Luận văn Nghiên cứu tích hợp một số gen kháng bạc lá và kháng đạo ôn vào giống lúa BC15 phục vụ công tác chọn tạo giống

ăng năng suất cao hơn giống Bắc thơm 7, chống chịu tốt, kháng đạo ôn và chống chịu sâu, được đặt tên là dòng NB-01. Hiện nay, các trình tự SSR vẫn là một nguồn dấu chuẩn ADN quan trọng trong phân tích di truyền và chọn giống lúa, nhưng các đa hình đơn nucleotit (SNPs) sẽ trở thành một nguồn dấu chuẩn di truyền thường gặp nhất của đa hình ADN. Việc tập hợp thông tin về SNPs sẽ giúp chúng ta trong việc lập kế hoạch cho chương trình chọn giống kháng đạo ôn và phát hiện tái tổ hợp xảy ra giữa các khối haplotype (các cá thế có SNPs). Để có được số lượng SNPs đủ cho mục tiêu này, chúng ta phải giải trình tự toàn bộ hệ gen của các giống đại điện để xây dựng được một cơ sở dữ liệu dựa trên các SNPs toàn bộ hệ gen để chọn lọc các SNPs và xác định tần số SNPs trong quần thể. Dữ liệu SNPs đầy đủ của hệ gen sẽ tạo điều kiện cải tiến khả năng kháng đạo ôn của cây lúa một cách hiệu quả khi kết hợp với hệ thống chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS). 1.5. ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA Marker phân tử đã trở thành công cụ quan trọng cho phân tích di truyền và cải tiến cây trồng. Có nhiều chỉ thị phân tử (RFLP, RAPD, AFLP, ISSR, SSR, EST, CAPS, và SNP) đã được phát triển và ứng dụng trong chọn tạo một số cây trồng (Doveri và cs. 2008 [51]). Chúng đều có những ưu, nhược điểm nhất định. Tuy nhiên, một số chỉ thị phân tử vẫn được sử dụng rộng rãi 25 trong chọn tạo giống cây trồng có sự hỗ trợ bởi các kỹ thuật như MAS và MABC. 1.5.1. Ứng dụng phương pháp chọn lọc nhờ sự hỗ trợ của marker trong chọn tạo giống lúa (Marker Assisted Selection – MAS) MAS được cho là chỉ thị phân tử liên kết với các locut đích để thay thế cho việc sàng lọc theo kiểu hình. Bằng cách xác định alen của chỉ thị phân tử, cây trồng có chứa các gen đặc hiệu hoặc các QTL có thể được xác định dựa trên kiểu gen chứ không cần xác định theo kiểu hình. Các ưu điểm nổi trội của MAS đó là: - Có thể được áp dụng để tiến hành chọn lọc ở giai đoạn phát triển đầy của cá thể, do đó rút ngắn được thời gian chọn lọc; - MAS không chịu tác động của các điều kiện môi trường; - MAS giúp hỗ trợ hiệu quả việc chọn lọc các alen lặn quy định tính trạng mong muốn; - MAS giúp tăng cường hiệu quả của việc quy tụ nhiều gen mong muốn vào một giống/dòng mới; - Tùy thuộc vào từng tính trạng, MAS có thể có giá thành rẻ hơn và dễ thực hiện hơn so với hình thức chọn lọc truyền thống; Tuy nhiên việc sử dụng MAS cũng có một vài hạn chế sau: - Chi phí cho MAS có thể cao hơn các kĩ thuật truyền thống; - Sự phân ly và tái tổ hợp giữa chỉ thị và gen cần qua tâm có thể xảy ra dẫn đến việc chọn lọc không chính xác. Nhược điểm này có thể được hạn chế bằng cách sử dụng cùng lúc hai marker nằm ở hai phía của gen cần quan tâm; - Việc sử dụng một số marker trong quá trình chọn giống rất phức tạp, vì vậy các marker này cần được cải tiến thành dạng dễ sử dụng hơn cho các nhà chọn giống; - Việc ước lượng không