Luận văn Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất nitril cảu hai Auronol alphitonin và maesopsin và hoạt tính sinh học của chúng

òng tế b o thường: NIH/3T3 (Nguyên bào sợi của phôi chu t là tế bào lành) Môi trường nuôi cấy tế bào là DMEM ( ulbecco′s Modified Eagle′s medium) và các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco, Invitrogen b/ Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro: ược thực hiện theo thường quy nuôi cấy của Ngân hàng tế bào Mỹ - American Type Cell Collection (ATCC - Manassas, VA 20110 USA). Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 29 Phương ph p x c định hoạt tính gây đ c tế bào tế bào in vitro: Được thực hiện theo phương ph p của Monks và cs ( 99 ) Phương ph p n y được Viện Ung thư Qu c gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử đ đ c tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng k m h m sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến h nh x c định h m lượng protein tế bào tổng s dựa vào mật đ quang học (OD – Optical ensity) đo được khi thành phần protein của tế b o được nhu m bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị O m y đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein o đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 30 HƢƠNG 3 - TH NGHIỆM 3.1. TỔNG HỢP H I URONOL LPHITONIN VÀ M ESOPSIN 3.1.1. Bán tổng hợp Alphitonin lphitonin đ được tổng hợp theo phương ph p của Kiehlmann bằng phản ứng đồng phân hóa taxifolin Taxifolin đ được điều chế từ sự thủy phân astilbin m t hợp chất có h m lượng rất cao (~ 1%) trong rễ cây Thổ phục linh (Smilax glabra Wall ex Roxb.) ở Việt Nam [5]. c bước phân lập astilbin, điều chế taxifolin và phản ứng đồng phân hóa taxifolin được tr nh b y trong sơ đồ sau: Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin (3) stilbin đ được phân lập từ rễ thổ phục linh Việt nam tại phòng Công nghệ Hóa dược – Viện Hóa sinh biển Chất 1 (Astilbin) là chất rắn màu trắng, tnc: 183 0 C – 1850C FT-IR max (cm -1 ): 3427, 3263, 2912, 1640, 1603, 1519, 1476, 1363, 1301, 1177, 1070, 977. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6,86 ( H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6′), 6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), ,9 ( H, d, J = 2,0 Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 31 Hz, H-6), 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,10 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-2), 4,60 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-3), 4,28 (1H, dq, J = 6,0, 9,6 Hz, H- ′′), , 7 (1H, d, J = 1,5 Hz, H- ′′), ,68 ( H, dd, J = 3,0, 9,6 Hz, H- ′′), , 6 ( H, dd, J = 1,5, 3,0 Hz, H- ′′), , (1H, m, H- ′′), , ( H, d, J = 6,0 Hz, H-6′′). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,0 (C=O), 168,5 (C-7), 165,5 (C- 5), 164,1 (C-9), 147,4 (C- ′), 6, ( - ′), 9, ( - ′), , ( -6′), 6, ( - ′), 115,5 (C- ′), , ( -10), 102,1 (C- ′′), 97, ( -6), 96,2 (C-8), 83,9 (C-2), 78,5 (C-3), 73,8 (C- ′′), 72,2 (C- ′′), 7 ,8 ( - ′′), 7 , ( - ′′), 7,8 ( -6′′) Taxifolin được điều chế từ sự thủy phân astilbin Sơ đồ phản ứng: Hình 3.2. Phản ứng thủy phân astilbin (1) điều chế taxifolin (2) stilbin ( , 9 g; mmol) v MeOH (8 mL) được lần lượt cho v o b nh cầu cổ có lắp sinh h n hồi lưu có phễu nhỏ giọt v đặt tr n bếp gia nhiệt có khuấy từ Hỗn hợp được khuấy cho tan hết astilbin sau đó dung dịch H l % ( , mL; mmol) được nhỏ giọt từ từ v o trong khoảng phút Sau khi nhỏ hết H l, hỗn hợp phản ứng được hồi lưu trong khoảng – giờ, kiểm tra SKLM khi astilbin bị thủy phân ho n to n th dừng phản ứng ất loại bớt dung môi rồi th m H2O (2 – 5mL) v o v chiết hỗn hợp phản ứng bằng ethyl acetate ( × mL) Kết hợp dịch chiết, rửa bằng nước đến pH = rồi l m khan v quay cất loại dung môi thu được sản phẩm thô m u v ng nhạt ( , g) Sản phẩm thô được t ch sắc ký c t nhanh tr n silica gel với hệ n-hexan/EA (1/2; v/v) thu được , 9 g Sau đó được kết tinh lại từ Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 32 hỗn hợp dung dịch MeOH/H2O ( / ; v/v) thu được , 8 g taxifolin m u v ng nhạt, hiệu suất phản ứng đạt 8 % T° n/c: -224º C. Chất 2 (taxifolin) là chất rắn màu trắng FT-IR: νKBr (cm -1 ): 3416, 3195, 2854, 1644, 1614, 1479, 1267, 1169. ESI-MS (m/z ): 303 [M-H] - . 