Luận văn Nghiên cứu tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano ứng dụng trong bảo vệ cây trồng

t Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) có khả năng tăng dinh dƣỡng và chức năng tự nhiên vốn có của đất trồng giúp tiết kiệm phân bón vô cơ và tăng sức đề kháng tự nhiên của cây trồng dẫn tới giảm lƣợng thuốc BVTV sử dụng đối với cây trồng. - Vi khuẩn nội ký sinh thực vật (Endophytic bacteria) đƣợc tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật, chúng cƣ trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau nhƣ cộng sinh tƣơng hỗ, công sinh dinh dƣỡng, hội sinh. Endophytic bacteria khi kết hợp chức năng PGPR sẽ thúc đẩy thực vật tăng trƣởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học. Endophytic PGPR bacteria sản xuất hàng loạt các sản phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp. Ngoài ra nó còn có tiểm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cƣờng khả năng khử độc đồng thời có khả năng sản xuất sinh khối và nhiên liệu sinh học. 23 Hình 1.7. Hạt nano Titanium-Bis-Ammonium-Lactato-Dihydrohyde (TiBALDH) [23] (A); hạt nano CaptiGel trong dung môi hữu cơ (B); hạt nano CaptiGel trong nƣớc (C); sự hình thành bề mặt phức của hạt nano Ti với các phospholipids (D); phƣơng trình phản ứng trên bền mặt hạt nano Ti và các phospholipids (E); sự hình thành những tập hợp vi khuẩn Bacillus spp từ sự kích ứng của hạt nano Ti (F). 1.2.3. Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.2.3.1. Đặc điểm phân loại Theo phân loại của Bergey (1994) thuộc: 24 Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 1.2.3.2. Đặc điểm phân bố B. subtilis là vi khuẩn thƣờng có mặt trong nƣớc, đất, không khí, xác bã thực vật thối rữa và cả trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật. B. subtilis hiện diện trong đất với một số lƣợng phổ biến là 106 – 107 CFU/g. Vi khuẩn này có khả năng sinh bào tử để có thể chịu đựng các điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt và những thay đổi bất lợi của môi trƣờng sống. Thông thƣờng có khoảng 60% số lƣợng B. subtilis trong đất tồn tại ở trạng thái này [24]. 1.2.3.3. Đặc điểm hình thái B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dƣơng, kích thƣớc 0.5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 chiên mao, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào. Bào tử B. subtilis phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ, [25]. Hình dạng của vi khuẩn trên môi trƣờng TSA (Trypcase Soya Agar) là khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cƣa không đều, đƣờng kính 3 – 5 mm, màu vàng xám, tâm sẫm màu. Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi ngả nâu. Trên môi trƣờng canh TSB (Trypton Soya Broth), B. subtilis phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại nhƣ vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều. 25 1.2.3.4. Đặc điểm sinh hóa [26] Trong đó: + có hoạt tính - không có hoạt tính 26 1.2.3.5. Các chất kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp Subtilin Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tƣơng tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với các nhóm sulfhydyl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hƣởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lƣợng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton. Subtilosin Subtolosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria monocytogenes và Bacillus cereus. Sublancin Sublancin không tác động với vi khuẩn gram âm nhƣng có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn gram dƣơng kể cả tế bào sinh dƣỡng lẫn bào tử. Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở nhiệt độ thƣờng trong thời gian 2 năm không mất hoạt tính. TasA TasA có phổ kháng khuẩn rộng đƣợc tổng hợp và tiết vào môi trƣờng 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử đƣợc bắt đầu, đồng thời TasA cũng đƣợc chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử sau đó định vị trong lớp petidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus subtilis chiếm ƣu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm. Surfactin Surfactin có tính đối kháng mạnh với vi khuẩn, virut và kháng lại các tế bào ung thƣ nhƣng ít tác động đối với nấm. Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên lớp màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của một số enzyme. Bacilysocin Bacilysocin là kháng sinh có bản chất phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh với nấm đƣợc phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis. 27 1.2.3.6. Tính đối kháng của Bacillus subtilis Với vi sinh vật gây bệnh Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh là cạnh tranh dinh dƣỡng và tiết kháng sinh. Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hƣớng chủ yếu sau:  Làm ngừng tổng hợp thành (màng) tế bào hay làm tan màng tế bào vi khuẩn và do đó phá hủy tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg2+, Na+, Ca 2+ thoát ra ngoài, tế bào chết.  Ảnh hƣởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Chất kháng sinh có thể phong bế quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổng hợp chuỗi polypeptid hay đƣa đến tổng protein bất thƣờng.  Ảnh hƣởng đối với acid acetic cụ thể là phá hủy sự trao đổi của ADN và ARN bằng cách ức chế men RNA polymerase hay gắn vào các base làm đứt đoạn chuỗi xoắn kép ADN. Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lƣợng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dƣỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trƣởng của nấm bị ức chế. Với đồng loại Trong môi trƣờng dinh dƣỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra chất kháng sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chƣa bắt đầu quá trình này nhằm tiêu thụ chất dinh dƣỡng giải phóng từ các tế bào này với mục đích kéo dài thời kỳ trƣớc khi tạo bào tử. 1.3. CÂY LÚA VÀ DƢA LƢỚI 1.3.1. Tổng quan về cây lúa Nguồn gốc cây lúa 28 Đến nay, có nhiều giả thiết khác nhau về nguồn gốc của chi Lúa trên trái đất, nhƣng hầu hết đều thừa nhận rằng các