Luận văn Nghiên cứu tối ưu qui trình tách ADN hệ gen từ xương lâu năm ứng dụng trong nhận dạng cá thể người

ệ gen nhân. Số lần lặp lại của mỗi locus này được gọi là alen, mỗi cá nhân có kiểu gen 2 alen của mỗi locus STR, một alen nhận từ mẹ và một alen nhận từ bố. Cơ sở khoa học của phân tích STR trong nhận dạng cá thể người Năm 1956, Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong nhân tế bào (thể lưỡng bội) có 46 cặp NST được xếp thành 23 cặp tương đồng: 22 cặp NST thường và một cặp NST giới tính. Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 NST (tế bào đơn bội). Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng NST trong tế bào thường là 46. Bộ NST được bảo tồn và di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Thế hệ con cái bao giờ cũng thừa hưởng các đặc tính di truyền thông qua gen của cả bố và mẹ với xác suất ngang nhau. Điều đó có nghĩa là Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 7 23 NST từ bố được truyền cho con thông qua tinh trùng, 23 NST từ mẹ truyền cho con thông qua trứng. Các locus STR nằm trên NST cũng theo đó mà được di truyền qua các thế hệ (hình 1.1). Hình 1.1. Sơ đồ minh hoạ các khả năng di truyền một số alen thuộc locus STR từ bố, mẹ cho con theo định luật Mendel (8 - 12: một số alen thuộc một locus STR nào đó ) [10]. Vai trò các STR trong nhận dạng cá thể người. Các locus STR trở thành các chỉ thị ADN phổ biến trong nhận dạng cá thể bởi đặc tính dễ dàng nhân bội đồng thời nhờ kỹ thuật PCR, không phải thực hiện nhân bội riêng rẽ như đối với các locus VNTR. Đặc điểm này là do các alen của locus STR nằm trong một khoảng kích thước tương đương, khoảng vài trăm bp, các đơn vị lặp lại có kích thước nhỏ. Hơn nữa, số đơn vị lặp của các chỉ thị STR rất khác nhau giữa các cá thể, điều này làm cho chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhận dạng cá thể. Với mục đích sử dụng cho nhận dạng cá thể, điểm quan trọng đối với các chỉ thị ADN là có tính đa hình càng cao càng tốt hoặc một số chỉ thị có tính đa hình thấp hơn có thể kết hợp với các chỉ thị khác để đạt được đủ độ tin cậy phân biệt giữa các cá thể. Bộ STR đầu tiên được nghiên cứu phát triển phục vụ cho ngành pháp lý là bộ STR 4 trình tự STR : TH01, FES/FPS, vWA và F13A. Đây là bộ chỉ thị thế hệ thứ nhất. Xác suất hai cá thể trùng nhau khi sử dụng bộ KIT bốn gen này khoảng 1/10.000. Bộ KIT thế hệ thứ hai gồm 6 locus là TH01, vWA, FGA, D8S1179, Bố (8-11) Mẹ (9-12) Con 1 (8-9) Con 2 (8-12) Con 3 (9-11) Con 4 (11-12) Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 8 D18S51 và D21S11 với xác suất hai cá thể trùng nhau 1/50.000.000. Những locus nêu trên đều sử dụng các phương pháp đọc tín hiệu huỳnh quang để phát hiện nên đòi hỏi kinh phí trang bị tương đối lớn và đồng bộ [9]. Từ năm 1996 phòng thí nghiệm của FBI đã hỗ trợ cho việc nghiên cứu và xây dựng cơ sở dữ liệu từ 13 đoạn FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, D18S51, CSF1PO, D8S1179 và D21S11. 