chính xác vị trí của QTL và mức độ tác động một QTL đối với tính trạng mong muốn có thể làm kéo dài thời gian chọn lọc; 26 - Marker phát triển cho MAS ở một quần thể có thể không thể sử dụng được ở quần thể khác. Tuy nhiên, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu chọn tạo giống bằng MAS vẫn bị hạn chế do tác động của phân ly tái tổ hợp, chỉ thị phân tử và gen không còn liên kết với nhau trên một nhiễm sắc thể. Khi đó việc chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả không chính xác. Để loại bỏ tác động của hoạt động phân ly tái tổ hợp, có thể sử dụng các chỉ thị chức năng là những chỉ thị nằm trên gen kháng, khi đó sự biểu hiện của chỉ thị có thể đảm bảo sự có mặt của gen kháng trong cá thể. Ngoài ra có thể sử dụng kết hợp 2 chỉ thị nằm ở hai phía của gen kháng trong quá trình chọn lọc. Sự có mặt của hai chỉ thị này trong cùng một cá thể sẽ giúp tăng đáng kể hiệu quả chọn lọc. Chính vì vậy, việc phân tích genome, xác định chính xác vị trí, trình tự gen để thiết kế các chỉ thị chức năng là những chỉ thị nằm trong hoặc ngay 2 đầu gen đích có thể loại bỏ tác động của sự phân ly tái tổ hợp, làm tăng đáng kể hiệu quả chọn lọc cá thể mang gen kháng phục vụ công tác lai tạo giống (Miah và cs., 2013 [52]).  Ứng dụng MAS trong quy tụ gen chọn tạo giống lúa trên thế giới Các gen kháng khác nhau sẽ tạo ra tính khác đối với các chủng hay nòi gây bệnh khác nhau, vì vậy việc quy tụ gen được coi là một giải pháp khả thi để cải thiện độ bền vững của tính kháng. Quá trình tập hợp nhiều gen vào một giống lúa có thể được tiến hành hiệu quả hơn nhờ sử dụng MAS. Sử dụng MAS trong quá trình quy tụ gen giúp đồng thời chọn lọc nhiều gen cũng như hạn chế việc tiêu tốn thời gian vào việc lây nhiễm các chủng/nòi bệnh khác nhau ở các khoảng thời gian khác nhau. Các dòng mang hai, ba và 4 gen kháng đã được phát triển và các dòng mang nhiều gen quy tụ này có phổ kháng rộng hơn và mức độ kháng cao hơn các dòng đơn gen. Sanchez và cs. (2000) [53] tiến hành chuyển ba gen kháng bạc lá là xa5, xa13 và Xa21 vào ba dòng lúa triển vọng nhưng mẫn cảm với bạc lá là IR65598-112, IR65600- 42, and IR65600-96 nhờ sử dụng các marker STS. Các dòng đẳng gen thế hệ BC3F3 có nhiều hơn một gen kháng bạc lá và biểu hiện tính kháng mạnh hơn và phổ kháng rộng hơn đối với các chủng Xoo. Độ chính xác trong chọn lọc 27 các cá thể kháng đồng hợp đối với 2 gen xa5 và xa13 ở hai quần thể là 95% và 96%. Một thí nghiệm quy tụ gen với sự hỗ trợ của marker phân tử khác là thí nghiệm quy tụ 3 gen đã đề cập ở trên vào giống lúa PR106 được trồng phổ biến ở Ấn Độ do Singh và cs. (2001) [31] thực hiện. Thử nghiệm đồng ruộng đối với các dòng mang gen quy tụ ở Philipin và Ấn Độ đã cho thấy tính kháng bạc lá tăng cường của các dòng này so với các dòng đơn gen kháng. Nhiều thử nghiệm kết hợp nhân giống ở cấp độ phân tử và chuyển gen thực vật đã được tiến hành nhằm cải tiến các dòng lúa ưu việt. Narayanan và cs. (2002) [54] đã tập hợp ba gen kháng chính là Pi-1, Piz-5 và Xa21 vào dòng lúa Co39 và hai gen kháng chính là Pi-5 