loài lúa hoang dại đã xuất hiện từ thời tiền sử của trái đất (thời Gondwana). Theo công bố của Chang và cộng sự, O.sativa xuất hiện đầu tiên ở dãy Himalaya, Miến Điện, Lào, Việt Nam và Trung Quốc [27]. Từ các trung tâm trên lúa Indica phát tán đến lƣu vực sông Hoàng Hà và sông Dƣơng Tử rồi sang Nhật Bản, Triều Tiên và từ đó biến thành chủng Japonica. Lúa đƣợc hình thành ở Indonesia và là sản phẩm của quá trình chọn lọc từ Indica. Ở Việt Nam, theo kết quả khảo sát nguồn gen cây lúa những năm gần đây tìm thấy các loài lúa dại mọc nhiều ở vùng Tây Bắc, Nam Trung bộ, đồng bằng sông Cửu Long, Tây Nguyên là các loài O.granulata, O.nivara, O.ridleyi, O.rufipogon. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng có thể là cái nôi hình thành cây lúa nƣớc. Từ lâu, cây lúa đã trở thành cây lƣơng thực chủ yếu có ý nghĩa quan trọng trong nền kinh tế và xã hội của nƣớc ta. Lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa dại. Việc xác định trực tiếp tổ tiên của cây lúa trồng ở Châu Á (Oryza sativa) vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau. Một số tác giả nhƣ Đinh Dĩnh, Bùi Huy Đáp, Đinh Văn Lữ, cho rằng: Oryza fatua là loài lúa dại gần nhất và đƣợc coi là tổ tiên của lúa trồng hiện nay. Phân loại cây lúa Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) trƣớc đây đã nghiên cứu và xếp lúa trồng ở châu Á (Oryza sativa) thuộc họ hòa thảo (graminae), có bộ nhiễm sắc thể 2n = 24. Theo Trần Văn Đạt, Kato là ngƣời đầu tiên xây dựng các luận cứ khoa học về phân loại dƣới loài của lúa trồng châu Á dựa trên các đặc điểm hình thái [28]. Tùy theo các đặc điểm và tiêu chí khác nhau mà các nhà khoa học phân loại cây lúa theo các quan điểm khác nhau, phân loại cây lúa nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng nguồn gen để phục vụ cho mục tiêu chọn tạo giống cây trồng. Nhiều tƣ liệu đƣa ra cơ sở tiến hóa của các loài lúa trồng hiện nay, tuy nhiên theo. Khush, sự tiến hóa của hai loại lúa trồng phổ biến hiện nay trên thế giới đƣợc thể hiện trong sơ đồ, nhƣ sau [29] 29 Đặc điểm hình thái Cây lúa có chiều cao từ 1,0 - 1,8 m, với các lá mỏng, hẹp khoảng 2 - 2,5 cm và dài 50 – 100 cm. Tuỳ thời kì sinh trƣởng, phát triển mà lá lúa có màu khác nhau. Khi lúa chín ngả sang màu vàng. Các hoa nhỏ tự thụ phấn mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống, dài 35 – 50 cm. Hình 1.8. Hình ảnh cây lúa trên ruộng 30 Đặc điểm sinh trưởng Thời gian sinh trƣởng của cây lúa: Tính từ lúc hạt lúa nẩy mầm đến lúc thu hoạch (dao động khoảng 90 - 180 ngày đối với các giống lúa hiện trồng).  Thời gian sinh trƣởng ruộng lúa cấy = Thời gian ruộng mạ + Thời gian ruộng cấy.  