1 H-NMR (CD3OD; 500 MHz): δ (ppm) 6,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ‘); 6,87 ( H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz; H-6‘,); 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- ‘); ,9 ( H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 5,90 (1H, d, J = 2,0 Hz; H-8); 4,93 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-2); 4,52 (1H, d, 11,5 Hz, H-3). 13 C-NMR (CD3OD; 125 MHz): δ (ppm) 198,4 (C=O); 168,7 (C-5), 165,3 (C-7), 164,5 (C-9); 147,2 (C- ‘), 6, ( - ‘), 9,9 ( - ‘), 120,9 (C-6‘); 6, ( - ‘), ,9 ( - ‘), ,9 ( -10); 97,3 (C-6); 96,3 (C-8), 85,1 (C-2); 73,7 (C-3). lphitonin đ được bán tổng hợp từ taxifolin, phản ứng được tiến hành theo qui trình trong tài liệu [- ] theo sơ đồ hình 3.3. Hình 3.3. Sơ đồ bán tổng hợp alphitonin (3) từ taxifolin (2) Hỗn hợp dung dịch của taxifolin (15 mmol), nước DI(105 ml) trong m t bình kín m t cổ được làm lạnh rồi hút chân không và nạp khí nitơ v o Sau đó, b nh phản ứng được đun tr n bếp cách dầu với nhiệt đ dầu truyền nhiệt l n đến 155 oC và thời gian phù hợp 96 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được để ngu i, lọc loại bỏ kết tủa m u v ng được x c định là quercetin. Dịch nước được chiết bằng etylaxetat khoảng 5 lần đến hết sản phẩm auronol (kiểm tra bằng Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 33 SKLM). Dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 , rồi quay cất loại dung môi. Phần cặn thô được phân tách trên c t silicagen với hệ dung môi CH2Cl2/EA(2/1) cho alphitonin (2,964g ) với hiệu suất ~ 65,01%. Chất 3 (Alphitonin) là chất rắn màu vàng nhạt ESI-MS (negative): m/z = 303 [M-H] - . 1 H NMR (Acetone-d6, 500 MHz): δ (ppm) 9,65 (1H, brs, OH), 7,70 (1H, br s, OH), 7,66 (1H, br s, OH), 6,72 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6,6 ( H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), 6,54 (1H, d, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6′), 6, (1H, br s, OH), 5,86 (1H, d, J = 1,5 Hz, H- 5), 5,82 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 3,05 (1H, d, J = 13,5 Hz, Hb-10), 3,02 (1H, d, J = 13,5 Hz, Ha-10). 13 C NMR (Acetone-d6, 125 MHz): δ (ppm) 195,4 (C=O), 172,5 (C-8), 169,6 (C-6), 158,8 (C-4), 145,3 (C- ′), ,7 ( - ′), 6, ( - ′), ,9 ( -6′), 8, ( - ′), , ( - ′), 7, ( -2), 102,7 (C-9), 96,7 (C-5), 91,4 (C-7), 41,8 (C-10). 3.1.2. iều chế maesopsin Maesopsin được điều chế từ sự thủy phân của glucoside maesopsin-4-O-β-D- glucopyranoside (9) là hợp chất được phân lập từ lá cây Chay Bắc b . Phản ứng thủy phân được trình bày theo sơ đồ H nh 3.4. Hình 3.4. Sơ đồ điều chế maesopsin (4) Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 34 Auronol glucoside Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT2, 9) được phân lập từ lá Chay Bắc b tại phòng Công nghệ Hóa dược. ESI-MS (m/z): 449[M-H] ˉ . 1 H-NMR (500 MHz, DMSO): δ (ppm) 9,14 (OH), 7,56, 7,52 (1 × OH), 6,93/6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′,6′), 6,56/6,54 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, ′), 6,00 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 5,93 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 5,20, 5,13, 5,06, 5,01 (4 × OH), 4,97/4,90 (1H, d, J = 7,5 Hz, H- ′′), , 9/ , ( × OH), ,6 / ,6 ( H, br m, Ha-6′′), , 8 ( H, m, Hb-6′′), , 9 - 3,20 (m, H- ′′, H- ′′, H- ′′, H- ′′), 2,96 và 2,90 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz, CH2-10). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO): δ (ppm) 192,8/192,4 (C=O), 171,9 (C-8), 168,5 (C-6), 156,8/156,7 (C-4), 155,9 (C- ′), , ( - ′), , / , 7( - ′), 114,7/114,6 (C- ′), ,6/ , ( -2), 102,0/101,8 (C-9), 99,5/99,3 (C- ′′), 95,8/95,3 (C-5), 91,7/91,5 (C-7), 77,2/77,1 (C- ′′), 76,8/76,7 ( - ′′), 7 , /7 ,9 ( - ′′), 69, /69, ( - ′′), 6 , /6 , ( -6′′), , ( -10). uronol maesopsin thu được từ sự thủy phân auronol glucoside 9 Trong m t bình cầu đ được lắp sinh hàn và máy khuấy từ, gia nhiệt, hỗn hợp dung dịch của chất 9 ( , g; mmol) v MeOH ( mL) được nhỏ từ từ HCl 10% (15 mL) vào trong thời gian phút Sau đó hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong h, kiểm tra SKLM thấy glucoside đ bị thủy phân hết, cất loại dung môi, phần dịch nước còn lại cho vào chiết với EA (5 × 5 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, rửa với nước mu i bão hòa (2 × 5 mL), làm khan bằng Na2SO4 v được cô quay dưới chân không thấp thu được 0,43 g chất rắn. Chất rắn được phân lập bằng SKC c t trên silica gel sử dụng hệ dung môi rửa giải n-hexan/E ( / ) thu được 0,216 g sản phẩm maesopsin với hiệu suất 75%. Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 35 Chất 4 (Maesopsin) là chất rắn màu vàng nhạt ESI-MS (m/z): 286,9 [M-H] - . 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,02 (2H, d, J = 9 Hz, H- ′, H-6′), 6, 9 ( H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H- ′), ,78 ( H, br s, H-7), 5,74 (1H, br s, H-5), 3,08 (2H, brs, CH2-10). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,8(C=O), 173,9 (C-8), 171,0 (C-6), 159,9 (C- 4), 157,2 (C- ‘), , ( - ′, - 6′), ,9 ( - ′), 115,7 (C- ′, - ′), 7, ( -2), 103,1 (C-9), 96,8 (C-5), 91,1 (C- 7), 42,1 (C-10). 3.2. TỔNG HỢP Á DẪN XUẤT NITRILE Ủ H I URONOL ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN Các dẫn xuất nitrile của auronol maesopsin (4), alphitonin (3) được tổng hợp theo sơ đồ Hình 3.5. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất nitrile của chất 3 và 4 Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 36 3.2.1. Tổng hợp dẫn xuất nitrile một nhóm thế của alphitonin và maesopsin Trong m t bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế v được nạp đầy khí N2, hỗn hợp dung dịch của chất 3 (hoặc chất 4) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,069 mL; , mmol) trong dimethylacetamide ( mL) được cho dần NaOH (44 mg; 1,1 mmol) v o Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0oC và 24 giờ ở nhiệt đ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được làm lạnh đến 0o v được trung hòa bằng axit H l N đến pH = 6 rồi chiết với EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4, được cô quay dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn thô được tách trên c t silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất nitrile 1 nhóm thế: chất 5 (hiệu suất 37,5%) hoặc chất 6 (39,8%). Chất 5 Alphitonin-4-O-acetonitrile ESI-MS (negative): m/z = 342 [M-H] - 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 8,65 (2H, br s, OH), 7,51 (1H, br s, OH), 6,54 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6, 9 ( H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), 6, 6 ( H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H- 6′), ,98 ( H, br s, H-5), 5,96 (1H, br s, H-7), 5,19 và 5,13 (2H, 2 × d, J = 16,0 Hz, OCH2-CN), 2,90 và 2,82 (2H, 2 × d, J = 14,0 Hz, CH2-10). 