và Xa21 vào dòng lúa IR50 nhờ sử dụng kết hợp MAS và phương pháp chuyển gen để tạo ra tính kháng bệnh bạc lá và khô vằn. Ở giai đoạn đầu tiên, các dòng kháng bạc lá được tạo ra nhờ 4 vòng lai trở lại kết hợp chọn lọc bằng marker phân tử. Ở giai đoạn thứ hai, các dòng kháng được chuyển gen Xa21. Ở một nghiên cứu khác, Datta và cs. (2002) [55] đã áp dụng MAS để tạo ra giống lúa IR72. IR72 được chọn tạo từ phép lai giữa hai dòng lúa chuyển gen mang các gen kháng khác nhau như gen kháng bạc lá - Xa21, gen kháng sâu đục thân lúa hai chấm - Bt, gen chống chịu bệnh khô vằn - chitinase gen. Giống lúa này biểu hiện tính kháng bền vững với phổ kháng bệnh và côn trùng rộng. Trong nghiên cứu này, các gen chuyển được sử dụng như những marker STS để tạp ra các dòng quy tụ đồng hợp tử một cách nhanh chóng. Jiang và cs. (2004) [56] quy tụ gen Xa21 kháng đạo ôn và một gen Bt liên hợp (cry1Ab/cry1Ac) qui định tính kháng với côn trùng bộ cánh vảy vào một dòng lúa phục hồi Minghui63. Các thử nghiệm đồng ruộng chỉ ra rằng con lai của dòng quy tụ này với dòng bất dục tế bào chất “Zhenshan 97A” và “Maxie A” có khả năng giữ vững năng suất mà không cần sử dụng thuốc bảo vệ thực vật. Với sự trợ giúp của marker STS và SSR cho gen Xa21 và gen waxy. Năm 2009, Y Jia đã lai giống lúa Japonica nhiệt đới Katy chứa gen kháng đạo ôn Pi-ta và giống lúa Japonicaôn đới M202(Pi-ta) đã được lây nhiễm với chủng IB49 của Magnaportheoryzae mà chứa Pi-ta. Con lai kháng được xác định bằng cách lai hồi quy qua năm thế hệ. Mỗi thế hệ, con lai 28 kháng đã được lựa chọn sử dụng một chủng nấm có chứa AVR-Pita, và lai với giống bố mẹ M202 dễ bị nhiễm. Hai con lai trong số 22BC5F1 được xác định kiểu gen bằng cách sử dụng 12 marker SSR xung quanh vùng genome của Pi- ta trên nhiễm sắc thể 12. Nhóm nghiên cứu đã kiểm tra kích thước của gen đưa vào trong 43 con lai BC5F2bằng cách sử dụng các marker SSR. Kết quả đã chứng minh rằng, một loạt cáckích cỡ của ADN liên kết với thể cho đã được đưa vào giống bố mẹ hồi quy M202 và các giống ưu tú,còn ADN không được liên kết với thể cho đã bị loại bỏ khỏi cá thể BC5F2.Tuy nhiên,kích thước các đoạn xung quanh bộ gen Pi-ta khác nhau giao động từmột nửa (14Mbp) đến toàn bộ nhiễm sắc thể(27Mbp) đã được tìm thấy từ thể cho.Tương tự như vậy, các phân đoạn lớn của các kích thước có thể so sánh của vùng genome Pi-ta có nguồn gốc từ giống Tetep của Việt Nam,cũng được nhận biết trong Pi-ta của các giống lúa ở Mỹ như: Katy, Madison, Kaybonnet và Drew. Tetep có nhiễm sắc thể 12 giống hệt với giống Tadukan của Philippines. Nghiên cứu nàychứng tỏ rằng, một tỷ lệ lớn của nhiễm sắc thể được duy trì bởi sự chọn lọc nhân tạo đối với tính kháng đạo ôn trong quá trình chọn giống. Năm 2013, Singh và cộng sự đã lai tạo giống lúa Pusa1609 mang hai gen kháng đạo ôn Piz5 (từ giống C101A51) và gen Pi54 (từ giống Tetep) với nền di truyền là PRR78, một dòng lúa lai ưu tú của Basmati, bằng phương pháp lai hồi quy và sử dụng marker phân tử trong chọn lọc. Các dòng cho gen (C101A51, và Tetep) được lai riêng rẽ với dòng