Thời gian sinh trƣởng ruộng lúa gieo thẳng = Thời gian lúc thu hoạch - lúc gieo hạt Nếu tính theo thời kỳ sinh trƣởng thì cây lúa có 3 thời kỳ sinh trƣởng chính: - Thời kỳ sinh trƣởng sinh dƣỡng: tính từ lúc hạt thóc nảy mầm đến khi bắt đầu vào giai đoạn phân hoá hoa lúa (trên thực tế ngƣời ta tính từ khi gieo mạ, cấy lúa, cây lúa đẻ nhánh tới số nhánh tối đa). - Thời kỳ sinh trƣởng sinh thực: tính từ lúc bắt đầu phân hoá hoa lúa đến khi lúa trỗ bông và thụ tinh (bao gồm từ: làm đòng - phân hoá đòng, đến trỗ bông - bông lúa thoát khỏi lá đòng, nở hoa, tung phấn, thụ tinh. - Thời kỳ chín: sau khi thụ tinh, bông lúa bƣớc vào kỳ chín, kết thúc thời kỳ này là bông lúa chín hoàn toàn, sau đó tiến hành thu hoạch hạt thóc. Phân loại theo quan điểm canh tác học Quá trình thuần hóa và thích nghi với điều kiện sống và điều kiện canh tác khác nhau, cây lúa trồng đƣợc phân thành các nhóm: Lúa có tƣới: Lúa đƣợc trồng trên những cánh đồng có công trình thủy lợi, chủ động về nƣớc tƣới trong suốt thời gian sinh trƣởng, phát triển. Lúa nƣớc sâu: Lúa đƣợc trồng trên những cánh đồng thấp, không có khả năng rút nƣớc sau mƣa hoặc lũ. Tuy nhiên, nƣớc không ngập quá 10 ngày và nƣớc không cao quá 50 cm. Lúa nổi: Lúa đƣợc gieo trồng trƣớc mùa mƣa; khi mƣa lớn, cây lúa đã đẻ nhánh; khi nƣớc lên cao cây lúa vƣơn khỏi mặt nƣớc khoảng 10 cm/ngày để ngoi theo. Ở Việt Nam tồn tại cả 4 nhóm lúa nhƣ nêu trên. 31 Lúa cạn: Lúa đƣợc trồng trên đất cao, không có khả năng giữ nƣớc, cây lúa sống hoàn toàn nhờ nƣớc trời trong suốt quá trình sinh trƣởng, phát triển. Theo Nguyễn Văn Hoan, cho đến nay phân loại lúa theo hệ thống phân loại học thực vật của loài lúa trồng Oryza sativa L. đã đạt đƣợc sự thống nhất [30]. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu: loài Oryza sativa L. gồm 3 loại phụ, 8 nhóm biến chủng và 284 biến chủng. Theo cấu tạo của tinh bột còn phân biệt lúa nếp (glutinosa) và lúa tẻ (utilissma). Tuy nhiên theo định luật về dãy biến dị tƣơng đồng của Vavilov. N. I thì cây lúa vẫn tiếp tục tiến hóa và nhiều biến chủng mới vẫn tiếp tục xuất hiện. Vì vậy, các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu, tập hợp và bổ sung thêm cho hệ thống phân loại này. Phân loại theo điều kiện sinh thái Lúa trồng thành hai nhóm lớn là Japonica (lúa cánh) và Indica (lúa tiên). Lúa tiên thƣờng phân bố ở vĩ độ thấp nhƣ: Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Indonesia... là loại hình cây to, lá nhỏ xanh nhạt, bông xòe, hạt dài, vỏ trấu mỏng, cơm khô nở nhiều, chịu phân kém, dễ lốp đổ nên có năng suất thấp. Lúa cánh thƣờng phân bố ở vĩ độ cao, nhƣ: Nhật Bản, Triều Tiên, Bắc Trung Quốc, châu Âu... là loại hình cây có lá to, xanh đậm, bông chụm, hạt ngắn, vỏ trấu dày, cơm thƣờng dẻo, ít nở, thích nghi với điều kiện thâm canh, chịu phân tốt, thƣờng thu hoạch cho năng suất cao. Phân loại theo địa lý Theo Nguyễn Văn Hoan, phân chia lúa trồng thành các nhóm sinh thái địa lý, nhƣ sau [30]: Nhóm Đông Á: Bao gồm Triền Tiên, Nhật Bản, phía Bắc Trung Quốc. Đặc trƣng của nhóm là chịu lạnh rất tốt và hạt khó rụng. Nhóm Trung Á: Bao gồm các nƣớc Trung Á. Đặc điểm nổi bật của lúa vùng này là hạt to, khối lƣợng 1000 hạt đạt trên 32 gam, chịu lạnh và chịu nóng khá. Nhóm Iran: Gồm toàn bộ các nƣớc Trung Đông xung quanh Iran. Đây là nhóm sinh thái địa lý với các loại hình chịu lạnh tốt, hạt gạo to, đục, cơm dẻo. 32 Nhóm Nam Á: Bắt đầu từ Pakistan sang vùng