Luận văn Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang

g lại thanh hơn [7]. Các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và quá trình lên menmalolactic pH Thành phần rượu vang, phương pháp sản xuất và mối tương tác giữa vi khuẩn malolactic và các vi sinh vật khác có thế ảnh hưởng tới sự sống sót và sinh trưởng củavi khuấn malolactic trong rượu vang và vì vậy ảnh hưởng tới quá trình lên menmalolactic. Tuy nhiên, các điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ, độ cồn, tình trạng dinh dưỡng, và S02 cũng chiếm một vai trò đáng kể (hình 1.4). Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic [7] Giá trị pH nhỏ nhất mà tại đó vi khuẩn sinh trưởng được trong rượu vang xấp xỉ 2,9-3,0. Sự sinh trưởng của vi khuẩn nhanh hơn và quá trình lên men malolactic hoàn thành sớm hơn khi pH tăng trên 3,0. Mặc dù pH 6,3 là tối ưu cho hoạt động của các enzym malolactic, nhưng sự phân giải axit malic lại diễn ra nhanh nhất tại các giá trị pH thấp hơn. Khả năng chịu cồn là một đặc tính quan trọng của nhiều vi khuẩn malolactic. Hầu hết các chủng không có khả năng phát triển trong rượu vang có hàm lượng cồn lớn hơn 15% v/v nhưng một số lại quan sát thấy sự sinh trưởng ở độ cồn 20% v/v. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu đối với phòng thí nghiệm vi khuẩn lactic là từ 25-27°C và tỷ lệ phân giải malatcao nhất tại nhiệt độ gần đó. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và tốc độ lên men malolactic bị ức chế tại nhiệt độ thấp. SO2 có tác dụng ức chế vi khuẩn malolactic, SO2 còn có tác dụng thúc đẩy quá trình lắng trong dịch nho. Theo Navarre (1994), đó là do sự ức chế hệ vi sinh vật có trong nguyên liệu của SO2 nên không xảy ra hiện tượng lên men tự nhiên trong hỗn hợp nho sau quá trình nghiền xé. Nhờ đó mà sự kết lắng của các cấu tử lơ lửng trong dịch nho sẽ diễn ra nhanh và hiệu quả. Sự có mặt của thực khuẩn thể có thể cũng ức chế quá trình lên men malolactic trong rượu vang. Các chủng thực khuẩn thể chống lại các điều kiện bất lợi và gây phán hủy tế bào vi khuẩn malolactic. Chúng cũng có khả năng phá vỡ động học quần thể của quá trình lên men malolactic. Mặc dù sự có mặt của các thực khuẩn thể có ảnh hưởng nghiêm trọng tới chất lượng của rượu vang, chúng có xu hướng bị ức chế trong suốt quá trình sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và ảnh hưởng của chúng là rất nhỏ nhờ các điều kiện đảm bảo thuận lợi cho sự sinh trưởng của các vi khuẩn malolactic [7].. Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic Với mục đích khắc phục một cách hiệu quả các yếu tố bất lợi nói trên người ta đã sử dụng chủng giống vi khuẩn thuần khiết có khả năng lên men malolactic mạnh trong quá trình sản suất rượu vang. Để sử dụng các chế phấm này một cách hiệu quả, các nhà sản xuất khuyến cáo không nên cấy trực tiếp chế phẩm vào vang non mà trước tiên phải nhân giống bằng môi trường có bổ xung dịch nước quả và axít malic cho vi khuẩn từ từ lấy lại hoạt tính lên men malolactic rồi sau đó mới cấy vào rượu vang non, nhờ vậy tỷ lệ sống của vi khuẩn L.oenos lúc này đạt trên 80% so với khi cấy trực tiếp chỉ đạt 20%. Sử dụng cố định tế bào cho quá trình lên men malolactic Lên men malolactic liên tục bằng phương pháp cố định tế bào vi khuẩn L.casei trên gel polyacrylamit lần đầu tiên được thực hiện vào năm 1985 bởi Davis và cộng sự. Bên cạnh đó còn có nhiều nghiên cứu về lên men malolactic bằng cố định tế bào vi khuẩn L.oenos trong gel aginat ở 25°c trong 24 giờ. Kết quả cho thấy, trong phương pháp cố định tế bào hoạt tính lên men malolactic được duy trì lâu hơn so với lên men thông thường, ngay cả trong điều kiện môi trường có độ axít cao và hàm lượng SO2 lớn[12]. Trong một nghiên cứu khác, tế bào vi khuẩn Lactobacillussp. 