nhận gen (PRR78), các con lai ưu tú được chọn lọc và lai trở lại đến thế hệ BC2F1. Các con lai này được lai chéo với nhau tạo ra thế hệ F1, rồi cho tự thụ, và chọn lọc đến F5 để tạo ra dòng đồng hợp về hai gen Piz5 và Pi54 mang nền di truyền của giống bố mẹ (91,6%).Kết quả là dòng lai này đã cải thiện được tính kháng đạo ôn của dòng bố mẹ (PRR78) trong cả điều kiện lây nhiễm nhân tạo và điều kiện tự nhiên (trong vùng nhiễm bệnh). Fatah A. Tanweer và cs (2015) [10] đã sử dụng phương pháp MABC (marker-assisted backcrossing) tích hợp hai gen Pikp và Pib vào giống lúa MR219, giống lúa nhiễm bệnh đạo ôn của Malaysia. Tác giả đã chọn lọc được 29 15 dòng mang gen đồng hợp cả hai gen Pib và Pikh có nền di truyền hơn 95% của giống MR219, năng suất cao và chất lượng tương đương giống MR219. Kết quả đóng vai trò uan trọng trong việc duy trì sản xuất lúa gạo ở Malaysia. Năm 2016, Ellur [57] và cộng sự đã lai tạo và tích hợp được 2 gen kháng đạo ôn (Pi2 và Pi54) từ hai dòng cho gen và 2 gen kháng bạc lá (xa13 và Xa21) từ dòng cho gen P1460 vào nền di truyền của Pusa Basmati (PB1121) và Pusa Basmati 6. Nghiên cứu cho thấy các chỉ thị SNP là tốt hơn cho việc chọn lọc nền di truyền so với các chỉ thị SSR, do độ bao phủ toàn hệ gen của các chỉ thị SNP. Dòng tích hợp các gen kháng đạo ôn và bạc lá này có khả năng chống chịu tốt và cho năng suất cao khi đánh giá ở nhiều vùng khác nhau. Hai gen kháng Pi64, Pita của giống H4 được tích hợp vào giống Hang- Hui-179 (HH179) bằng phương pháp MABB (marker-assisted backcross breeding). Kết quả đã tạo được ba dòng, R1791 mang gen Pi64, R1792 mang gen Pita, R1792 mang gen Pi46, R1793 mang hai gen Pi46 và Pita. Khả năng kháng bệnh của ba dòng ở giai đoạn mạ tương ứng là 91.1, 64.7 và 97.1%, cao hơn rõ rệt so với HH179 (23,5%). R1793 biểu hiện tính kháng đạo ôn bông nhưng R1791 và R1792 không biểu hiện tính kháng ở cả hai giai đoạn mạ ( đạo ôn hại lá) và giai đoạn vào chắc (đạo ôn bông). Kết quả thể hiện việc tích hợp hai gen Pi64 và Pita làm tăng sức đề kháng hơn so với việc tích hợp từng gen đơn lẻ của dòng/giống (Xiao at al, 2016 [58]). Abhilash Kumar V, 2016 sử dụng phương pháp MABB quy tụ đa gen bạc lá và đạo ôn Xa21, xa33, Pi2 vào 10 dòng đạt các chỉ tiêu nông sinh học tốt hơn giống nền nhận gen ban đầu. Chaipanyaet và cộng sự, 2017 đã tạo ra các dòng lúa monogenic chứa QTL1 (QTL1-C) và QTL11 (QTL11-C) trên nền di truyền của giống CO39 thông qua lai với giống cho gen kháng. Phân tích “cluster” trên cơ sở phản ứng bệnh của QTL1-C và QTL11-C, kết hợp với các dòng lúa IRBLs, cho thấy: hai dòng monogenic ấy được xếp vào cùng nhóm di truyền với IRBLsh- S (Pish) và IRBL7-M (Pi7), theo thứ tự. Thêm vào đó, phân tích chuỗi trình tự cho thấy gen Pish và Pi7 được gắn vào trong vùng QTL1 và QTL11 – quãng giữa phân định ranh giới genomic, theo thứ tự. Nghiên cứu kết luận 30 rằng QTL1 và QTL11 có thể mã hóa các alen của Pish và Pi7, ký hiệu là Pish-J và Pi7-J, theo thứ tự. Muốn minh chứng giả định nói trên, các vùng genomic của gen Pish-J và Pi7-J được người ta