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 192,4 (C=O), 172,3 (C-8), 169,4 (C-6), 155,5 (C-4), 144,4 (C- ′), ,8 ( - ′), ,6 ( - ′), , ( -6′), 7,8 ( - ′), 116,0 (CN), 115,0 (C- ′), ,9 ( -2), 101,3 (C-9), 94,4 (C-5), 92,3 (C-7), 53,5 (O- CH2-CN), 40,7 (C-10). Chất 6: Maesopsin-4-O-acetonitrile ESI-MS (negative): m/z = 326 [M-H]-. Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 37 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 9,12 (1H, br s, OH), 7,49 (1H, br s, OH), 6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H-6′), 6, (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H- ′), ,9 ( H, br s, H-5), 5,87 (1H, br s, H-7), 5,17 và 5,12 (2H, 2 × d, J = 16,5, O-CH2-CN), 2,93 và 2,87 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz, CH2-10). 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 191,8 (C=O), 172,2 (C-8), 170,5 (C-6), 155,8 (C- ′), , (C-4), 131,2 (C- ′, -6′), , ( - ′), 6, ( N), ,6 ( - ′, C- ′), ,8 ( -2), 100,6 (C-9), 94,9 (C-5), 92,4 (C-7), 53,4 (O-CH2-CN), 40,5 (C- 10). 3.2.2. Tổng hợp dẫn xuất nitrile hai nhóm thế của lphitonin và Maesopsin Trong m t bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế v được nạp đầy khí N2, hỗn hợp dung dịch của chất 3 (hoặc chất 4) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,138 mL; , mmol) trong dimethylacetamide ( mL) được cho dần NaOH (88 mg; 2,2 mmol) v o Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0oC và 24 giờ ở nhiệt đ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được làm lạnh đến 0o v được trung hòa bằng acid H l N đến pH = 6 rồi chiết với EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4, được cô quay dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn thô được tách trên c t silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất nitrile 2 nhóm thế: chất 7 (hiệu suất 37%) hoặc chất 8 ( 39%). Chất 7: Alphitonin-4,6-di-(O-acetonitrile) ESI-MS (negative): m/z = 417 [M+2H2O-H] - , 381 [M-H] - . 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,64 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6, (1H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), 6, ( H, dd, J = Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 38 2,0 , 8,0 Hz, H-6′), 6, 8 ( H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 5,00 – 5,12 (4H, m, 2 × O-CH2-CN), 3,10 và 3,06 (2H, d, J = 13,5, CH2-10). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,6 (C=O), 174,7 (C-8), 168,4 (C- 6), 157,0 (C-4), 145,6 (C- ′), , ( - ′), ,9 ( - ′), , (C-6′), 8,7 ( - ′), 116,0, (CN), 115,9 (C- ′, N), 8, ( -2), 106,1 (C-9), 95,9 (C-5), 92,7 (C-7), 55,0 (O-CH2-CN), 54,8 (O-CH2-CN), 42,2 (C-10). Chất 8: Maesopsin-4,6-di-(O-acetonitrile) ESI-MS (negative): m/z = 365 [M-H] - . 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,01 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H-6′), 6,58 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H- ′), 6, 9 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-5), 5,00 – 5,10 (4H, m, 2 × O-CH2-CN), 3,16 và 3,11 (2H, d, J = 14,0 Hz, CH2-10). 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,5 (C=O), 174,6 (C-8), 168,4 (C- 6), 157,3 (C- ′), 7, ( -4), 132,5 (C- ′, -6′), , ( - ′), ,9 ( N), ,8 ( - ′, - ′, N), 8, ( -2), 106,1 (C-9), 96,01 (C-5), 92,7 (C-7), 55,0 (O-CH2-CN), 54,8 (O-CH2-CN), 41,9 (C-10). 