13 locus đánh dấu này được chia thành 4 nhóm chính: - Nhóm thứ nhất: trình tự lặp lại chứa các trình tự giống nhau: TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539. - Nhóm thứ hai: Một vài trình tự có những alen không đồng nhất: TH01, D18S51, D7S820. - Nhóm thứ ba: Cấu trúc kép với các alen khác nhau:vWA, FGA, D3S1358, D8S1179. - Nhóm thứ tư: Cấu trúc dạng lặp dạng phức: D21S11. Cho đến nay, số lượng các locus trong bộ KIT nhận dạng cá thể thương mại có thể lên tới 30 locus, phổ biến sử dụng là các bộ KIT 16 locus [10]. 1.1.3.2. Mini-STR Trong thực tế áp dụng, việc nhận dạng cá thể không phải lúc nào cũng được thực hiện đối với nguồn mẫu chuẩn (như: các mẫu được thu trực tiếp từ cơ thể, các mẫu sinh học còn giữ nguyên vẹn về cấu trúc và đủ hàm lượng ADN cho phân tích một hồ sơ STR đầy đủ). Rất nhiều trường hợp việc nhận dạng cá thể phải thực hiện với các mẫu sinh học đã biến tính một phần hoặc ở tình trạng phân hủy mạnh (mẫu dấu vết hình sự, mẫu hài cốt lâu năm.). Do đó, các nhà nghiên cứu đã đưa ra giải pháp: thiết kế các bộ mồi PCR nhằm nhân bội được các locus STR với kích thước sản phẩm PCR (amplicon) tạo ra rất ngắn, khoảng trên dưới 100 bp (hình 1.2) để phù hợp với việc phân tích các mẫu ADN biến tính [36]. Việc phân tích một số locus mini-STR này sẽ góp phần bổ sung thông tin về hồ sơ ADN (kiểu gen) cá thể trong những trường hợp phân tích STR thông thường không thu được một hồ sơ kiều gen đầy đủ. Tỉ lệ thành công của các hệ Mini-STR so với các hệ STR “truyền thống” trên các mẫu bị phân hủy mạnh đã được chứng Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 9 minh: Mini-STR đã cung cấp một hồ sơ ADN với thông tin di truyền gấp 3 lần và đầy đủ hơn hệ STR tiêu chuẩn. Các nghiên cứu trên mẫu bị phân hủy mạnh cho thấy rằng các locus mini-STR có kích thước dưới 120 bp đều cho kết quả tốt, các trình tự trên 150 bp thường khó thu được kết quả hơn [51]. Hình 1.2: Hình minh họa vị trí thiết kế mồi Mini-STR và các bộ mồi multiplex Mini-STR (A): Cặp mồi mini-STR được thiết kế lại nhằm tiếp cận gần sát đến vùng nhân lặp hơn các cặp mồi STR thông thường, do đó thu nhỏ kích thước đoạn được nhân bản, tạo điều kiện nhân bội những mẫu ADN bị thoái hóa. (B): So sánh kích thước đoạn được nhân bản của hai bộ KIT: AmpFlSTR® MiniFiler™ và Identifiler® kit (Applied Biosystems) [6] Việc nhân bội ADN sử dụng các locus mini STR phù hợp với các mẫu đã biến tính, tuy nhiên cũng có một số hạn chế nhất định. Thứ nhất, khó có thể kết hợp nhiều locus mini-STR trong cùng một phản ứng multiplex và phân tách đọc kết quả tự động bằng điện di mao quản. Do là khi mồi được thiết kế để tiếp cận gần hơn vùng nhân lặp, kích thước của các trình tự nhân bội đều bị giảm xuống cùng chung một phạm vi hẹp hơn (khoảng 100 – 150 bp) [10], vì vậy đọc kết quả trên thiết bị điện di mao quản sẽ chỉ giới hạn được một số locus trong mỗi kênh màu. Thứ hai, theo nghiên cứu của Parsons và cộng sự, trên một mẫu đã bị phân hủy cao cho thấy, Vùng nhân lặp của STR Mồi mini STR Mồi mini STR Mồi PCR thông thường Mồi PCR thông