bờ biển phía Nam Trung Quốc đến Bắc Việt Nam. Đặc điểm nổi bật của nhóm sinh thái địa lý này là chịu lạnh kém, phần lớn có hạt dài và nhỏ. Nhóm Philippin: Nhóm lúa điển hình nhiệt đới không chịu lạnh. Toàn bộ vùng Đông Nam Á, miền Nam Việt Nam nằm trong nhóm này. Nhóm châu Âu: Bao gồm các nƣớc trồng lúa ở châu Âu nhƣ: Nga, Italia, Bungaria.... Đây là nhóm sinh thái với các loại hình japonica chịu lạnh, hạt to, cơm dẻo, chịu nóng kém. Nhóm châu Phi: Nhóm lúa trồng thuộc loại Oryza glaberrima. Nhóm châu Mỹ La Tinh: Gồm các nƣớc Trung Mỹ và Nam Mỹ. Nhóm lúa cao cây, thân to, hạt gạo lớn, gạo trong và dài, chịu ngập và chống đổ tốt. 1.3.2. Tổng quan về cây dƣa lƣới Dƣa lƣới (Cucumis melo L.) thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) là rau ăn quả có thời gian sinh trƣởng ngắn (85 - 90 ngày, tùy từng thời vụ và giống cây trồng), trồng đƣợc nhiều vụ trong năm với năng suất khá cao. Hình 1.9. Cây dƣa lƣới trồng trong nhà kính Hiện nay dƣa lƣới đƣợc trồng khắp nơi trên thế giới, chủ yếu bán tƣơi và đƣợc xem là loại thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao. Không những thế, thành phần của dƣa lƣới có chứa chất chống oxy hóa dạng polyphenol, có khả năng phòng chống ung thƣ và tăng cƣờng hệ miễn dịch, nhiều chất xơ nên có 33 tác dụng nhuận trƣờng, chống táo bón và là nguồn phong phú beta-carotene, acid folic, kali và vitamin C, A giúp điều hòa huyết áp, ngừa sỏi thận, lão hóa xƣơng, Ở nƣớc ta, hiện có nhiều loại dƣa lƣới. Ngoài các giống dƣa lƣới truyền thống đƣợc trồng từ lâu nhƣ dƣa trắng Hà Nội, dƣa mật Bắc Ninh, dƣa vàng Hải Dƣơng trái nhỏ, thơm, ngọt, thì những năm gần đây, Công ty Giống cây trồng Nông Hữu đã đƣa vào sản xuất một số giống lai F1 nhập nội cho năng suất cao (35 tấn/ha), thơm ngon, độ đƣờng (Brix) cao từ 15 - 18 độ, quả to, màu sắc phong phú, chống chịu một số bệnh nứt dây và thối vi khuẩn. Chu Phấn và Taki là hai giống đã đƣợc khảo nghiệm và đánh giá phù hợp với điều kiện nhà màng. Taki có độ Brix cao, có khả năng kháng bệnh tốt hơn nên đƣợc khuyến khích trồng nhiều hơn. Một số giống dƣa lƣới đƣợc lai tạo phổ biến nhƣ Dƣa Vân là dƣa ƣu thế lai F1 do Công ty Vimorint Cộng hòa Pháp lai tạo và sản xuất; dƣa lƣới Hami (Cucumis melo var. saccharinus) có nguồn gốc từ Tân Cƣơng, Trung Quốc Hiện nay nhu cầu thị trƣờng trên thế giới và trong nƣớc thì lƣợng cầu lớn hơn cung, ở nƣớc ta chỉ có vài công ty sản xuất dƣa lƣới đảm bảo chất lƣợng nhƣng quy mô nhỏ và tiêu chuẩn sản xuất chƣa cao nên chƣa thể đáp ứng cho thị trƣờng trong nƣớc. Dƣa lƣới yêu cầu một lƣợng dinh dƣỡng lớn đặc biệt là cần tơi xốp và tƣới nƣớc thƣờng xuyên, vì vậy cần áp dụng và phát triển kĩ thuật vào trong sản xuất để đạt hiệu quả cao. 34 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO 2.1.