dòng hóa (cloned) và giải trình tự. So sánh chuỗi trình tự protein của các gen Pish-J và Pi7-J cho thấy có sự đồng nhất với Pish và Pi7, theo thứ tự. Phổ kháng bệnh chính của giống lúa JHN đã được tìm thấy có tính chất “additive” (hoạt động tương tác của gen cộng tính) của QTL1-C và QTL11-C (Chaipanyaet và cs 2017). Tác giả Xiao, 2017 [59] sử dụng các giống 75-1-127, Toride 1 và K3 của Thái lan mang gen Pi9, Pizt, Pi54 lai với giống Japonica 07GY31 có tính trạng nông học tốt. Bằng phương pháp MABC, nghiên cứu đã tạo các dòng (NILs) NILPi9, NILPizt, NILPi54. Các dòng trên có nền di truyền so với giống 07GY31 là 97% (BC3F5), tiếp tục lai tạo và tạo ra hai dòng PPLPi9+Pi54 và PPLPi54+Pizt. Khi lây nhiễm nhân tạo các dòng trên có tần số kháng bệnh cao hơn giống nên ban đầu 07GY31 ở cả hai đạo ôn cổ bông và lá. Tần số kháng bệnh đạo ôn ở lá của hai dòng PPL cao hơn hai dòng NIL và dòng PPLPi54+Pizt có tần số kháng bệnh đạo ôn cổ bông cao hơn hai dòng NILPizt, NILPi54 (P < 0.001). Tuy nhiên, dòng PPLPi9+Pi54 có tần số kháng bệnh đạo ôn cổ bông thấp hơn dòng NILPi9 (P < 0.001). Kết quả cũng xác định dòng PPLPi54+Pizt có khả năng kháng bệnh đạo ôn cổ bông tốt hơn dòng PPLPi9+Pi54 Jairin và cộng sự, 2017 [13] đã sử dụng phương pháp MAS tạo ra giống lúa chất lượng, chịu ngập, kháng bạc lá quy tụ 6 gen xa5, Xa21, xa33, badh2, Wxb, Sub1 tại Thái Lan.  Ứng dụng MAS trong quy tụ gen ở Việt Nam Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự (2009) [50] đã lai quy tụ gen kháng bệnh đạo ôn Pi-1 và Pi-5 vào dòng lúa được tạo ra bằng phương pháp đột biến phóng xạ bằng tia gama - (60Co) giống lúa Bắc thơm 7. Quá trình qui tụ 2 gen kháng đạo ôn Pi-1 và Pi-5 được tiến hành cùng lúc. Khi đã có được 2 cá thể BC3F2Pi-1 và BC3F2Pi-5 mang kiểu gen đồng hợp tử gen kháng Pi-1 và Pi- 5, đồng thời vẫn mang trên mình nền của dòng lúa triển vọng ban đầu. Tiến hành lai tạo đưa 2 gen Pi-1 và Pi-5 vào cùng một cá thể, đồng thời tiến hành 31 sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lựa được dòng có triển vọng (đồng hợp tử 2 gen kháng đạo ôn) từ việc tiến hành tự thụ cá thể F1 (mang 2 gen kháng Pi-1 và Pi-5) (Hình 6). Sơ đồ chọn tạo ở hình 6 cho thấy: Do gen Pi-1 và gen Pi-5 nằm trên 2 nhiễm sắc thể (NST) khác nhau (Pi-1 nằm trên NST số 11 và Pi-5 nằm trên NST số 9); Nên ta có thể qui ước như sau: p2p2 là cặp gen nằm trên NST số 9 của cây lúa được quy tụ gen Pi-1 (là gen lặn, không được biểu hiện ra bên ngoài kiểu hình) có vị trí tương ứng với vị trí của gen Pi-5 (có kiểu gen P2P2) trên NST số 9; p1p1 là cặp gen nằm trên NST số 11 của cây lúa được quy tụ gen Pi-5 (là gen lặn, không được biểu hiện ra bên ngoài kiểu hình) có vị trí tương ứng với vị trí của gen Pi-1 (có kiểu gen P1P1) trên NST số 11. Bởi vậy, khi tiến hành lai tạo giữa BC3F2Pi-1 và BC3F2Pi-5 chúng ta sẽ có những kiểu gen của F1 là P1p1P2p2. Khi F1 tiến hành tự thụ; sử dụng chỉ thị phân tử để chọn cá thế mang kiểu gen đồng hợp tử trội gen kháng (có kiểu gen P1P1P2P2) mang hai gen Pi-1 và Pi-5 kháng đạo ôn. Qua nhiều thế hệ chọn