48 đã được cố định trên gel k-carrageenan khi có hoặc không có mặt Pentagel (bentonit tinh khiết) có tác dựng làm tăng kích thước lỗ của gel do vậy tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chuyển khối của hệ thống cố định tế bào. Trong quá trình này, trực khuẩn Lactobacilli có hoạt tính lên men axít malic, biến đổi pH môi trường, giảm độ chua, tạo axít lactic tương đương với quá trình lên men malolactic truyền thống [43]. Nếu như sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic để thực hiện quá trình lên men malolactic thì thời gian lên men phụ có thể rút ngắn xuống còn vài tháng so với vài năm khi lên men theo truyền thống. Tuy nhiên, thời gian lên men phụ để cho quá trình lên men malolactic diễn ra triệt để chỉ mất có vài ngày, thậm chí là vài giờ khi tiên hành lên men bằng cố định tế bào. Chính vì vậy, lên men malolactic bằng cố định tế bào là một giải pháp có nhiều triển vọng để nâng cao chất lượng của rượu vang. Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic Cho tới nay, sử dụng chế phẩm enzim malolactic có thể được coi là một giải pháp lý tưởng nhất để chuyển hoá axít malic. Đã có rất nhiều chế phẩm enzim loại này được sản suất và thương mại hoá, đặc biệt là 5 loại enzym sau: EC 1.1.1.40-enzym malic phụ thuộc NADP, EC 1.1.1.37 - enzym malic dehydrogenaza phụ thuộc NAD, EC 1.1.1.27- enzyme phụ thuộc NAD, chuyến hoá axít pyruvic thành axít lactic, EC 1.6.1.1- enzyme nicotiamit nucleotit transhydrogenaza, chuyển H từ NADPH sang NDA và enzim malolactic phụ thuộc NAD, chuyển hoá trực tiếp axít malic thành axít lactic. Hervé Vaillant và Pascal Formisyn, 1996, đã sử dụng phương pháp cố định enzim malolactic tinh sạch từ chủng L.oenos 8406 trên màng Polysulfone nhằm chuyển hoá axít malic thành axít lactic. Kết quả cho thấy nhờ có quá trình tinh sạch mà hoạt lực của enzim malolactic đã tăng 7,5 lần, tức là từ 1,7 đơn vị/mg lên 12,8 đơn vị/mg protein và khối lượng của enzim này là 131 kDa. Trong điều kiện vang non có pH là 5.5 thì sau 1 tuần có tới 70% lượng axít malic có trong vang bị chuyển hoá thành axít lactic và tỷ lệ này là 1:1. Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong sản xuất vang Để thực hiện quá trình lên men malolactic người ta còn đề cập tới một phương pháp hoàn toàn mới đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đó chính là sử dụng nấm men chuyển gien. Người ta chuyển gien quyết định khả năng lên men malolactic của vi khuẩn Leuconostoc oenos vào tế bào nấm men Saccharomyces để thực hiện đồng thời quá trình lên men rượu và quá trình lên men malolactic nhằm rút ngắn qui trình sản xuất rượu vang mà vẫn thực hiệu đầy đủ các quá trình lên men. Để có thể nâng cao năng suất và chất lượng rượu vang, thỏa mãn nhu cầu tiêu thụ vang ngày càng nhiêu của thị trường. Có thế nói xu hướng sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp vừa có khả năng lên men rượu vừa có khả năng lên men malolactic đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay. Đã có rất nhiều thành công trong việc đưa vào các chủng nấm men rượu vang S.cerevissiae mang đoạn gen mã hoá cho enzim malolactat decacboxylaza. Bằng cách sử dụng các mồi (primer) được sinh ra từ các vùng bao thủ của các đoạn protein của enzim malic, Cécile Labarre và cộng sự, 1996 đã nhận được một đoạn ADN có kích thước 324-bp của L.oenos Lo 84.13 bằng phương pháp PCR và sử nó làm mồi để phân lập bộ genom của chủng vi khuẩn này. 2990 gen khác nhau đã đựợc xác định và 7 đoạn ADN trùng nhau đã được phân lập. Trong số chúng, một gen có kích thước 3453 bp được xác định có hai đầu đọc mở bao gồm hai đoạn chứa 1623 và 942 nucleotit tương ứng. Protein được dịch mã từ đoạn gen đầu tiên có khối lượng 59118 Da rất giống với khối lượng của enzim malolactic của vi khuẩn Lactobacillus lactỉs. Đoạn gen này sau đó đã được đưa vào vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4. Bằng phương pháp đánh dấu người ta đã nhận thấy sự biểu hiện của gen mã hoá cho enzim malolactic nhờ vào các phân tử protein được tổng hợp có khối lượng gần bằng 60 KDa có hoạt tính enzim malolactic và khẳng định rằng hoạt tính lên men