Luận văn Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao

sôi nảy nở và nhiễm bệnh (Erwin và Ribeiro, 1996). Ngoài ra, các du động bào tử, các túi bào tử và các hậu bào tử di chuyển được trong đất nhờ nước tưới, nước mưa chảy và đất trôi đi theo. Vì vậy, cần phải xây dựng các vườn cây trên khu đất có hệ thống thoát nước tốt và không bị ngập lụt, đất cần được rút hết nước sâu tới 1,5m. Tạo thành các ụ đất xung quanh cây có thể làm tăng khả năng thoát nước (Broadley, 1992). 1.2.5.3. Các kỹ thuật về giống [31,56]. Theo ước tính gần đây 70% diện tích trồng, giống ca cao ít hoặc chưa qua chọn lọc, là các giống địa phương ít nhiều mang một số đặc điểm cố định. Mục tiêu của chương trình chọn giống ca cao hiện nay là chọn giống năng suất, kháng sâu bệnh, đồng nhất và ổn định về sản lượng, dễ quản lý, cải tiến các tính trạng chất lượng và ít tốn kém (Bekele và cộng sự, 2003). Chọn giống kháng bệnh là biện pháp được chú trọng nhất hiện nay và được coi là mang lại hiệu quả cao (Lass, 1987) nhằm phòng trừ bệnh Phytophthora. Ở Ghana để phòng chống bệnh Phytophthora người ta đã có nhiều chương trình nghiên cứu để tạo ra những giống kháng hoặc chống chịu với bệnh thành công (Abdul-Karimu & Bosompem, 1994). 1.2.5.4.Các kỹ thuật về phân bón [30, 32, 41, 59, ]. Theo Ebon (1978) đã nghiên cứu và đưa ra lượng phân bón trong hai năm đầu tiên được khuyến cáo như trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Lượng phân bón cho ca cao mới trồng trong 2 năm đầu tiên Tuổi cây (tháng) Lượng phân bón cho mỗi cây (g) N P2 O5 K2 O 1 6,4 6,4 6,4 4 8,5 8,5 8,5 8 8,5 8,5 8,5 12 12,8 12,8 12,8 18 17,0 17,0 17,0 24 27,3 27,3 38,5 Theo Ebon (1978) Một số loại sầu riêng trồng ở vùng Bắc Queensland cho thấy việc sử dụng quá nhiều phân vô cơ đã làm tăng bệnh hại trên cây ca cao do Phytophthora palmivora gây ra, trong khi đó phân chuồng hoai và rác phủ cải thiện được tình trạng sạch bệnh của cây. Tan (2000) đã nghiên cứu về những tác động của phân vô cơ lỏng và phân gà ủ hoai đối với sự phát triển của bệnh do Phytophthora palmivora gây hại cây ca cao và sầu riêng. Nghiên cứu kết luận rằng việc sử dụng phân gà hoai giảm đáng kể tác hại và mức độ gây hại của bệnh so với việc sử dụng phân vô cơ. Tỷ lệ cây giống sầu riêng (12 tháng tuổi) trồng trên đất có nhiễm P. palmivora nhưng được bổ sung hỗn hợp phân gà hoai đã sống sót là 100% và đồng thời nguồn bệnh trong đất đã bị mất đi. Theo Aryantha và cộng sự, 2000, việc bổ sung thêm phân gà nguyên chất hoặc phân gà đã pha trộn vào hỗn hợp bầu đã làm giảm đáng kể P. cinnanomi và ngăn chặn sự phát triển của bệnh trong các cây đậu con. Tất cả các phân hữu cơ đều làm tăng chất hữu cơ ở trong đất, kích thích hoạt động sinh học và làm gia tăng số lượng các xạ khuẩn đối kháng, vi khuẩn huỳnh quang và nấm. 1.2.5.6. Sự bổ sung chất hữu cơ và phủ đất [30]. Việc phủ đất giúp kích thích sự phát triển của rễ cây, làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng, làm giảm hiện tượng bay hơi các chất dinh dưỡng của đất, làm tăng khả năng giữ đất và nước, làm giảm việc nước chảy trên bề mặt, tạo điều kiện thoát nước tốt, ổn định nhiệt độ của đất và cung cấp một lượng chất dinh dưỡng lớn cho các vi khuẩn trong đất (Aryantha và cộng sự, 2000). Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Aryantha và cộng sự, (2000), Lazarovits và cộng sự, (2001), bổ sung các chất hữu cơ như: bột cỏ linh lăng, xơ bông, bột đậu tương, cây lúa mì, phân gà và phân u rê vào đất giúp kích thích sự phát triển của rễ cây, làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng, giảm hiện tượng bay hơi của đất, tăng khả năng giữ đất và nước, giảm việc nước chảy trên bề mặt, tạo điều kiện thoát nước tốt, ổn định nhiệt độ của đất và cung cấp một lượng chất dinh dưỡng lớn cho các vi khuẩn trong đất. Các chất hữu cơ phân huỷ giải phóng ra amoniac và các axit hữu cơ dễ bay hơi có thể diệt bệnh Phytophthora và chất hữu cơ còn lại kích thích các vi sinh vật cạnh tranh đối kháng trong đất, vì vậy việc cung cấp thường xuyên chất hữu cơ cho vườn cây có khả năng hạn chế bệnh do nấm Phytophthora gây nên. 1.2.5.7. Biện pháp sử dụng thuốc hoá học phòng trừ Phytophthora [35, 42, 46] a) Thuốc Boóc đô Hỗn hợp boóc đô đã được sử dụng thành công để phòng trừ rất nhiều bệnh do các loài Phytophthora khác nhau gây ra. Thuốc có tác dụng với bệnh trên tán lá, nhưng các thành phần hoạt tính của nó dễ gây độc đối với một vài loại cây trồng và một số sinh vật phi mục đích. Ngoài ra, Thuốc Boóc đô là một hỗn hợp giữa đồng sun phát với vôi, phải đọc kỹ hướng dẫn khi pha chế loại thuốc này, vì pha sai thuốc dễ bị kết tủa không có khả năng phòng trừ bệnh. Tại các khu vực nhiệt đới có lượng mưa cao, thì thuốc dễ bị rửa trôi (Erwin và Ribeiro, 1996). b) Phosphonates Nhóm hoạt chất này có khả năng trừ bệnh do nấm Phytophthora. Từ “phosphonates” dùng để chỉ muối và các este của axit phốt pho ríc đã giải phóng ra các Anion phosphonates, dạng đặc trưng của phosphonates là Fosety-Al. Trên thị trường hợp chất này được biết đến với tên thương mại là Aliette, đó là một hỗn hợp muối nhôm của Phosphonate (Cohen và Coffey, 1986). Tính hiệu quả của các thuốc Phosphonates đối với các cây trồng hay các loài Phytophthora thì khác nhau, có thể là do sự khác nhau về dạng hoặc mức độ tự phòng vệ của các vật chủ (Guest và cộng sự, 1995). Mặc dù tác dụng kháng nấm của Phosphonates không bị giới hạn chỉ ở các noãn bào tử, nhưng sự thay đổi về hiệu quả kháng nấm đối với một số loài Phytophthora của hoạt chất này vẫn không thể giải thích được. Chẳng hạn như, chất fosetyl-Al rất có tác dụng đối với bệnh thối củ do Phytophthora infestans gây ra, nhưng lại vô hiệu trong việc phòng chống bệnh rụng lá muộn ở khoai tây (Erwin và Ribeiro, 1996). Các biện pháp phòng trừ sinh học đối với bệnh thối đen quả ca cao do nấm Phytophthora palmivora gây ra chưa có công trình nào nghiên cứu cụ thể. Do vậy, cần nghiên cứu và đưa ra được các biện pháp phòng trừ tổng hợp bệnh trên theo hướng an toàn cho môi trường và con người. CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng được nghiên cứu là nấm đối kháng Trichoderma được phân lập từ mẫu đất trồng ca cao được thu thập từ 3 tỉnh Đăk Lăk, Đăk Nông và Bình Phước, có khả năng phòng trừ bệnh thối đen quả cao cao. 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đã phân lập về hình thái, điều kiện phân lập và tuyển chọn đối với nấm Phytophthora gây bệnh thối đen ở quả ca cao - Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ nấm Phytophthora palmivora. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu + Thu thập mẫu đất ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông: Lấy đất quanh vùng rễ của các cây ca cao khỏe, sinh trưởng tốt ở trong vườn. Lấy mẫu đất về bốn phía của cây, gạt nhẹ lớp đất mặt (10 – 15 cm) sau đó lấy sâu xuống khoảng 20 – 25 cm. Mỗi điểm chọn 3 cây, mỗi cây lấy 4 mẫu, mỗi mẫu khoảng 1 kg đất, trộn đều vào nhau, lấy ra 1 kg đất/cây. Trộn đất ở 3 cây vào nhau, sau đó lấy 1kg/mẫu đất mang về phòng thí nghiệm. + Thu thập mẫu bệnh thối đen ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông: Thu thập tất cả các loại triệu chứng bệnh hại trên tất cả các bộ phận của cây liên quan đến bệnh thối đen quả ca cao. Các mẫu bệnh được đựng trong các túi xi măng, giấy báo để trong hộp xốp lạnh. Sau khi thu thập được gửi hoặc mang ngay về phòng thí nghiệm để giám định. Cần ghi rõ các thông tin của mẫu: + Ngày, địa điểm thu mẫu, tên của chủ ruộng lấy mẫu. + Cây trồng (giống, tuổi cây, lịch sử của cây, những cây trồng cùng) + Bộ phận cây bị hại + Đất đai (đất đỏ, đất đồi, đồng bằng, thung lũng), quản lý (phân bón, thuốc trừ sâu bệnh, vệ sinh đồng ruộng) 2.2.2. Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm 2.2.2.1. Phương pháp phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao - Phương pháp phân lập Phytophthora: Sử dụng mồi bẫy Phytophthora (Sử dụng một số loại quả như: đu đủ, ca cao, táo, lê thường phải xanh làm mồi bẫy) từ đất quanh vùng rễ cây bị bệnh hoặc từ mô cây bệnh (Erwin and Riberrio, 1996). - Bẫy Phytophthora từ đất quanh vùng rễ cây bị bệnh. + Chọn đất ẩm trên bề mặt 5 cm của lớp đất dưới lớp rác lá, trong đó có rễ cây. + Đục những lỗ nhỏ bán kính 2 cm trên vỏ trái ca cao xanh hoặc các trái cây khác. + Nhét đất ẩm vào các lỗ vừa đục trên quả dùng làm mỗi bẫy. + Bọc quả trong túi nilon và đặt trong điều kiện phòng. + Kiểm tra quả hàng ngày nếu là bệnh do nấm Phytophthora gây ra thì phần thương tổn màu nâu lan rộng nhưng không thối nhũn. + Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn để phân lập - Bẫy Phytophthora từ mô cây bị bệnh thối đen quả ca cao. + Chọn mô nằm ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ. + Thanh trùng bề mặt bằng ethanol 70% hoặc HgCl2 (1%) khoảng 30 - 60 giây. Rửa sạch với nước cất và lau khô bằng giấy đã được khử trùng. + Cắt mô thành miếng nhỏ (< 5 mm). + Thanh trùng bề mặt quả trái cây, rạch quả và chèn mô bệnh đã thanh trùng vào. + Bọc trái mồi bẫy vào trong túi ni lon để trong nhiệt độ phòng. + Kiểm tra túi ủ hàng ngày, sau 2 - 3 ngày thấy vết thương tổn màu nâu lan rộng chứng tỏ có bị nhiễm Phytophthora. + Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn để phân lập 2.2.2.2. Phân lập Trichoderma từ đất ở các vùng trồng ca cao - Phân lập nấm Trichoderma theo phương pháp của Samuels (2004). Các mẫu rễ và đất vùng rễ của ca cao thu thập trên đồng ruộng được rửa sạch qua vòi nước và khử trùng bề mặt bằng cồn 950 trong 30 giây sau đó rửa bằng cồn 750 trong 2 phút, cuối cùng rửa sạch lại 3 lần bằng nước cất khử trùng và cấy vào môi trường TME, CMA và PRBA. Mẫu đất được pha loãng và cấy trên môi trường TME và PRBA. Các mẫu cấy được ủ ở 250C sau đó được tách thuần trên môi trường PDA. 2.2.2.3. Xác định khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. với nấm Phytophthora sp. được đánh giá theo phương pháp của Seiketov (1982), Bradshaw-Smith và cộng sự (1991). + Môi trường thí nghiệm: PDA + Phương pháp tiến hành: Cấy đối xứng hai bên + Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính ức chế của tản nấm Trichoderma sp. đối với Phytophthora sp. Nấm bệnh Phytophthora palmivora Nấm đối kháng Trichoderma Kẻ một đường ở giữa đĩa petri (phần đáy). Cấy nấm Trichoderma và nấm Phytophthora palmivora trên 2 điểm đối xứng nhau trên đường vừa kẻ. Ủ ở nhiệt độ phòng, theo dõi tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma và chủng nấm Phytophthora palmivora. Tìm hiểu khả năng ức chế của nấm Trichoderma sp. đối với nấm gây bệnh bằng chất kháng sinh bay hơi: dựng 2 đĩa có đường kính bằng nhau, trên môi trường PDA, một đĩa cấy nấm gây bệnh, một đĩa cấy nấm Trichoderma sp., úp 2 đĩa vào nhau và giữ kín hộp đĩa. Đối chứng là cặp Petri cấy nấm gây bệnh. Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của từng loại nấm và khả năng ức chế nấm gây bệnh bởi chất kháng sinh bay hơi do nấm Trichoderma sinh ra. 2.2.2.4. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma sp. + Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, để nuôi cấy nấm Trichoderma có thể sử dụng các môi trường dinh dưỡng tổng hợp lỏng hoặc rắn (có agar) hoặc các nguồn tự nhiên khác từ thực vật (các hạt ngũ cốc phế thải, kho dầu củ cải đường). Có thể nuôi cấy nấm Trichoderma bằng phương pháp cấy chìm hoặc cấy trên bề mặt môi trường. Các nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành theo phương pháp cấy nấm trên bề mặt môi trường có agar. Nấm Trichoderma sp. được cấy trên một số môi trường nuôi cấy thích hợp với nấm đối kháng như PDA, CMA, Chapek. Sau đó được đặt ở điều kiện nhiệt độ: 250C. + Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng khác nhau đến sinh trưởng phát triển của nấm đối kháng: thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Seketov (1982). Thí nghiệm bao gồm các công thức: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng và 12 giờ tối. + Nghiên cứu ảnh hưởng của các độ pH môi trường nuôi cấy đến khả năng phát triển của nấm Trichoderma sp.: các giá trị pH của môi trường nuôi cấy được thí nghiệm là 4, 5, 6, 7, 8. + Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ: Nấm được cấy trên môi trường PDA có độ pH thích hợp (pH = 5 – 6) và đặt ở nhiệt độ: 20, 25, 30, 35, 400C. Chỉ tiêu theo dõi (cho cả 4 thí nghiệm trên): Đường kính khuẩn lạc sau 1, 2, 3 và 4 ngày (cm). + Phương pháp định tính hoạt độ enzym chitinase, β-glucanase và cellulase của nấm Trichoderma. Hoạt độ các enzym chitanase, ß-glucanase và cellulase của nấm Trichoderma được định tính bằng cách đo đường kính vòng phân giải trên môi trường cảm ứng tổng hợp của từng loại enzym (Vi sinh vật học, Nguyễn Đức Lượng, 2004). Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase và β-glucanase : Urê 0,3g (NH4)2SO4 1,4g MgSO4.7H2O 0,3g CaCl2.6H2O 0,3g Glucose 0,5g β- Glucan 2g hoặc huyền phù chitin 10g Fe2+, Mn2+, Zn2+, Co2+ 0,1% (v/v) Nước cất 1000 ml Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym cellulase: K2HPO4                                       2 g (NH4)2SO4 2 g NaCl                                            2 g MgSO4. 7H2O                             2 g Agar 15g CMC (cacboxyl methyl cellulose) 10 g Nước cất                                    1000 ml pH = 7,0 - 7,2. - Phương pháp tiến hành: đổ môi trường vào đĩa Petri, cấy vi khuẩn mới hoạt hoá trên môi trường, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1- 4 tuần và quan sát vòng phân giải được tạo ra bằng dung dịch thuốc thử Lugol. 2.2.3.4. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Phytophthora sp. tác nhân chính gây bệnh thối quả ca cao Phương pháp tiến hành: Áp dụng phương pháp nhân sinh khối nấm Trichoderma của Papavizas và cộng sự (1984) có cải tiến (mỗi công thức làm nhắc lại 3 lần). Nấm Trichoderma được nuôi cấy trên môi trường PDA 5 - 7 ngày. Môi trường nhân sinh khối được hấp khử trùng trong 45 phút ở 1210C. Cấy nấm Trichoderma vào môi trường nhân sinh khối đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 15 ngày. Nghiên cứu thành phần cơ chất của môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp. Công thức thí nghiệm CT1: 250g gạo CT2: 250g bột ngô CT3: 125g gạo + 125g bột ngô CT4: 250g thóc Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) b) Nghiên cứu lượng nước trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp. Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma trên môi trường gạo Công thức thí nghiệm CT5: 250g gạo + 50ml nước CT6: 250g gạo + 100ml nước CT7: 250g gạo + 150ml nước CT8: 250g gạo + 200ml nước Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma trên môi trường bột ngô Công thức thí nghiệm CT9: 250g ngô + 50ml nước CT10: 250g ngô + 100ml nước CT11: 250g ngô + 150ml nước CT12: 250g ngô + 200ml nước CT13: 250g ngô + 250ml nước Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma trên môi trường thóc Công thức thí nghiệm CT14: 200g thóc + 100ml nước CT15: 200g thóc + 150ml nước CT16: 200g thóc + 200ml nước CT17: 200g thóc + 250ml nước CT18: 200g thóc + 300ml nước Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) c) Nghiên cứu xác định chế độ cấp khí trong lên men nhân sinh khối Ảnh hưởng của chế độ đậy nút kín và cấp khí đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma Công thức thí nghiệm CT19: Đối chứng (Đậy nút kín không đảo) CT20: Đậy nút kín + đảo trộn 1 ngày/1 lần CT21: Đậy nút kín + đảo trộn 2 ngày/1 lần CT22: Đậy nút kín + đảo trộn 3 ngày/1 lần Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Ảnh hưởng của chế độ buộc nút hở và cấp khí đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma Công thức thí nghiệm CT23: Buộc nút hở + Đối chứng không đảo CT24: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 1 lần sau 3 ngày CT25: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 2 lần sau 3 ngày và 10 ngày CT26: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 3 lần sau 3 ngày, 8 ngày và 13 ngày CT27: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 4 lần, 3 ngày/ lần CT28: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí liên tục, 1 ngày/ lần Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma Công thức thí nghiệm. CT29: Sáng liên tục CT30: 12 giờ sáng + 12 giờ tối CT31: Tối liên tục Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy) 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng các phần mềm IRRISTAT. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp. gây thối đen quả ca cao Nấm Phytophthora thường mọc chậm trên môi trường, do vậy dễ bị cạnh tranh bởi các loài nấm khác. Khả năng phân lập trực tiếp từ mô bệnh rất khó thành công. Áp dụng biện pháp dùng mồi bẫy để xác định được mẫu bệnh có xuất hiện nấm Phytophthora và từ mồi bẫy sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để phân lập. Nghiên cứu vật liệu bẫy thích hợp đối với nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao, các loại mồi bẫy là quả ca cao, đu đủ, lê, táo tây còn xanh được sử dụng trong thí nghiệm. Kết quả được ghi nhận trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của vật liệu bẫy đến khả năng bẫy nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao TT Vật liệu bẫy Tỷ lệ mồi bẫy bẫy được nấm Phytophthora (%) Tỷ lệ mồi bẫy phân lập được Phytophthora (%) 1 Quả ca cao xanh 78,0 26,0 2 Quả táo tây 24,0 10,0 3 Quả đu đủ xanh 22,0 8,0 4 Quả lê xanh 14,0 4,0 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Sử dụng mồi bẫy là quả ca cao xanh cho tỷ lệ bẫy nấm Phytophthora sp. cao nhất (78%) và cho tỷ lệ phân lập cao nhất (26%). Các loại quả khác cũng bẫy được nấm Phytophthora sp. nhưng cho tỷ lệ thấp hơn. Nguyên tắc phương pháp bẫy là lợi dụng tính gây bệnh chọn lọc của loài Phytophthora đối với mô ký chủ còn sống, các cây ký chủ này sẽ được coi là môi trường chọn lọc, vết bệnh do nấm Phytophthora gây ra sẽ được phân lập trên môi trường nhân tạo chọn lọc. Đặc điểm vết bệnh trên vật liệu bẫy (các loại quả) do nấm Phytophthora gây nên thường rắn, cứng dễ nhận biết, còn những vết hoại do Pythium và vi khuẩn gây nên thường thối mềm, nhũn. 3.2. Phân lập nấm Trichoderma sp. ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông. Các mẫu đất ở các vườn trồng không có cây bệnh và vùng đất quanh các cây khỏe trong các vườn ca cao tỉnh Bình Phước, Đồng Nai, Đăk Lăk, Đăk Nông được thu thập bởi các cán bộ Viện Bảo vệ Thực vật và được sử dụng để phân lập nấm Trichoderma. Nấm Trichoderma được phân lập trên môi trường PDA, theo dõi sự phát triển của nấm Trichoderma và kiểm tra trên kính hiển vi, kết quả được trình bày ở bảng 3.2, 3.3. Bảng 3.2. Nguồn Trichoderma thu thập được từ 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông TT Địa điểm thu mẫu Số mẫu thu thập Số mẫu có nguồn nấm Trichoderma Nguồn Trichoderma có triển vọng 1 Bình Phước 40 6 1 2 Đăk Lăk 40 4 3 3 Đăk Nông 20 2 1 Tổng số 100 12 5 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Hình 3.1. Đồ thị thể hiện tỷ lệ phân lập được nguồn nấm Trichoderma từ đất tại 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông. Trong tổng số 100 mẫu thu thập tại 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông, có 12 mẫu phân lập được nấm Trichoderma sp., trong đó có 5 mẫu có triển vọng đối kháng với nấm Phytophthora sp. gây thối đen quả ca cao. Kết quả cho thấy nguồn đối kháng Trichoderma sp. trong tự nhiên còn quá thấp, việc nhân nuôi và bổ sung vào trong đất các vi sinh vật đối kháng có ý nghĩa quan trọng trong hạn chế sự phát triển của tác nhân gây bệnh tồn tại trong đất. Việc nghiên cứu các loài có khả năng đối kháng tác nhân gây bệnh trong đất là hết sức cần thiết. Giúp tăng cao lượng thiên địch tự nhiên của các loài nấm gây bệnh và là một trong những biện pháp quan trọng ứng dụng trong cơ chế phát triển sạch. Bảng 3.3. Nguồn Trichoderma có triển vọng đã thu thập được tại 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông Ký hiệu mẫu Ký hiệu nguồn Tên nguồn nấm Xuất xứ nguồn nấm ĐLTr-23 Tr-H Trichoderma sp. Đất trồng ca cao ở Krong ana, Đăk Lăk ĐNTr-8 Tr-tv Trichoderma sp. Đất trồng ca cao ở Đăk mil, Đăk Nông ĐLTr-47 Tr-1 Trichoderma sp. Đất trồng ca cao của Viện Tây Nguyên BPTr- 36 Tr-2 Trichoderma sp. Đất trồng ca cao ở Bù Đăng, Bình Phước ĐLTr-69 Tr-3 Trichoderma sp. Đất trồng ca cao của Krong ana, Đăk lăk (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Trong tổng số 100 mẫu đất quanh vùng rễ của các cây ca cao có 5 nguồn Trichoderma có triển vọng, các nguồn này đều có sợi nấm phát triển rất tốt trên môi trường PDA, màu sắc sợi nấm khác nhau từ xanh đậm, xanh nhạt đến màu xanh lá mạ 3.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao 3.3.1. Khả năng ký sinh của nấm Trichoderma sp. Nghiên cứu khả năng ký sinh của các dòng Trichoderma đã phân lập được để có các dòng có triển vọng trong phòng trừ nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao. Sử dụng 5 nguồn Trichoderma sp. đã được tuyển chọn, cấy đối xứng trên môi trường PDA, theo dõi sự phát triển của sợi nấm sau nuôi cấy 2, 4, 6, 8 ngày, kết quả trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Khả năng ký sinh của các dòng nấm đối kháng Trichoderma sp. đối với nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao TT Nguồn Trichoderma Phytophthora palmivora Đường kính tản nấm sau cấy 6 ngày (cm) Hiệu quả ức chế (%) Đối kháng Đối chứng 1 Tr-H 0,4 