3.3. THỬ HO T TÍNH SINH HỌ Ủ Á DẪN XUẤT NITRILE Ã TỔNG HỢP ƢỢ 3.3.1. Hoạt tính kích thích lympho bào Phương pháp phân lập tế bào lympho tổng số: ml m u được lấy từ tĩnh mạch thỏ khỏe mạnh, ch ng đông bằng heparin và phủ lên thể tích ficoll paque tương đương Sau đó ly tâm ở t c đ 3000 vòng / phút trong 30 phút. Tách, thu lấy lớp giữa, loại bỏ hồng cầu còn lại bằng NH4Cl. Sau khi ly tâm, cặn tế b o được hòa lại trong HBSS. S tế b o được đếm bằng buồng đếm neubaurer. Tế bào lympho sau khi thu nhận được hòa lại trong môi trường nuôi cấy Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 39 RPMI có bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) với nồng đ tế bào 2 × 10 6 tế bào/mL. Phương pháp xác định khả năng kích thích miễn dịch thông qua tăng sinh tế bào lympho Phép thử được thực hiện như sau: Tế bào lympho (180 L ) được đưa v o c c giếng của đĩa 96 giếng với nồng đ 2 × 106 tế bào/mL. Các chất thử 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 (phân lập và tổng hợp), pha trong DMSO % được đưa v o c c giếng của khay 96 giếng để có nồng đ là 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL oncavalin được sử dụng l m đ i chứng với nồng đ là 5 g/mL, 2,5 g/mL, 1,25 g/mL và 0,625 g/mL. Mẫu được ủ trong 48h ở 37 o C, 5% CO2. 3 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào (180 L) sẽ được sử dụng l m đ i chứng âm. Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50 L MTT 1 mg/mL. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37o C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi giếng 100 L MSO ĩa tế b o được đưa l n m y lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về h m lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sóng 490nm. Chỉ s kích thích (SI – stimulate index) được tính theo công thức: Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. MSO % luôn được sử dụng như đ i chứng âm. Chất thử nào có SI > 1,2 sẽ được xem là có khả năng kích thích miễn dịch. Nồng đ kích thích 50% sự phát Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 40 triển của tế bào (SD50 – Stimulate Dose at SI= 1,5) sẽ được x c định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 3.3.2. Hoạt tính độc tế bào Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro Các dòng tế b o được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, 1% PSF (Penicilline-Streptomycine-Fungizone), ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO). Tế b o được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1/3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37 o C, 5% CO2. Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau: Chất thử (20 L) pha trong MSO % được đưa v o c c giếng của khay 96 giếng để có nồng đ 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0.8 g/mL. Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế b o v đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật đ cho phù hợp với thí nghiệm. Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 L môi trường) v để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày. M t khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT ( 8 L) sẽ được sử dụng l m đ i chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đ i chứng ngày 0 sẽ được c định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA. Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế b o được c định v o đ y giếng bằng T trong phút, được nhu m bằng SRB trong 1 giờ ở 37 o ổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt đ phòng. Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 41 Cu i cùng, sử dụng mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đ bám và nhu m các phân tử protein, đưa l n m y lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về h m lượng màu của chất nhu m SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng s ng sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được x c định thông qua công thức sau: % ức chế = 100% - % sống sót Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như l chất đ i chứng dương v được thử nghiệm ở các nồng đ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL. MSO % luôn được sử dụng như đ i chứng âm. Giá trị IC50 (nồng đ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được x c định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2DV4. Chất thử nào có IC50 < 20 g/mL (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4 g/mL (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây đ c tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT. Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 42 HƢƠNG 4 - ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. TỔNG HỢP H I URONOL LPHITONIN VÀ M ESOPSIN 4.1.1. Bán tổng hợp auronol alphitonin Hình 4.1. Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin Alphitonin (3) đ được chúng tôi nghiên cứu tổng hợp theo phương ph p của Kielhmann bằng phản ứng đồng phân hóa taxifolin dưới tác dụng của nhiệt Phương pháp này thể hiện nhiều ưu điểm là nguyên liệu từ nguồn thực vật trong nước, phản ứng chỉ có bước và sử dụng dung môi nước rất thân thiện với môi trường. Hợp chất đầu taxifolin được điều chế từ astilbin có h m lượng rất cao (~ 1%) trong rễ Thổ phục linh (S. glabra) [5]. Astilbin được phân lập tại phòng Công nghệ Hóa dược có s liệu phổ phù hợp với tài liệu [5 ] Taxifolin (C15H22O7, 2) thu được từ sự thủy phân của astilbin là nguồn nguyên liệu cho việc nghiên cứu bán tổng hợp alphitonin. Astilbin đ được thủy phân bằng H l/MeOH theo phương ph p thông thường. Sản phẩm thủy phân đ được phân lập kết hợp SKC và kết tinh thu được taxifolin sạch. Cấu trúc của sản phẩm đ được x c định bằng c c phương ph p phổ phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ của taxifolin đ được công b . Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 43 Phổ kh i ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm giả phân tử [M-H]ˉ với m/z= phù hợp với trọng lượng phân tử taxifolin Tr n phổ proton 1H-NMR của sản phẩm thủy phân, taxifolin, không còn c c tín hiệu của đường Rhamnose, chỉ còn c c tín hiệu của c c proton của vòng , B, Ở vùng trường thơm l tín hiệu của proton methine thơm của vòng v B, vòng B cho c c tín hiệu của c c proton thơm hệ BX ở δC 6,98 ppm (d, H- ′) với Jmeta = , Hz, ở δC 6,87 (dd, H-6′) với Jmeta = 2,0 Hz và Jortho = 8, Hz, ở δC 6,82 (d, H- ′) với J = 8,0 Hz; vòng A cho các tín hiệu doublet của proton thơm meta ở δC 5,94(d, H-5); 5,90 (d, H-7) với Jmeta = 2,0 Hz Ở trường cao hơn l cặp doublet của vòng ở δC 4,92 (d, H-2) và δC 4,52 (d, H- ) với J = , Hz l tương t c của c c Haxial vicinal ở vị trí trans. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 (H nh) cho tín hiệu của carbon của khung flavonol ít thay đổi so với trong phân tử glucoside (astilbin) Hai vòng v B cho c c tín hiệu của carbon ở vùng trường thơm gồm tín hiệu của carbon thơm li n kết với oxy của ở δC 168,71 (C-7), 165,32 (C-5), 164,52 (C-9); 147,15 (C- ′), 146,32 (C- ′) v carbon methine thơm ở δC 120,90 (C-6′); 6, ( - ′), ,89 (C- ′), 97, ( -6); 96,28 (C-8) v carbon thơm bậc ở δC 129,88 (C- ′), ,8 (C- ) Vòng cho tín hiệu ở δC 198,41 (CO); 85,13 (C-2); 73,68 (C-3). Các tín hiệu n y khẳng định khung chắc chắn của flavonol taxifolin Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 44 Hình 4.2. Phổ 1H-NMR giãn của chất 2 (CD3OD) Hình 4.3. Phổ 13C-NMR của chất 2 (CD3OD) Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 45 Phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin Hình 4.4. Sơ đồ phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin Phản ứng đồng phân hóa taxifolin được giả thiết xảy ra theo cơ chế tr nh b y trong Hình 4.5. Hình 4.5. Sơ đồ cơ chế phản ứng đồng phân hóa taxifolin Theo Kielhmann, Paul ở nhiệt đ cao hay có mặt của xúc tác acid/base, liên kết 1-2 (C-O) trong vòng dị t C mở ra tạo thành quinone methide 2a. Hợp chất Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 46 quinone methide 2a hoặc có thể đóng vòng lại