hòa (XIX). Trong tự nhiên, chalcon đều có nhóm -OH ở vòng A hoặc B là chất tạo ra màu vàng tươi của nhiều loại hoa. Ngoài ra còn có ở trong gỗ 1 số loài như Acacta Chất chalcon phổ biến nhất là butein (XX). (XIX) (XX) 23 1.4.4.6. Đihydrochalcon Là chalcon mất nối đôi  , . Loại này có ít trong tự nhiên. Thường gặp trong họ rosaceae, fagaceae, saluceae. Chất tiêu biểu là phloridzin (trong quả táo) (XXI). (XXI) Về cấu trúc, nhóm này khác các flavonoid khác ở chỗ không có nhóm cacbonyl ở C4 và luôn luôn có các nhóm oza gắn vào OH. Các oza phổ biến là glucoza, galactoza, azabinoza, fructoza. Sau khi thủy phân chúng cho các antoxyanin tương ứng. Có 3 nhóm antoxyanin là pelargonidin màu vàng cam hoặc hồng (XXII), xyanidin màu hồng xỉn (XXIII) và deltinidin màu đỏ hoặc tím (XXIV). (XXII) (XXIII) (XXIV) 1.4.4.8. Leucoantoxyanidin Là 3,4-điol flavan (XXV) không màu. Nhưng gặp acid biến thành antoxyanin có màu hồng hoặc đỏ rất phổ biến trong cây nhất là trong vỏ cây và gỗ. 24 (XXV) 1.4.4.9. Isoflavon Là nhóm isoflavonoid phổ biến nhất và có nhiều giá trị về tác dụng chữa bệnh. Ví dụ: Daidzein (XXVI) hoặc Formonometin (XXVII) có trong cam thảo (glycyrrhiza glabra). (XXVI) Daidzein: R1=R2=H (XXVII) Formonometin: R1=H; R2= Me 1.4.4.10. Rotenoit Nhóm hợp chất này có cấu trúc cơ bản của hệ thống croman. Croman là dẫn xuất của isoflavanon. Đã biết được khoảng 15 chất rotenoit. Trong đó quan trọng nhất là Rotenon (XXVIII) (Mabry 1975). Tác dụng chủ yếu của hợp chất này là diệt sâu bọ. (XXVIII) 25 1.4.4.11. Neoflavonoid Thuật ngữ Neoflavonoid dùng để chỉ một nhóm hợp chất có khung cơ bản 4- aril eroman (XXIX) chất đầu tiên phân lập được là calophyloit (XXX) chiết từ hạt cây Mù u (calophyllum inophyllum và một số loài calophyllum khác, họ Guttiferne (Ormancey Potier 1951). (XXIX) (XXX) 1.4.4.12. Biflavonoid Harbrne (1967) xem các Biflavonoid như các đime của Apigenin, có 6 nhóm Biflavonoid, ví dụ nhóm Biflavon và Flavanonyl- flavon được gọi là nhóm Agathin flavon (XXXI). (XXXI) 26 CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tương nghiên cứu là thân lá cây ngải cứu non mẫu tươi và mẫu khô, thu hái vào tháng 10 năm 2017 tại phường Tân Lập thành phố thái Nguyên. 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Hóa chất - Ethanol, n-hexane, ethyl acetate, chloroform, H2SO4 đậm đặc, acid acetic, chì acetate, FeCl3, chloroform, dung dịch NaOH,.đều là các hóa chất tinh khiết. - Sắc ký bản được sử dụng bản mỏng từ silicagel 60 F254 tráng trên lá nhôm của hãng Merck (Đức). - Silicagel cỡ hạt 0,04-0,06 mm. - Thuốc thử hiện vết trên bản mỏng: CeSO4 pha trong Mo(SO4)2. 2.2.2. Thiết bị - Cân phân tích đọ chính xác 10-4, tủ sấy. - Máy cất quay chân không Buchi, thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước. -Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy theo phương pháp mao quản trên máy Spectrum two Berlin Elmer tại Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NRM, HSQC và HMBC được đo trên máy Bruker Avance – Đức 500MHz tại Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Quốc gia Việt Nam. 27 2.3. Phương pháp định tính các chất trong dịch chiết [2] 2.3.1. Định tính flavonoid Cân khoảng 10g thân lá ngải cứu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90o. Đun cách thủy khoảng 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau: a. Phản ứng Cyanidin Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm một ít bột magnesium kim loại (khoảng 10mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt). Để yên một vài phút, nhận thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu hồng là phản ứng dương tính [2]. b. Phản ứng với kiềm Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đậm đặc mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng thấy màu vàng của vết đậm lên rõ rệt là phản ứng dương tính. Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, thấy dịch chiết chuyển từ vàng sang vàng đậm, khi đun nóng thấy xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính [2]. c. Phản ứng với FeCl3 Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa xanh đen. d. Phản ứng diazo hóa Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH, thêm vài giọt dung dịch diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút thấy xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính [2]. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa flavonoid. 28 2.3.2. Định tính cumarine Lấy khoảng 5g thân lá ngải cứu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90o. Đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua bông. Dịch lọc thu được làm các phản ứng sau: a. Phản ứng mở vòng lacton Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết: Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2 để nguyên. Đun cả 2 ống nghiệm sôi. Để nguội rồi quan sát. Ống 1: Có tủa đục Ống 2: Trong suốt Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất, lắc đều, đều thấy: Ống 1: Trong suốt Ống 2: Có tủa đục Acid hóa bằng cách cho thêm 1 giọt HCl đặc, ống 1 sẽ lại đục như ống 2 là phản ứng dương tính. b. Phản ứng Diazo hóa Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi, sau đó để nguội. Thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha. Thấy trong ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch là phản ứng dương tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa cumarine. 2.3.3. Định tính saponine a. Quan sát hiện tượng tạo bọt Cho vào ống nghiệm 0,1g bột ngải cứu, thêm 5ml nước cất. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát thấy hiện tượng tạo bọt bền vững sau 15 phút. 29 b. Phản ứng phân biệt Saponin steroid và Saponin triterpenoid Lấy 1g bột ngải cứu cho thêm 5ml cồn đun sôi cách thủy trong 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống nghiệm thứ nhất 5ml HCl 0,1N (pH=1) và ống thứ hai 5ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2 - 3 giọt dung dịch chiết cồn bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15s. Để yên thấy ống nghiệm cột acid có cột bọt cao hơn ống còn lại là phản ứng âm tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa saponine. 2.3.4. Định tính alkaloid Cho khoảng 1g bột thân lá ngải cứu vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun đến sôi. Để nguội. Lọc dung dịch. Kiềm hóa dung dịch bằng dung dịch NH3 ( đến pH=9 - 10). Chiết alcaloid base bằng chloroform (2 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng Na2SO4 khan, sau đó dùng để làm phản ứng định tính. Ống 1: Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer không thấy xuất hiện kết tủa trắng là phản ứng âm tính. Ống 2: Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện kết tủa nâu là phản ứng âm tính. Ống 3: Nhỏ 2 - 3 thuốc thử Dragendorff, không thấy xuất hiện kêt tủa đỏ cam là phản ứng âm tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa alkaloid. 2.3.5. Định tính tanine Cho vào ống nghiệm 2g thân lá ngải cứu, thêm 10ml nước cất, đun sôi trong 5 phút. Để nguội, lọc lấu dịch lọc. Dịch lọc để định tính. a. Ống 1: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% thấy xuất hiện kết tủa màu xanh nâu nhạt là phản ứng dương tính. 30 b. Ống 2: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch chì acetate 10% thấy xuất hiện kết tủa bông là phản ứng dương tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa tanine. 2.3.6. Định tính glycosid tim Lấy 3g thân lá ngải cứu, chiết soxhlet với n- hexane 1giờ. Bã sấy khô, cho vào bình cầu đun hồi lưu với ethanol 40% trong 1 giờ. Gạn lấy dịch chiết, thêm 3ml dung dịch chì acetate 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử đến khí dịch chiết không còn kết tủa với chì acetate. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn lắc kỹ với hốn hợp chloroform: ethanol tỉ lệ 4:1(3 lần, mỗi lần 5ml), gạn lấy lớp chloroform. Chia dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thủy cho đến khô dung môi. a. Phản ứng khung steroid Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trê 1ml anhydrit acetic hòa tan cắn. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống nghiệm 0,5ml H2SO4 đậm đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Không nhận thấy mặt tiếp xúc giữa hai mặt chất lỏng có màu đỏ tím là phản ứng âm tính. b. Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh - Phản ứng Baljet Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) mới pha. Không thấy xuất hiện màu đỏ cam là phản ứng âm tính. - Phản ứng Legal Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Phản ứng thấy xuất hiện màu đỏ cam là phản ứng âm tính. 31 c. Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy: Phản ứng Keller – Kiliani Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng không có màu tím đỏ là phản ứng âm tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa glycosid tim. 2.3.7. Định tính đường khử Lấy khoảng 2g thân lá ngải cứu, thêm 5ml cồn 90o, đun cách thủy 10 phút, lấy dịch lọc. Cho1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B, đun sôi cách thủy. Thấy không có kết tủa đỏ gạch là phản ứng âm tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa đường khử. 2.3.8. Định tính acid amin Cho 1g thân lá ngải cứu vào ống nghiệm, thêm 5ml nước cất. Đun sôi trực tiếp trong 10 phút, lọc nóng. Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt Ninhydrin 3% đun cách thủy sôi 10 phút thấy xuất hiện kết tủa tím đậm là phản ứng dương tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa acid amin. 2.3.9. Định tính polysaccharide Chuẩn bị dịch chiết như acid amin. Chuẩn bị 3 ống nghiệm: Ống 1: 4ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 2: 4ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol Ống 3: 4ml dịch chiết Thấy ống 1 có màu đậm hơn ống 2 và ống 3 là phản ứng dương tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa polysaccharide. 32 2.3.10. Định tính chất béo Lấy khoảng 5g thân lá ngải cứu cho vào bình nón 50ml. Đổ ngập ether dầu hỏa. Đun cách thủy 15 phút, lọc lấy dịch để làm phản ứng. Nhỏ 1 giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi, không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc là phản ứng âm tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu không chứa chất béo. 2.3.11. Định tính sterols Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn bằng 1ml anhydrit acetic, lắc cho tan cắn. Nghiêng ống nghiệm 45o cho từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm. Thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp trên có màu xanh lá là phản ứng dương tính. Kết luận sơ bộ: Thân lá ngải cứu chứa sterols. 2.4. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước (tách tinh dầu) [8] 2.4.1. Xử lý nguyên liệu - Mẫu nghiên cứu là thân và lá ngải cứu non được thu hái tại cùng một địa điểm và cùng khoảng thời gian, đem rửa sạch rồi để ráo nước, sau đó đem đi cân chính xác 500g/ mẫu rồi cho vào túi polyetylen buộc kín để hạn chế sự xâm nhập của không khí. Rồi bảo quản nguyên liệu ở nhiệt độ 5-100C cho đến khi nghiên cứu. 33 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết tách tinh dầu cây Ngải cứu 2.4.2. Khảo sát y