8,6 92,9 2 Tr-1 2,0 8,6 69,7 3 Tr-2 1,8 8,6 73,8 4 Tr-tv 0,9 8,6 85,8 5 Tr-3 1,5 8,6 81,3 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Sau khi cấy cả 2 loại nấm Trichoderma và Phytophthora palmivora đều phát triển và lan nhanh trên môi trường, giữa vùng nấm gây bệnh và nấm Trichoderma hình thành một đường gianh giới rõ, gọi là viền đối kháng. Từ ngày thứ 6 – 8 sau khi cấy trở đi, nấm Trichoderma ký sinh sợi nấm Phytophthora palmivora làm cho nấm này teo dần và chết hoàn toàn. Ở thí nghiệm sử dụng Trichoderma làm nấm đối kháng vùng nấm bệnh P. palmivora có đường kính là 0,4 - 2,0 cm sau 6 ngày, ở công thức đối chứng (không có nấm Trichoderma) nấm P. palmivora sinh trưởng và phát triển tốt sau 7 ngày đã đạt đường kính tối đa. Hiệu quả ức chế của các dòng nấm Trichoderma đối với nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên ca cao từ 76,7 – 95,3 %. Hình 3.2. Nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Phytophthora palmivora 3.3.2. Khả năng sinh kháng sinh bay hơi của nấm Trichoderma sp. Theo Seiketov (1982), một số dòng nấm Trichoderma còn có khả năng sinh chất kháng sinh bay hơi có khả năng tiêu diệt nấm bệnh, ngay cả khi không có sự tiếp xúc trực tiếp với nhau. Kết quả nghiên cứu về khả năng sinh kháng sinh bay hơi của 5 dòng nấm có khả năng đối kháng cao để tiêu diệt nấm bệnh Phytophthora palmivora của Trichoderma được thể hiện trong bảng 3.5. Bảng 3.5. Khả năng ức chế nấm Phytophthora palmivora bằng chất kháng sinh bay hơi của các dòng nấm Trichoderma sp. TT Nguồn Trichoderma Phytophthora palmivora Đường kính tản nấm sau cấy(cm) 6 ngày Hiệu quả ức chế (%) Đối kháng Đối chứng 1 Tr-H 0,6 8,5 92,9 2 Tr-1 2,6 8,6 69,7 3 Tr-2 2,2 8,4 73,8 4 Tr-tv 1,2 8,5 85,8 5 Tr-3 1,6 8,6 81,3 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Hình 3.3. Hiệu quả ức chế của giống Trichoderma đã phân lập đối với nấm Phytophthora palmivora Kết quả cho thấy sau 2 ngày cấy truyền cả 2 loại nấm Trichoderma và Phytophthora palmivora đều mọc trên môi trường. Sau 3 ngày nấm Trichoderma đã mọc kín hộp ở cả công thức thử tính đối kháng và đối chứng, ngược lại nấm Phytophthora palmivora sau 3 ngày ở công thức thử tính đối kháng hầu như không mọc tiếp, công thức đối chứng vẫn tiếp tục mọc. Từ ngày thứ 6 – 8 sau khi cấy trở đi, nấm Trichoderma tiết chất kháng sinh làm sợi nấm Phytophthora palmivora teo dần và chết. Ở công thức đối chứng (không có nấm Trichoderma) nấm P. palmivora sinh trưởng và phát triển tốt sau 7 ngày đã đạt đường kính tối đa. Hiệu quả ức chế của các dòng nấm Trichoderma đối với nấm Phytophthora palmivora gây bệnh trên ca cao từ 73,8 – 92,9 %. 3.4. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma sp. 3.4.1. Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma sp. trên môi trường nhân tạo. Các nguồn nấm Trichoderma cấy trên môi trường PDA ở nhiệt độ 25 – 28oC phát triển như sau: sau khi cấy bào tử nẩy mầm tạo thành ống mầm. Ống mầm phát triển thành sợi nấm. Từ điểm tăng trưởng ban đầu (điểm cấy nấm), các sợi nấm này lan ra xung quanh tạo thành hình tia. Sợi nấm trong suốt, rất mịn, sau khi cấy 1 ngày sợi nấm bắt đầu phân nhánh, các sợi nấm không rời khỏi mặt môi trường. Những sợi nấm này gọi là sợi nấm nền. Ngày thứ 2 sau cấy, sợi nấm nền tiếp tục lan rộng, phát triển tạo thành thể sợi nấm nền. Sau đó trên bề mặt môi trường đã hình thành những sợi nấm mọc nổi ở phía trên. Đây là những sợi nấm khí, những sợi nấm khí cụm lại với nhau tạo thành từng đám nhỏ. Trên sợi nấm khí hình thành bào tử. Nếu nhiều sợi nấm khí thì sẽ