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1.1. Hóa chất  Titanium Isopropoxide (TTIP): Ti[OCH(CH3)2]4 97%, Sigma - Aldrich  Tetraetyl orthosilicat (TEOS): Si(OC2H5)4 98%, Sigma - Aldrich  Polyethylene glycol 400 (PEG 400) 99%, Merk  Amoniac (NH3) 25%, Merk  Ethanol  Methanol  Nƣớc cất 2 lần Các hóa chất dùng trong tổng hợp đều là các sản phẩm thƣơng mại với độ sạch đạt tiêu chuẩn phân tích. 2.1.1.2. Thiết bị  Cân phân tích  Máy khuấy từ  Bể rung siêu âm  Máy khuấy đũa  Ống đong  Cốc thủy tinh  Buret  Các thiết bị khác 2.1.2. Phƣơng pháp 2.1.2.1. Phương pháp tổng hợp nano TiO2, SiO2  Tổng hợp nano TiO2 Tiền chất đƣợc lựa chọn sử dụng chế tạo nano TiO2 là Titanium Isopropoxide (TTIP): Ti[OCH(CH3)2]4. 35 Cơ chế phản ứng: Ti[OCH(CH3)2]4 + 4H2O → Ti(OH)4 + 4CH(CH3)2OH Ti(OH)4 → TiO2 + 2H2O Trong quá trình phản ứng, các chất bọc đƣợc thêm vào để tạo sự ổn định và phân tán của hạt nano TiO2. Quy trình tổng hợp chung đƣợc mô tả theo sơ đồ: Bước 1: Hòa TTIP vào 50 ml ethanol thu đƣợc dung dịch tiền chất - dung dịch 1. Bước 2: Hòa H2O vào 50 ml ethanol thu đƣợc dung dịch 2. Bước 3: Hòa 100 ml PEG 400 trong 400 ml ethanol thu đƣợc dung dịch 3 là môi trƣờng phản ứng. Bước 4: Nhỏ đồng thời dung dịch 1 và dung dịch 2 vào dung dịch 3, thời gian nhỏ 3 giờ, cốc phản ứng đƣợc đặt trong bể siêu âm 37 kHz, nhiệt độ 80o C, khuấy cơ 350 rpm. Bước 5: Sau khi hết dung dịch 1 và dung dịch 2, tiếp tục siêu âm 15 giờ. Trong quá trình phản ứng bổ sung ethanol để duy trì thể tích cốc phản ứng. TTIP/dung môi H2O/dung môi Ti(OH)4 Nano TiO2 + chất bọc Siêu âm, t o 36 Bước 6: Ngƣng bổ sung ethanol, tiếp tục gia nhiệt, siêu âm và khuấy cơ để loại bỏ ethanol trong cốc phản ứng, thu sản phẩm. Các yếu tố đƣợc khảo sát bao gồm lƣợng TTIP (dung dịch 1) và H2O (dung dịch 2) tham gia phản ứng: STT Ký hiệu mẫu TTIP (g) H2O (g) 1 T1 4,0 1,0 2 T2 8,0 2,0 3 T3 12,0 3,0 4 T4 16,0 4,0  Tổng hợp nano SiO2 Tiền chất đƣợc lựa chọn sử dụng chế tạo nano SiO2 là Tetraetyl orthosilicat – TEOS, Si(OC2H5)4. Cơ chế phản ứng: Si(OC2H5)4 + 4H2O → Si(OH)4 + 4C2H5OH Si(OH)4 → SiO2 + 2H2O Trong quá trình phản ứng, các chất bọc đƣợc thêm vào để tạo sự ổn định và phân tán của hạt nano SiO2. Quy trình tổng hợp chung đƣợc mô tả theo sơ đồ: 37 Bước 1: Hòa TEOS vào 50 ml ethanol thu đƣợc dung dịch tiền chất - dung dịch 1. Bước 2: Hòa H2O vào 50 ml ethanol thu đƣợc dung dịch 2. Bước 3: Hòa 100 ml PEG 400 trong 400 ml ethanol, thêm NH3 đến khi pH ~ 13 thu đƣợc dung dịch 3 là môi trƣờng phản ứng. Bước 4: Nhỏ đồng thời dung dịch 1 và dung dịch 2 vào dung dịch 3, thời gian nhỏ 4 giờ, cốc phản ứng đƣợc đặt trong bể siêu âm 37 kHz, nhiệt độ 80 oC, khuấy cơ 350 rpm. Bước 5: Sau khi hết dung dịch 1 và dung dịch 2, tiếp tục siêu âm 15 giờ. Trong quá trình phản ứng bổ sung ethanol, NH3 để duy trì môi trƣờng phản ứng. Bước 6: Ngƣng bổ sung ethanol, tiếp tục gia nhiệt, siêu âm và khuấy cơ để loại bỏ ethanol trong cốc phản ứng, thu sản phẩm. Các yếu tố đƣợc khảo sát bao gồm lƣợng TEOS (dung dịch 1) và H2O (dung dịch 2) tham gia phản ứng: TEOS/dung môi NH3/H2O/dung môi Si(OH)4 Nano SiO2 + chất bọc Siêu âm, t o 38 STT Ký hiệu mẫu TEOS (g) H2O (g) 1 S1 1,0 0,5 2 S2 2,0 1,0 3 S3 4,0 2,0 4 S4 6,0 3,0 2.1.2.2. Phương pháp đánh giá cấu trúc hạt  Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử truyền qua đƣợc sử dụng để nghiên cứu hình dáng, kích thƣớc, phân bố kích thƣớc hạt của sản phẩm thu đƣợc. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc của kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Thiết bị làm việc theo nguyên tắc phóng đại nhờ các thấu kính, ánh sáng tới là tia điện tử có bƣớc sóng ngắn vào cỡ 0,05 Ǻ và thấu kính cho điện tử thƣờng là thấu kính điện từ có tiêu cự f thay đổi đƣợc. Phƣơng pháp này 39 cho ta độ phân giải cỡ 2÷3 Ǻ . Một nhƣợc điểm cơ bản của hiển vi điện tử truyền qua là mẫu nghiên cứu phải là lát cực mỏng (<0,1mm) nhƣng lại phải đủ dày để tồn tại ở dạng rắn, ít nhất là vài chục vài trăm lớp nguyên tử. Nhƣ vậy ứng với mỗi điểm trên ảnh hiển vi điện tử truyền qua là những cột điện tử trên mẫu (chiều cao của cột nguyên tử là chiều dày trên mẫu). Trong luận văn này, ảnh TEM đƣợc ghi trên máy JEM 2100 – Phòng hiển vi điện tử - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam. Hình 2.2. Thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)  Phƣơng pháp hiển vi điện tử quét (SEM) Nguyên lý cơ bản của kính hiển vi điện tử quét là dùng các chùm điện tử để tạo ảnh mẫu nghiên cứu, ảnh đó khi đến màn hình huỳnh quang có thể đạt độ phóng đại theo yêu cầu. Chùm điện tử đƣợc tạo ra từ catốt (súng điện tử) qua 2 tụ quang sẽ đƣợc hội tụ trên mẫu nghiên cứu đặt trong buồng chân không. Chùm điện tử này đƣợc quét đều trên mẫu. Khi chùm điện tử đập vào mẫu, trên bề mặt mẫu phát ra các điện tử thứ cấp. Mỗi một điện tử phát xạ này qua điện thế gia tốc vào phần thu và biến đổi thành tín hiệu ánh sáng, chúng đƣợc khuyếch đại, đƣa vào mạng lƣới điều khiển tạo độ sáng trên màn ảnh. Mỗi điểm trên mẫu nghiên cứu cho một điểm trên màn ảnh. Độ sáng tối trên màn ảnh tùy thuộc vào lƣợng điện tử thứ cấp phát ra và tới bộ thu, phụ thuộc vào trạng thái bề mặt mẫu nghiên cứu. 40 Hình 2.3. Sơ đồ nguyên tắc của kính hiển vi điện tử quét (SEM) Kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh của bề mặt mẫu với độ phân giải cao bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu đƣợc thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tƣơng tác của chùm điện tử với bề mặt của mẫu. Các chùm điện tử đƣợc phát ra từ súng phóng điện tử (có thể là phát xạ nhiệt hay phát xạ trƣờng), sau đó đƣợc tăng tốc. Tuy nhiên, thế tăng tốc của SEM thƣờng chỉ từ 10 kV đến 50 kV vì sự hạn chế của thấu kính từ, việc hội tụ các chùm điện tử có bƣớc sóng quá nhỏ vào một điểm kích thƣớc nhỏ sẽ rất khó khăn. Điện tử đƣợc phát ra, tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử hẹp (cỡ vài trăm Angstrong đến vài nano-mét) nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu nhờ các cuộn quét tĩnh điện. Khi điện tử tƣơng tác với bề mặt mẫu, sẽ có các bức xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích đƣợc thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này. Các bức xạ chủ yếu gồm: điện tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngƣợc. Chùm điện tử thứ cấp có năng lƣợng thấp (thƣờng nhỏ hơn 50 eV) đƣợc ghi nhận bằng ống nhân quang nhấp nháy. Vì chúng có năng lƣợng thấp nên chủ yếu là các điện tử phát ra từ bề mặt mẫu với độ sâu chỉ vài nano-mét, do vậy chúng tạo ra ảnh hai chiều của bề mặt mẫu. Đây là chế độ ghi ảnh thông dụng nhất của kính hiển vi điện tử quét. Điện tử tán xạ ngƣợc là chùm điện tử ban đầu khi tƣơng tác với bề mặt mẫu bị bật ngƣợc trở lại, do đó chúng thƣờng có năng lƣợng cao. Sự tán xạ này phụ 41 thuộc rất nhiều vào thành phần hóa học ở bề mặt mẫu, do đó ảnh điện tử tán xạ ngƣợc rất hữu ích cho phân tích về độ tƣơng phản thành phần hóa học. Trong luận văn này, mẫu đƣợc phân tích trên máy chụp SEM-EDX JEOL 6610 LA, Nhật Bản, đặt tại Viện Khoa Học Vật Liệu – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Hình 2.4. Thiết bị kính hiển vi điện tử quét (SEM)  Phƣơng pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (InfraRed Spectroscopy viết tắt là IRS) là phƣơng pháp phổ biến để nghiên cứu thông tin về cấu trúc phân tử nhanh mà không đòi hỏi tính toán phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại (2.500 – 16.000 nm). Khi bị kích thích bởi sóng điện từ có bƣớc sóng xác định nằm trong vùng hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hoá học dao động (làm thay đổi moment lƣỡng cực của phân tử) với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. 42 Hình 2.5. Sơ đồ nguyên lý của máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Các máy phổ hồng ngoại thế hệ mới đƣợc chế tạo theo kiểu biến đổi Fourier (Fourier Transform InfraRed viết tắt là FT-IR). Ở máy hồng ngoại biến đổi Fourier bộ đơn sắc đƣợc thay bằng bộ giao thoa (giao thoa kế) gồm bộ gƣơng cố định, bộ gƣơng di động và bộ phân chia chùm bức xạ. Bức xạ hồng ngoại sau khi qua giao thoa kế sẽ đi tới mẫu rồi đến detector. Detector ghi nhận sự biến đổi cƣờng độ của bức xạ theo quãng đƣờng d mà gƣơng di động thực hiện rồi chuyển tín hiệu thành tín hiệu điện. Khi đó sẽ thu đƣợc tín hiệu dƣới dạng hàm phụ thuộc của tín hiệu điện vào quãng đƣờng, E = f(d). Máy tính thực hiện phép biến đổi Fourier để chuyển hàm F ×= f(d) thành cƣờng độ bức xạ I theo nghịch đảo của quang đƣờng d (d-1). Vì d-1 chính là số sóng ν do đó thực chất là ta có hàm sự phụ thuộc của cƣờng độ bức xạ vào số sóng. Từ phổ hấp thụ hồng ngoại chúng ta có thể xác định các nhóm chức đặc trƣng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hoá học. Các phép đo phổ hồng ngoại trong luận văn đƣợc thực hiện trên máy phân tích quang phổ hồng ngoại FT-IR TENSOR II, hãng Bruker, Đức. 43 Hình 2.6. Thiết bị phân tích IR  Phƣơng pháp đo tán xạ ánh sáng động học Dynamic Light Scattering – DLS Phân bố kích thƣớc hạt và phân bố thế zeta của các mẫu trong luận án đƣợc xác định bằng phƣơng pháp tán xạ laser động trên thiết bị Zetasizer - Nano ZS của hãng Malvern – UK đƣợc đặt tại Viện khoa học vật liệu. Đại lƣợng đặc trƣng cho độ ổn định của hệ phân tán keo là thế Zeta (ζ). Bảng 2.1. Sự phụ thuộc độ ổn định của hệ keo vào giá trị thế Zeta Thế zeta (mV) Độ ổn định hạt keo 0