thường Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 10 mặc dù hệ 16 locus STR thông thường bao gồm 6 locus STR kích thước lớn nhất bị mất alen khi phân tích thì thông tin di truyền của nó vẫn cung cấp khả năng truy nguyên cá thể có độ tin cậy cao hơn bộ mini-STR 6 locus với đầy đủ 100% thông tin di truyền. Để có đủ lượng thông tin di truyền cho một phép tính truy nguyên cá thể tin cậy thì cần có hồ sơ hoàn chỉnh của bộ MiniFilerTM kết hợp với một phần kiểu gen của các locus trong bộ KIT Identifiler®[39]. 1.1.3.3. Vùng siêu biến HV1 và HV2 của ADN ti thể Nhận diện cá thể người dựa vào phân tích trình tự hai đoạn siêu biến đặc trưng (HV1 và HV2) trong vùng điều khiển. Vùng siêu biến I có kích thước 342 bp từ vị trí 16024 đến vị trí 16356, vùng siêu biến II có độ dài 268 bp từ vị trí 73 đến 340 Phân tích ADN ti thể được thực hiện dựa trên cơ sở đặc tính di truyền theo dòng mẹ của các phân tử ADN mạch vòng kép nằm trong tế bào chất. Các phân tích mtADN được thực hiện để bổ sung thông tin di truyền cho hồ sơ ADN từ các mẫu khó khi mà các phân tích STR, mini-STR không cho kết quả đầy đủ hoặc không có kết quả. Ti thể là bào quan có số lượng có thể lên tới hàng trăm bản sao trong mỗi tế bào, cấu trúc vòng kép của phân tử mtADN cũng có thể khiến nó bền vững trước tác động của enzyme exonuclease nội bào hơn so với nADN. Đồng thời, vị trí linh hoạt của mtADN trong tế bào chất dường như cũng bảo vệ nó tốt hơn trước các cơ chế thoái hóa ADN [17]. Vì vậy tỉ lệ thành công của xét nghiệm mtADN trên các mẫu hài cốt sẽ cao hơn so với các phân tích nADN. Mặc dù là một công cụ tin cậy và hiện nay đang được tiến hành rộng rãi trong phân tích nhận dạng mẫu hài cốt lâu năm tại Việt Nam nhưng phân tích ADN ty thể chỉ cho phép xác định đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không xác định được cá thể như đối với nADN, do đó thường chỉ được sử dụng trong việc bổ sung thông tin trong công tác nhận dạng cá thể. 1.1.3.4. Đa hình nucleotide đơn (SNP) Một SNP được định nghĩa là một biến thể trình tự DNA xảy ra khi một nucleotide đơn A, T, C hay G trong hệ gen khác biệt so với các cá thể khác trong cùng một loài sinh học hoặc so với sợi nhiễm sắc thể còn lại trong cặp nhiễm sắc Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 11 thể tương đồng. Ví dụ, hai đoạn trình tự tương ứng của hai cá thể khác nhau, AAGCCTA với AAGCTTA, chứa một sự khác biệt trong các nucleotide đó là hai alen C và T. Sự phân bố của các SNP trong hệ gen không đồng nhất, SNP thường xảy ra trong các vùng không mã hóa hơn các vùng mã hóa và hầu hết các SNP đều ở dạng hai alen. Các chỉ thị SNP có thể được phân loại theo bốn nhóm ứng dụng như sau [16],[18],[23]: - Phát triển các hệ locus SNP trên NST thường phục vụ truy nguyên cá thể và xét nghiệm huyết thống: là tập hợp các SNP có độ phân biệt cá thể cao, cho phép một xác suất rất thấp hai cá thể có cùng một kiểu gen. - Phục dựng ngoại hình: Sử dụng các chỉ thị SNP để phục dựng kiểu hình cá thể như màu da, màu tóc, màu mắt... sử