lọc đánh giá dòng lúa triển vọng đã ổn định, có tiềm năng năng suất cao hơn giống Bắc thơm 7, chống chịu tốt, kháng đạo ôn và chống chịu sâu, được đặt tên là dòng NB-01. Nguyễn Thị Lang và cộng sự đã tạo ra sáu tổ hợp lai, OM 24/IR 64, IR 24/OM 2514, C 53/IR 64, C53/OM 2514, OM 1308/TeTep và IR 36/C53. Trong số đó, có bốn tổ hợp lai đã được lập bản đồ bằng cách sử dụng marker phân tử. Các gen kháng là di truyền trội và nằm trên nhiễm sắc thể 6, 8 và 11. Marker SSR (RM483) đã được sử dụng để phát hiện khả năng kháng đạo ôn của 100 giống địa phương ở Đồng bằng sông Cửu Long. So sánh giữa chọn lọc kiểu hình và kiểu gen cho thấy sử dụng marker SSR với mồi RM483 chính xác đến 100%, so với hệ thống chọn giống dựa trên dấu chuẩn (MAS). Những phương pháp này có thể được áp dụng trong thực tế để lựa chọn các giống lúa có gen kháng bệnh đạo ôn cao. Đa hình cũng cho thấy MAS đạt độ chính xác 100% khi sử dụng marker STS với mồi RG64 và chính xác đến 99,49% khi sử dụng marker SSR với mồi RM21. Ngoài ra, một số giống lúa kháng đạo ôn như P(OM1), OMP2, OMP4, OMP5 và OMP6 đã được báo cáo 32 bởi nhiều nhà khoa học. Đây được coi là nguồn vật liệu có giá trị cho gen kháng để tạo ra các giống kháng bền (Nguyen Thi Lang và cs, 2009 [60]). Lưu Thị Ngọc Huyền và ctv, 2009 đã đưa vào thử nghiệm các dòng/ giống lúa sau: IR72, DG5, GC9, IS1.2, IS2.3, RS. Trong khuôn khổ đề tài “Quy tụ gen kháng rầy nâu” thuộc chương trình nghiên cứu cơ bản của Bộ Khoa học Công nghệ, nhóm nghiên cứu này đã quy tụ gen kháng Bph3+ BphZ(t) tạo ra các dòng IS1.2, IS2.3, RS. Cũng trong khuôn khổ của đề tài thuộc chương trình CNSHNN, của Bộ nông nghiệp năm 2007 đến 2010, gen BphZ(t) đã được lập bản đồ chi tiết hơn trên NST số 4. Trong nghiên cứu này, các dòng RS, IS1.2, IS2.3 là dòng cho gen kháng hữu hiệu với rầy nâu ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, nhưng chưa đáp ứng được về các chỉ tiêu nông sinh học so với các giống lúa hiện đang trồng trong nước như: Chất lượng gạo cơm, thời gian sinh trưởng, độ cứng cây, năng suất hạt. (Huyen LTN, 2012). Giống lúa Bắc thơm số 7 kháng bệnh bạc lá (BT7KBL) được chọn tạo bằng phương pháp lai trở lại (Bắc thơm số 7/IRBB21) và chọn lọc cá thể. BT7KBL có các đặc điểm nông sinh học như giống Bắc thơm số 7 (BT7), thời gian sinh trưởng ngắn (vụxuân 130-135 ngày, vụ mùa 103-105 ngày), năng suất khá, ổn định (trung bình đạt 5,0-5,5 tấn/ha), chất lượng gạo ngon. BT7KBL thích hợp gieo cấy trong vụ xuân muộn và mùa sớm. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã công nhận giống này và cho mở rộng sản xuất ở các tỉnh phía Bắc (Nguyễn Thị Lệ và cs 2014 [61]). 1.5.2. Phương pháp MABC (Marker-assisted backcrossing) MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc đưa locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen mong muốn vào giống ưu 42 tú nhằm chọn tạo giống mới mang gen/QTL mong muốn nhưng vẫn giữ nguyên (gần 100%) nền gen di truyền của giống ưu tú với thời gian chọn giống rất ngắn: quy trình chọn giống kết thúc ở thế hệ BC3, thậm chí BC2. Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một QTL/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc sự hội nhập của dòng cho thông qua 33 phần còn lại của hệ gen. (Thomson và ctv., 2010 [62]; Septiningsih và ctv., 2009 [63]). Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cường nền di truyền qua mỗi thế hệ. Ưu điểm chính của phương pháp MABC là: (1) Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với locus gen đích (2) Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp (3) Tiến gần đến locus quan tâm trên bản đồ liên kết (4) Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng (Sarkar và ctv., 2009 [64]). Ngoài ra, thông qua phương pháp này, tốc độ của quá trình chọn lọc được đẩy nhanh lên gấp đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tương đương với BC6 theo phương pháp thông thường. Chọn giống hồi giao nhờ chỉ thị phân tử còn giúp khắc phục được những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờ loại bỏ được các tác động gây nhiễu do các tương tác trong cùng một alen hay giữa các alen gây ra. Những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng cách phân tích kiểu hình. Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt. 1.6. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU QUY TỤ CÁC GEN KHÁNG BẠC LÁ /ĐẠO ÔN VÀO 1 GIỐNG LÚA Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào một giống khác bằng phương pháp lai trở lại qua 5 - 6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến thế hệ tiếp theo. Mỗi gen chính thường chỉ kháng được với một chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó, do vậy nếu quy tụ được vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được một dòng lúa kháng được nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại. Vì vậy muốn 34 tạo ra giống lúa kháng bền vững đối với dịch hại, người ta phải đưa một vài gen kháng hiệu quả cao vào genome đích. Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả quy tụ gen kháng bệnh bạc lá và bệnh đạo ôn (Sanchez và cs., 2000; Singh và cs., 2001). Huang và cs. (1997) đã quy tụ 4 gen kháng bạc lá Xa4, Xa5, Xa13 và Xa21 ở các tổ hợp lai khác nhau. Các dòng mang hai, ba và 4 gen kháng đã được phát triển và các dòng mang nhiều gen quy tụ này có phổ kháng rộng hơn và mức độ kháng cao hơn các dòng đơn gen. Sanchez và cs. (2000) tiến hành chuyển ba gen kháng bạc lá là Xa5, Xa13 và Xa21 vào ba dòng lúa triển vọng nhưng mẫn cảm với bạc lá là IR65598-112, IR65600-42, và IR65600-96 nhờ sử dụng các marker STS. Các dòng đẳng gen thế hệ BC3F3 có nhiều hơn một gen kháng bạc lá và biểu hiện tính kháng mạnh hơn và phổ kháng rộng hơn đối với các chủng Xoo. Độ chính xác trong chọn lọc các cá thể kháng đồng hợp đối với 2 gen Xa5 và Xa13 ở hai quần thể là 95% và 96%. Một thí nghiệm quy tụ gen với sự hỗ trợ của marker phân tử khác là thí nghiệm quy tụ 3 gen đã đề cập ở trên vào giống lúa PR106 được trồng phổ biến ở Ấn Độ do Singh và cs. (2001) [31] thực hiện. Davierwala và cs. (2001) sử dụng 11 marker STMS và 6 marker STS để xác định các dòng với gen kháng