cho hỗn hợp sản phẩm 2d gồm 4 đồng phân (±)-taxifolin và (±)-epimertaxifolin; hoặc tautomer hóa hình thành chalcone 2b rồi diketone 2c v đóng vòng với sự cấu trúc lại thành vòng 5 bền hơn cho sản phẩm (±)-alphitonin (3) Paul đ chứng minh sự có mặt của đồng phân (±)-taxifolin và (±)-epimertaxifolin trong giai đoạn đầu của hỗn hợp phản ứng dựa trên phổ v đ phân lập được cả đồng phân này. Quá trình cấu trúc lại thành vòng 5 hình thành (±)-alphitonin đ được cả Kielhmann v Paul đề nghị qua hợp chất trung gian diketone 2c ể giải thích cho sự hình thành sản phẩm racemate Paul đ đưa ra trạng thái chuyển tiếp của diketone 2c kết hợp với 2 phân tử nước với các mức năng lượng nhỏ có thể dễ d ng vượt qua ở nhiệt đ phòng. Do sự racemate nhanh của alphitonin n n không thu được sản phẩm chọn lọc lập thể của phản ứng. Phổ NMR của hợp chất 3 cho c c tín hiệu của c c proton v carbon khung auronol, c c s liệu phổ phù hợp với cấu trúc phân tử v với c c s liệu đ được công b Phổ kh i ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử đề proton hóa [M-H] - với m/z = phù hợp với công thức phân tử 15H12O7. Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 47 Hình 4.6. Phổ ESI-MS của chất 3 Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của chất 3 (acetone- d6) Ở vùng trường thấp phổ proton 1H-NMR (H nh 4.7) cho c c tín hiệu singlet tù của c c proton OH ở δH 9,65, 7,70, 7,76. Ở vùng trường thơm cho tín hiệu của Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 48 proton thơm của vòng v B Vòng B cho tín hiệu của proton dạng BX ở δH 6,72 (d, J = 2 Hz, H- ‘); ở δH 6,61 (d, J = 8,0 Hz, H- ‘) v ở δH 6,54 (dd, J = 2,0 và 8,0 Hz, H-6‘) Vòng cho cặp doublet của c c proton meta ở δH 5,86 (d, H-5) v ở δH 5,82 (d, H-7) với hằng s tương t c Jmeta = 1,5 Hz. Hai proton metylene CH2-10 cho doublet ở δH , v ở δH , với hằng s tương t c Jgem = 13,5 Hz. Hình 4.8. Phổ 13C-NMR của chất 3 (acetone- d6) Phổ carbon 13C-NMR (H nh 4.8) cho tín hiệu của carbon khung auronol bao gồm carbon thơm vòng v B, carbon thu c vòng v m t carbon methylene Hai vòng thơm , B cho tín hiệu của carbon thơm li n kết với oxy ở C 172,5(C-8), 169,6 (C-6), 158,8 (C-4), 145,3 (C- ‘) và 144,7 (C- ‘); 6 tín hiệu của 6 carbon methine thơm ở C 122,9 (C- ‘), 118,5 (C-6‘), , ( - ‘), ở C 96,7 và 91,4 (C-5 và C- 7), tín hiệu của carbon thơm bậc ở C 126,3 (C- ‘) v ,7 (C-9). Vòng cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 195,4 (3- =O) v tín hiệu của carbon hemicetal ở C 107,0 (C- ) Ở trường cao l tín hiệu của carbon methylene C- ở C ,8 Như vậy c c tín hiệu phổ NMR khung auronol của aglycone Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 49 alphitonin (chất 3) ít thay đổi so với trong phân tử glucoside của nó (chất 10) Phổ HSQ (phụ lục) cho c c tương t c -H trực tiếp và HMBC (H nh 4.9) cho các tương t c xa của proton H2-10 (3,05, 3,02 ppm)/C-2 (107,0 ppm)/C- ‘( 6, ppm)/C-6‘ ( ,9 ppm)/ - ‘ ( 8, ppm)/ -3 (19 , ppm), cùng với đ chuyển dịch thấp bất thường của carbon -8 (172,5 ppm) và C-6 ( 69,6 ppm) do ảnh hưởng sức căng vòng (vòng ), đ chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 3. Hình 4.9. Phổ HMBC của chất 3 (acetone- d6) 4.1.2. iều chế Maesopsin Kết quả phân lập hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D- glucopyranoside (9) từ lá cây Chay Bắc b (A. Tonkinensis ) cho thấy hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D-Glc (9) có h m lượng khá lớn trong lá cây Chay Bắc b (> 0,07 %). Vì vậy hợp chất maesopsin-4-O-β-D-Glc (9) đ được sử dụng là nguồn cung cấp auronol maesopsin (4). Từ lá cây Chay Bắc B (10 kg lá khô) đ phân lập được 7 g chất 9 sạch có s liệu phổ phù hợp với tài liệu [- ] Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học 50