dụng cho mục đích định hướng điều tra. - Phân tích phả hệ dựa trên các nhóm SNP nằm trên NST Y và các SNP ti thể: là hệ các SNP liên kết chặt chẽ do thiếu sự tái tổ hợp, có chức năng đánh dấu haplotype, có thể sử dụng để xác định danh tính người mất tích thông qua quan hệ họ hàng, đặc biệt trong trường hợp các mẫu tham khảo và mẫu cần định danh bị ngăn cách bởi nhiều thế hệ. - Phân tích, xác định mối quan hệ gần gũi, xây dựng cây phát sinh tiến hóa quần thể giữa các quần thể người. Kỹ thuật phân tích SNP không phải là một kỹ thuật mới. Trong thực tế, nó là những chỉ thị đầu tiên dựa trên nền tảng công nghệ PCR ứng dụng trong nhận dạng cá thể. Tuy nhiên do tính chất có hai alen của hầu hết các SNP, lượng thông tin di truyền của SNP ít hơn STR rất nhiều trong nhận dạng cá thể, thông thường phải sử dụng tổ hợp của 45-60 locus SNP mới cho lượng thông tin đủ độ tin cậy tương đương với khả năng phân biệt của 9-16 locus STR [45]. Đối với các trường hợp thông thường thì STR có ưu thế tốt hơn SNP, chính vì thế hiện nay cơ sở dữ liệu ADN cấp quốc gia của các nước trên thế giới đều được xây dựng dựa trên các hệ STR. Về mặt di truyền quần thể, các locus STR cũng được nghiên cứu rộng rãi, tần suất phân bố alen của các locus STR được xây dựng cho nhiều quần thể người khác nhau trong khi các SNP vẫn chưa được nghiên cứu di truyền trên nhiều quần thể. Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 12 1.2. Các nguồn ADN sử dụng trong phân tích mẫu hài cốt Không giống như dấu vân tay, chỉ thị protein hoặc đặc trưng nha khoa, các xét nghiệm dựa trên ADN không bị giới hạn ở bất kỳ phần/mô nào của cơ thể. Tuy nhiên, trong các trường hợp khi phân tích ADN từ nguồn mẫu mô mềm trở nên khó khăn như đối với những mẫu sinh học đã phân hủy trong một thời gian dài thì nguồn mẫu cung cấp ADN chỉ còn là các mô cứng như xương và răng. Một thách thức trong phân tích ADN từ xương là hạn chế về thu hồi ADN từ các mẫu lâu năm, đã bị phân hủy mạnh. Việc hiểu rõ đặc điểm của ADN tồn tại trong các mẫu hài cốt (xương, răng) lâu năm là cơ sở để thực hiện các kỹ thuật thu giữ, bảo quản, xử lý và tách chiết ADN để có được hiệu quả thu hồi ADN có hàm lượng và độ tinh sạch cao, đảm bảo cho phân tích, nhận dạng cá thể trong giám định pháp y. 1.2.1. Xương 1.2.1.1. Cấu trúc xương Xương là loại mô liên kết đặc biệt đã bị canxi hóa và có cấu trúc dạng lá. Bằng mắt thường, cấu trúc một xương gồm 2 dạng cấu tạo đại thể: Xương dẹt và đầu khớp của xương dài: gồm có một lớp bên ngoài vững chắc (vỏ xương) bao quanh một mạng lưới chịu tải hình thành từ lá xương tạo thành một hệ thống vách mỏng không đều được gọi là bè xương, xếp theo nhiều hướng khác nhau và có thể nối với nhau gọi là mô xốp (trabeculae – còn gọi là cancellous). Giữa các bè có những hốc chứa tủy xương. Trục xương dài: không có hốc, có các lá xương tạo thành những cấu trúc đặc biệt được gọi là hệ thống Havers. Mỗi hệ thống có dạng hình trụ, gồm những lá xương xếp vòng, ở chính giữa khối trụ đó là ống Havers chứa mạch, mô liên kết. Ở mức độ hiển vi, xương cấu tạo từ vật liệu cứng, đồng nhất, bên trong hoặc xen lẫn giữa chúng là ba loại tế bào đặc trưng bao gồm: tạo cốt bào, cốt bào và hủy cốt bào. Những tế bào này phân bố đều khắp các bề mặt của xương, tùy thuộc vào trạng thái sinh lý của mô xương (đang trong quá trình hình thành bè xương, khoáng hóa chất nền xương hay sửa chữa). Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 13 Hình 1.3: Hình ảnh chụp hiển vi của 03 loại tế bào xương Tạo cốt bào (osteoblast – nguyên bào xương) là những tế bào đơn nhân chưa trưởng thành chịu trách nhiệm cho sự hình thành xương, về sau tự nằm trong ổ xương khi đã tạo ra chất nền xung quanh nó và trở thành cốt bào. Nằm trên bề mặt của giá đỡ tạo xương, chúng tiết osteoid (một loại hỗn hợp các protein) mà sau này bị canxi hóa bằng cách liên kết với hydroapatite (HA - một chất carbon chưa cân bằng hóa học) để hình thành các bè xương. Tạo cốt bào cũng sản xuất enzyme tham gia vào quá trình canxi hóa, ví dụ như prostaglandin (ức chế hoạt động của hủy cốt bào) hoặc alkaline phosphate (tăng khả năng di động của hủy cốt bào làm tăng hủy xương). Nguồn gốc của chúng là từ một loại tế bào trung mô chưa biệt hóa gọi là tế bào sinh xương. Cốt bào (Osteocyte) là những tế bào xương trưởng thành hình ngôi sao nằm trong một hốc nhỏ của chất gian bào gọi là ổ xương (lacunae). Chúng có nguồn gốc từ các tạo cốt bào. Hủy cốt bào (osteoclasts) là những tế bào đa nhân lớn, có thể từ 3 đến vài chục nhân, nằm trên vách xương trong một cấu trúc gọi là ổ Howship (hay hố tái hấp thu), trong bào tương có nhiều ti thể, các bào quan khác kém phát triển. Chúng là tế bào tiêu hủy xương và hủy sụn nhiễm can xi với cường độ cao, đóng vai trò quyết định trong việc tu sửa xương. Các hủy cốt bào có nguồn gốc từ một dòng tế bào đơn nhân (mono bào) đặc biệt trong tủy xương [38]. 1.2.1.2. Sự tồn tại của ADN trong xương Thời gian tồn tại của mô xương sau khi cơ thể chết phụ thuộc điều kiện môi trường như chôn trong đất, phơi trực tiếp trong không khí hay ngâm trong nước Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 14 (mặn hoặc ngọt). Dưới tác động của các nhân tố hữu cơ hoặc vô cơ, quá trình phân hủy xương diễn ra theo một cơ chế xác định, ví dụ như trong đất thì xương phân hủy do nấm, vi khuẩn trong đất xâm nhập vào các khe hở màng xương và bắt đầu phân hủy ma trận khoáng, chất nền xương sau một vài năm, còn với môi trường nước thì vi khuẩn lam có vai trò quyết định, chúng đẩy nhanh sự phân hủy bằng cách tăng độ xốp của xương [41]. Mặc dù cơ chế phân hủy của mô xương đã được nghiên cứu rõ ràng nhưng sự thoái hóa của ADN trong xương theo thời gian, đặc biệt là nguồn gốc và vị trí ADN nằm trong xương lại chưa được làm rõ, còn tồn tại nhiều câu hỏi và giả thuyết trái ngược. Tuy nhiên, hầu hết các giả thuyết đều thống nhất rằng: ADN trong mô xương mới phần lớn có nguồn gốc từ các tế bào xương, còn với các xương lâu năm ADN có nguồn gốc từ ma trận khoáng. Sự tồn tại ADN lâu dài trong xương là nhờ vào ma trận khoáng và quá trình canxi hóa đóng vai trò quan trọng trong việc “lưu trữ, bảo quản” ADN [40]. Đây cũng là cơ sở khoa học của bước decanxi (khử khoáng) được áp dụng trong hầu hết các phương pháp tách chiết ADN từ xương. 