Xa5 và Xa4 trong một quần thể F3 của phép lai giữa IR-64 và IET-14444. Hittalmani và cs. (2000) đã quy tụ ba gen kháng đạo ôn là Pi1, Piz-5, Pi-ta với sự hỗ trợ của marker phân tử. Thử nghiệm đồng ruộng đối với các dòng mang gen quy tụ ở Philipin và Ấn Độ đã cho thấy tính kháng đạo ôn tăng cường của các dòng này so với các dòng đơn gen kháng. Năm 2012, Fu và cs đã thành công khi đưa 3 gen Pil, Pi2 và Xa23 vào giống Rongfeng B, Rongfeng A nhờ sử dụng marker kết hợp lai trở lại (MABC) và hai dòng cải tiến D521 và D524 mang gen Pil, Pi2 và Xa23 đã được phát triển. Kết quả cho thấy rằng cả hai dòng cải tiến đều có khả năng kháng cao với bệnh đạo ôn cổ bông, đạo ôn lá và bệnh bạc lá lúa. Các tác giả cũng đã thu được dòng bất dục đực mang 3 gen Pil, Pi2 và Xa23 thông qua lai chéo liên tiếp (Fu và cs., 2012). Zhan Xiao-deng và và cs đã thành công sau khi thử nghiệm 25 cặp lai giữa 5 giống kháng đạo ôn với 5 giống kháng bạc 35 lá. Kết quả cặp lai DH146 × TM487 đã thu được dòng R8012 mang 4 gen Pi25, Xa21, Xa13 và Xa5 (Zhan Xiao-deng và cs., 2012). Giống lúa IR 58025A là giống lúa bất dục đực hoang dại thường được dùng phổ biến trong chọn tạo giống lúa lai. Tuy nhiên, giống lúa này lại rất mẫn cảm với bệnh đạo ôn và bạc lá. Để cải thiện điểm yếu này, Yadla Hari và cs đã tích hợp 2 gen trội Xa21 và Pi54 vào giống IR 58025B - dòng duy trì của IR 58025A. Dòng nhập nội SM2154 có chứa gen Xa21 và Pi54 trong điều kiện đồng hợp tử là dòng cho (donor parent). Các tác giả đã sử dụng kỹ thuật backcross kết hợp với chỉ thị phân tử để chọn lọc các dòng kháng đạo ôn và bạc lá. Ở thế hệ BC2F5, 4 dòng mang các tính trạng như: Kháng đạo ôn và bạc lá, năng suất cao, cây thấp, hạt dài và ít thơm đã được chọn lọc và được tiếp tục đánh giá sâu hơn nữa (Yadla Hari và cs., 2013). Các nhà chọn tạo giống Thái Lan cũng bước đầu nghiên cứu chọn tạo các giống lúa kháng đồng thời với cả đạo ôn và bạc lá. Các dòng đẳng gen (NIL) có nguồn gốc từ 2 tổ hợp lai kháng đạo ôn (RD6 × P0489 và RD6 × Jao Hom Nin) đã được lai quy tụ với dòng IR62266 (mang gen Xa5) để đưa gen kháng bạc lá vào dòng RD6. Kết quả là thu được 12 dòng ở thế hệ B2F2:3 kháng với cả đạo ôn và bạc lá với phổ kháng rộng (Pinta và cs., 2013). Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống đang ngày càng trở nên phổ biến để việc tạo ra các giống lúa mang đồng thời nhiều gen qui định nhiều tính trạng, sẽ cải thiện đáng kể đến hiệu quả sản xuất lúa trong nhiều năm tới. 36 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: - Nội dung 3.1.1: Chọn lọc được dòng mang gen kháng bạc lá/đạo ôn thế hệ con lai BC2F1 sử dụng chỉ thị phân tử (MAS) - Nội dung 3.1.2: Chọn lọc được dòng mang gen kháng bạc lá/đạo ôn thế hệ BC2F2 sử dụng chỉ thị phân tử (MAS) - Nội dung 3.1.3: Đánh giá và chọn lọc các dòng BC2F2 mang đa gen kháng bạc lá/đạo ôn so với giống BC15 2.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu - Giống nhận gen: Giống lúa BC15 là một giống lúa thuần được chọn lọc cá thể từ giống lúa IR17494 đã được Bộ NN-PTNT công nhận là giống Quố