1.2.2. Răng 1.2.2.1. Cấu trúc răng Răng là mô cứng nhất trong cơ thể người và đề kháng tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường như độ ẩm, nhiệt độ cao và hoạt động của vi sinh vật [31]. Răng được coi là một nguồn cung cấp ADN truyền thống khi các mẫu khác bị mất hoặc không cung cấp đủ ADN cho nhận dạng cá thể. Vị trí của răng trong giải phẫu (nằm trong hốc xương) và cấu trúc hình thái học (lớp men răng cứng, chắc bao ngoài) khiến ADN nội sinh của răng được bảo vệ tốt trước các cơ chế thoái hóa sau khi chết. Một chiếc răng của con người điển hình bao gồm một lớp ngoài bao phủ bởi lớp men, một khoang tủy bọc bởi mô ngà và 1-4 rễ. Mỗi gốc được lót bằng một lớp cementum và có một đỉnh ở mũi để giúp cho các dây thần kinh và mạch máu đi thông vào khoang tủy (Hình 1.5). Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 15 Hình 1.4: Cấu trúc điển hình của răng người [13]. 1.2.2.2. Vị trí của ADN trong răng Phần men răng cấu tạo từ các thành phần vô bào, không chứa ADN. Tủy răng, ngà răng là những phần cung cấp ADN tốt cho các phân tích kiểu gen. Đối với răng mới, chưa bị phân hủy thì tất cả các phần (tủy, ngà răng) đều cung cấp đủ số lượng nADN và mtADN, tuy nhiên số lượng của hai loại ADN trong các mô khác nhau của răng có sự khác biệt lớn sau khi chết. Phân tích mô học và qADN răng bị phân hủy qua các khoảng thời gian sau chết khác nhau cho thấy sự toàn vẹn về cấu trúc và trình tự của nADN trong tủy và ngà răng suy giảm nhanh chóng. Khoảng 8 tháng đối với tủy răng và 16 tháng đối với ngà răng, cả nADN và mtADN đều không thu được ở phần mô này [13]. Ở lớp cementum, nhờ cấu trúc vững chắc, lượng nADN được bảo quản ở đây bền vững sau thời gian sau khi chết, lượng mtADN lại được bảo tồn tốt hơn ở phần cementum nằm ở chân răng. Điều này được giải thích có thể do mật độ tế bào và các ma trận khoáng ở hai mô. Ở tủy răng và ngà răng ADN được tách từ các tế bào, quá trình phân hủy các tế bào mô mềm trong tủy răng diễn ra nhanh chóng, thông thường sau khi chết một năm thì lượng tàn dư tủy trong răng đã phân hủy hết. Phân tích mô học cũng cho thấy ngà răng có sự thay đổi cấu trúc rất lớn, xảy ra chủ yếu ở lớp bên ngoài, phía tiếp xúc với tủy răng (lớp pre-dentine), đến khoảng 2 năm sau chết thì lớp pre-dentine này hoàn toàn biến mất Thân răng Chân răng Men răng Nướu/Lợi Ngà Tủy buồng Tủy chân răng Chóp răng Mạch máu + Dây thần kinh = tủy răng Xương hàm Cementum Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 16 [13]. Ở lớp cementum thì nguồn cung cấp nADN nằm ở các tế bào cementoblast và cementocytes. Chúng có cấu trúc và chức năng tương tự như các các tế bào tạo cốt bào và cốt bào ở mô xương. Cũng tương tự như quá trình tạo xương, sự tạo thành của lớp cementum là quá trình canxi hóa của các cementocytes, và các phân tử ADN của cementocytes sẽ được bảo quản lâu dài trong các tinh thể khoáng. Sự tồn tại của mtADN trong phần chân răng lại có thể được giải thích bằng quá trình biệt hóa của các tế bào odontoblast (tế bào của thần kinh mào gốc phân bố trên bề mặt ngoài của tủy răng) trong quá trình hình thành ngà răng (dentinogenesis) và các lớp dưới men răng và cementum xảy ra ở chân răng (hình 1.6). Ngà răng bao gồm các ống được liên kết chặt chẽ, phần chân răng nơi diễn ra sự biệt hóa mạnh mẽ các ống này có chứa các tế bào ondotoblast cùng các ti thể sợi thần kinh phong phú. Sau khi chết, trong quá trình phân hủy các mtADN trong ty thể có khả năng bị mắc kẹt lại trong ống ngà và được bảo vệ bởi các ma trận khoáng của cementum [13]. Hình 1.5: Lớp tế bào odontoblast (mũi tên) xếp thành lớp trên bề mặt khoang tủy răng và ống tủy, nơi có quá trình biệt hóa hình thành lớp phức hợp ngà-tủy răng. Điều này cho thấy mtADN và nADN rõ ràng không phân bố đều khắp các mô răng. Các phương pháp tách chiết ADN từ răng thường nghiền toàn bộ răng thành bột để có thể tiếp cận được phần tủy và ngà răng, cũng có phương pháp ngâm răng trong đệm phân hủy qua đêm để loại bỏ lớp men răng bao ngoài. Thực tế thí nghiệm với răng lâu năm cho thấy lượng ADN thu được tốt nhất là từ các mẫu bột răng nghiền, tuy nhiên phương pháp này cũng đồng thời gia tăng đáng kể lượng các chất ức chế PCR trong khuôn ADN sau tách chiết. Vấn đề này có thể khắc phục Men răng Buồng tủy Ngà răng Cementum Phức hợp Ngà - Tủy răng Odontoblast Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 17 bằng cách chỉ lấy mẫu ở những phần của răng mà cung cấp ADN phong phú, đủ chất lượng cho mục đích phân tích di truyền tiếp theo. 1.2.3. Sự tồn tại và khả năng thu được ADN trong các bộ phận khác nhau của mẫu hài cốt Các dữ liệu thực nghiệm cho thấy, trong trường hợp có thể, việc lựa chọn mẫu thí nghiệm cẩn thận sẽ giảm bớt số lần lặp lại thí nghiệm, tiết kiệm thời gian và công sức. Từ năm 1994 đến 2004, phòng thí nghiệm AFDIL (Armed Forces DNA Identification Laboratory - USA) đã xử lý hơn 2000 mẫu xương cổ có nguồn gốc từ thế chiến II, chiến tranh Triều Tiên và chiến tranh Việt Nam. Nghiên cứu này cho thấy các xương chịu lực (có cấu trúc xương đặc) như xương đùi, xương chày là các loại mẫu cung cấp lượng ADN tốt nhất. Xương bàn chân, mặc dù cũng là xương chịu lực nhưng cấu tạo từ các xương nhỏ, dễ bị phân mảnh cho nên khó thu đủ một mảnh xương có khối lượng mẫu cần thiết, mặc dù với mẫu xương này thì tỉ lệ thành công khá lớn, khoảng 80% thí nghiệm cho kết quả phân tích tốt. Xương sườn cũng cho kết quả phân tích thành công, mặc dù khá khó để thu mẫu hoàn chỉnh. Các mẫu xương sọ, xương đốt sống là những mẫu cho kết quả kém (do cấu trúc xốp, dễ bị tác động xấu bởi các yếu tố môi trường). Hình 1.6 mô tả các khu vực mẫu xương và kết quả phân tích di truyền thành công tương ứng. Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 18 Hình 1.6: Sơ đồ các khu vực mẫu xương và mức độ thành công của các phân tích ADN tương ứng [15] Nhìn chung, các xương có phần vỏ xương dày đặc (xương dài) nên là các mẫu ưu tiên khi thu mẫu, có lẽ do ở phần xương này có lớp ma trận khoáng - protein dày đặc nên phần ADN được bảo quản tốt hơn so với những phần xương xốp. Ngoài các mẫu xương dài, các mẫu răng nhờ cấu trúc cứng, chắc đặc biệt của mình là một trong những mẫu tốt cho các phân tích ADN. Mặc dù mẫu răng hàm dễ thu hơn mẫu xương dài nhưng có một số đối tượng mà răng không thể sử dụng cho các xét nghiệm ADN, ví dụ như trong các trường hợp đối tượng cần giám định thuộc độ tuổi nhi đồng hoặc thiếu niên. Đã có những Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 19 nghiên cứu cho thấy tuổi khi chết của hài cốt lâu năm có ảnh hưởng đến lượng nADN thu được từ răng, nguyên nhân có thể do răng trưởng thành có nhiều khoáng, ít xốp đồng thời lỗ tủy ở chân răng cũng hẹp hơn răng người trẻ tuổi [13], vì vậy răng người trưởng thành có khả năng chống lại sự xâm nhập của độ ẩm, vi khuẩn qua bề mặt và lỗ chân răng, giảm những ảnh hưởng tiêu cực của môi trường lên sự suy thoái ADN bên trong răng. 1.3. Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm trên thế giới Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Thu nhận hồ sơ ADN (cả mtADN và nADN) từ xương thường gặp nhiều khó khăn do nguồn ADN tách chiết thường đã bị thoái hóa mạnh, số lượng ít và sự hiện diện của nhiều chất ức chế PCR. Một phương pháp tách chiết ADN từ xương tối ưu sẽ đồng thời phục hồi lượng ADN lớn nhất và loại bỏ tốt nhất các yếu tố ức chế PCR. Các qui trình tách chiết ADN còn lại từ xương rất khác nhau, có hai phương pháp thông thường thường được sử dụng gồm có: tách hữu cơ (sử dụng phenol/chloroform) và tách vô cơ (silica hoặc hạt từ). Phương pháp hữu cơ có hiệu quả trong việc loại bỏ các protein và chất béo từ dịch chiết ADN, tuy nhiên nó lại không hiệu quả đối với việc loại bỏ các chất ức chế PCR như acid humic đồng thời nó tốn thời gian, thao tác phức tạp và các dung môi sử dụng độc hại. Vì vậy, nhiều nhóm nghiên cứu và các hãng thương mại đã nỗ lực phát triển các phương pháp khai thác vô cơ. Đa số các phương pháp này sử dụng các khả năng hấp thụ thuận nghịch của silica hoặc hạt lõi từ đối với các phân tử ADN dựa trên nồng độ muối. Từ lâu, tách chiết ADN từ xương lâu năm đã được nhiều tác giả quan tâm và nghiên cứu. Bảng 1.1 trình bày tổng hợp các qui trình tách chiết ADN từ xương lâu năm và xương cổ đại đã được công bố. Khóa học 2014-2016 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học Trần Thị Hạnh 20 Bảng 1.1: Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm đã được công bố trên thế giới Tác giả Mẫu hài cốt Phương pháp tách chiết ADN Chỉ thị phân tử Kết quả Kurosaki và cộng sự (1993) [28] Các mẫu hài cốt người được lấy ở Nhật Bản, từ thế kỉ 1 đến thế kỉ 5 Sử dụng EDTA để loại khoáng có trong xương. Tách chiết bằng phenol/chloroform/isoamyl alcohol, ethanol dùng để tủa ADN. Tinh sạch bằng cột silica. Trình tự lặp lại ngắn (Short- VNTR) Thu được kiểu gen Short-