malolactic đã được biểu hiện ở cả vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4 tái tổ hợp. Thành công này cho phép nghĩ tới việc ứng dụng các chủng nấm men tái tổ hợp trong tương lai, khi chúng hội tụ đầy đủ các tính chất cần có của một chủng nấm men công nghiệp và đồng thời có hoạt tính lên men malolactic mạnh [43] . Các phương pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lượng rượu vang Rượu vang mới chỉ xuất hiện ở nước ta cách đây hơn 100 năm nhưng nó đã nhanh chóng trở thành thứ đồ uống không thể thiếu. Tuy nhiên, mức tiêu thụ rượu vang bình quân tính theo đầu người hiện nay ở nước ta còn thấp, chỉ là 3-5 lít/năm. Do gặp nhiều khó khăn về thiết bị và qui trình công nghệ lạc hậu nên chất lượng vang Việt nam chưa cao. Để đáp ứng nhu cầu của thị trường, chúng ta đã thay đối qui trình công nghệ, rút ngắn thời gian lên men và dịch siro quả trước khi lên men bị đem thanh trùng nhằm tiêu diệt vi sinh vật nhiễm tạp và cũng vô tình tiêu diệt luôn quần thể vi khuẩn L.oenos quí giá có trong nguyên liệu còn sót lại sau quá trình xử lý. Chính vì vậy quá trình lên men malolactic không được thực hiện, khiến cho vang có vị chua “cứng”, chất lượng không ổn định, nhanh đục và hay bị nhiễm tạp. Chúng ta không sản xuất được rượu vang có chất lượng giống như rượu ngoại và do vậy chịu nhiều thua thiệt về giá cả, giá thành rượu nội chỉ bằng 5-10% so với rượu ngoại tương ứng và gây tiêu tốn ngoại tệ cho việc nhập khuẩn rượu [7]. Sản xuất vang theo truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự phát trong suốt quá trình bảo quản vang non trong thời gian vài tháng hoặc nhiều năm. Vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc ở thùng gỗ. Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất vang hiện đại với quá trình chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm tối thiểu thì quá trình lên men như vậy quá chậm chạp và không đủ độ tin cậy. Như vậy lên men malolactic tự nhiên có những ưu điểm là thuận lợi và rẻ tiền, nhưng nhược điểm cũng rất nhiều như là: khó khởi động, diễn ra rất chậm chạp và khó kiểm soát được các chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình dẫn đến việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn. Để khắc phục, hiện nay người ta thường áp dụng phương pháp chủ động đưa vi khuẩn L.oenos thuần chủng vào môi trường để thực hiện lên men malolactic. Việc cấy vi khuẩn có thể diễn ra trong quá trình lên men rượu (đồng thời với nấm men) hoặc sau khi hoàn thành quá trình lên men rượu [3,18,38]. Để khắc phục hiện trạng thực tế này người ta đã sử dụng vi khuẩn thuần khiết để thực hiện quá trình lên men malolactic. Ưu điểm của các chủng vi khuẩn này là có khả năng thích nghi cao với môi trường rượu vang non có độ cồn cao (15% v/v), pH thấp (3,0) và có khả năng lên men mạnh các loại đường, đặc biệt là lên men axít malic thành lactic và axít xitric thành axetic. Có nhiều phương pháp sử dụng vi khuẩn O.oeni thuần khiết để thực hiện quá trình lên men malolactic nhưng nhìn chung dựa vào hai phương pháp sau đây: Lên men một giai đoạn (lên men hỗn hợp): Lên men một giai đoạn có nghĩa là người ta cấy nấm men và vi khuẩn đồng thời trong quá trình lên men rượu. Phương pháp này có những ưu điểm: vi khuẩn sẽ có điều kiện sinh trưởng tốt hơn trong môi trường có nồng độ cồn thấp và khi hàm lượng cồn tăng dần trong quá trình lên men rượu thì vi khuẩn sẽ được thích nghi dần với môi trường chứa rượu, chứ không bị sốc như khi đột ngột gặp môi trường có nồng độ cồn cao, hơn nữa khi đó môi trường còn đang rất giàu chất dinh dưỡng nên thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nuôi cấy hỗn hợp còn tạo điều kiện cho sự lên men malolactic xảy ra đồng thời với lên men rượu, nếu lên men malolactic không xảy ra tức thời thì có thể là do tỉ lệ vi khuẩn trong dịch lên men quá ít hoặc do hàm lượng SO2 quá cao đã ức chế vi khuẩn [2]. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có hạn chế: đó là là sự cạnh tranh không lành mạnh chất dinh dưỡng và quan hệ đối kháng giữa vi khuẩn và nấm men. Sự chuyển hóa đường của vi khuẩn lactic để sinh ra axit lactic gây ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men rượu của nấm men và chất lượng rượu vang. Bên cạnh đó, khi vi khuẩn lactic phát triển mạnh sinh ra quá nhiều axít lactic và axetic gây ra sự mất cân bằng vị trong rượu vang làm mất giá trị cảm quan của sản phẩm. Phương pháp này chỉ thực hiện khi các chủng vi sinh vật đã được lựa chọn kĩ, không có tính đối kháng và lượng tế bào cần có của mỗi chủng được xác định. Do vậy, phương pháp lên men hai giai đoạn đã được tiến hành[7]. Lên men hai giai đoạn liên tiếp là quá trình lên men rượu và lên men malolactic riêng biệt. Sau khi lên men rượu bởi nấm men kết thúc, đưa vi khuẩn vào thực hiện giai đoạn lên men phụ (lên men malolactic). Phương pháp này có ưu điểm sau: Cho phép điều chỉnh một cách dễ dàng các yếu tố môi trường thích hợp cho từng loài, điều này giúp thời gian lên men của mỗi giai đoạn có thể rút ngắn không ảnh hưởng đến hiệu suất lên men rượu vì nuôi cấy hai chủng riêng, cuối quá trình lên men, do nồng độ đường còn rất thấp nên lúc này vi khuẩn lactic buộc phải sử dụng các axit hữu cơ làm nguồn cơ chất chính để tồn tại. pH dịch lên men lúc này đã giảm còn khoảng 3.5 – 4, đây là khoảng pH thích hợp cho việc chuyển hóa axit malic nguy cơ đường bị chuyển hóa thành các sản phẩm khác như axit lactic, axit axetic giảm[7]. Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là khi kết thúc lên men rượu nồng độ cồn trong môi trường cao khoảng 12 – 15%v/v, do đó khi cấy vi khuẩn vào môi trường do gặp nồng độ cồn cao đột ngột nên vi khuẩn sẽ bị sốc, số lượng giảm đáng kể nên sẽ làm chậm quá trình lên men malolactic. Do vậy mà phải chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng chịu được độ cồn cao và dùng phương pháp nuôi cấy trước, tức là nuôi vi khuẩn trong các môi trường giàu dinh dưỡng có bổ sung cồn ở khoảng pH 4,5 trong 5 – 7 ngày để vi khuẩn thích ứng dần sau đó mới đưa vào vang non, qua đó có thể khắc phục tình trạng chết của vi khuẩn một cách đáng kể. Trong thực tế, không có một phương pháp nào chung cho việc khởi động quá trình lên men malolactic, vì vậy khi đưa một chủng vi khuẩn nào vào thực hiện quá trình này cần thiết phải xác định thời điểm bổ sung thích hợp chủng giống này. CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất 2.1.1 Nguyên liệu - Syro nho nhập khẩu của Ý có nồng độ chất khô 65°Bx - Chế phẩm Essential oenos (EO) do công ty Gusmer Enterprises cung cấp: là chế phẩm chứa chất dinh dưỡng cần cho sự sống sót của vi khuẩn malolactic, bao gồm các vitamin, các axit amin và muối khoáng. - Enzym Pectinex Ultra SP-L và Pectinex 3XL của hãng NoVo (Đan Mạch), mua tại Công ty EAC (Việt Nam). 2.1.2 Vi sinh vật - Chủng nấm men: Chủng nấm men S.cerevisiae SH09 phân lập tại Ninh Thuận năm 2008. 2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật Môi trường phân lập vi khuẩn lactic (MRS) ( NH4)3C6H7O5: 2g CH3COONa:5g Cao nấm men: 5g Cao thịt:10g CaH2PO4:2g Glucoza:20g Pepton:10g MnSO4.4H2O:0,05g Tween 80:1g Thạch: 30g Nước cất: 1000ml Môi trường nuôi cấy vi khuẩn malolactic Sử dụng môi trường MRS có bổ sung axít malic: môi trường MRS: 1 lít; axít malic: 5g; pH 5 (điều chỉnh bằng KOH 10N) và thạch: 30g. Môi trường lên men malolactic nước nho axít AG (Acide Grape) - Glucoza: 10g - Pepton: 10g - Cao nấm men: 5g - Axít malic: 2g - MgSO4.7H2O: 0,05g - Nước nho: 250 ml, định mức bằng H2O cất đến 1000ml, điều chỉnh pH về 4,8 bằng KOH 10N. 2.1.4 Hóa chất Các hoá chất phân tích sử dụng của Merck (Đức), Sigma (Mỹ), BDH (Anh), A.R. (Trung Quốc) và bộ kít chuẩn enzyme (Cat.No.10139068035) của BOEHRINGER MANNHEIN (Đức). Dụng cụ máy móc, thiết bị Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu, phân tích của Viện Công nghiệp thực phẩm. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Quy trình lên men rượu vang Sy rô nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khô 250 Bx. Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09. Kết thúc quá trình này, tiếp tục lên men dịch trong vòng 10 ngày ở nhiệt độ 25°C, thu được rượu vang non. Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106 tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic. Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106 tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic. Mẫu ĐC: Lên men malolactic tự phát Mẫu F: Lên men Malolactic, cấy vi khuẩn lactic ngay đầu quá trình lên men rượu. Mầu M: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu được 48h. Mẫu E: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu vừa kết thúc. Phương pháp vi sinh vật - Phương pháp phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả, lá nho Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho - Phương pháp xác định khả năng lên men của chủng vi khuẩn malolactic Lấy một đầu que cấy giống vi khuẩn malolactic từ khuân lạc trên đĩa petri hoặc ống thạch nghiêng rồi cấy vào 10-50 ml môi trường lên men malolactic dịch vang non sau khi lên men rượu của bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp và lọc vô trùng bằng màng 0,45 micromet. Lên men ở nhiệt độ 250C. Lấy mẫu hàng ngày để kiểm tra hàm lượng axít malic bị tiêu thụ hoặc hàm lượng axít lactic tạo thành. - Phương pháp xác định hình thái, kích thước tế bào và nảy chồi của các chủng vi khuẩn malolactic trên kính hiển vi. - Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu đánh them phương pháp [1]. - Phương pháp xác định tế bào Gram + theo Collin, 1989 [15]. Phương pháp xác định vi khuẩn kỵ khí bằng khả năng tạo khuẩn lạc trên đĩa thạch MRS trong bình đã loại bỏ oxy [43]. - Phương pháp xác định vi khuẩn hiếu khí bằng khả năng sinh hoạt tính catalaza trên môi trường thạch MRS [43]. - Phương pháp xác định khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn malolactic: Môi trường thạch MRS có bổ sung 20g/l CaCO3 được đổ vào các đĩa pettri. Tiến hành đục lỗ trên các đĩa thạch với số lượng 3 lỗ/đĩa. Sau đó hút 30µl dịch vi khuẩn malolactic cho vào mỗi lỗ. Ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ 37oC trong 3-5 ngày và quan sát vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn. - Phương pháp xác định đặc tính lên men dị hình (khả năng sinh CO2) bằng ống Dulham theo Collin, 1989 [15]. Trong môi trường lên men MRS có chứa glucoza trong ống nghiệm 10ml có chứa ống Dulham ở dưới đáy của ống nghiệm được cấy giống vi khuẩn lactic. Chủng nào sinh khí CO2 sau 24 - 48h sẽ tạo ra áp xuất đẩy ống thử dulham lên phía trên bề mặt môi trường trong ống nghiệm. Qua đó xác định được các chủng lên men di hình. Chủng nào không sinh khí sẽ không đẩy được ống thử Dulham lên phía trên bề mặt môi trường trong ống nghiệm. 2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa Phương pháp đo pH 30 ml mẫu được được lấy ra cho vào cốc mẫu. Giá trị pH được xác định trực tiếp bằng pH metter (Máy đo pH 315i/SET, Đức). Phương pháp đo độ đục Độ đục của mẫu được xác định bằng máy đo độ đục Turbidity (Italy). - Phương pháp đo tỷ trọng: Tỷ trọng của dung dịch được xác định bằng thước đo tỷ trọng ở 200C. - Xác định axít bay hơi. Axít bay hơi được xác định bằng phương pháp của Zoecklein và cs (1989) [48]. 10 ml mẫu được cho vào bình Sellier. Sau khi cất, 100ml dung dịch chưng cất được chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N. Axít bay hơi được tính theo công thức sau đây: Axít bay hơi (g axít axetic/l) = [ml NaOH x N x 0,06)/V] x 100 Trong đó: N: nồng độ của NaOH , V: thể tích mẫu (ml). Phương pháp phân tích axít tổng số. Axít tổng số được xác định theo phương pháp của Zoecklein (1989). 10 mL mẫu được đun sôi trong 30 giây để loại bỏ C02. Sau đó 90 ml nước cất được thêm vào và sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N. Axít tổng số được tính theo công thức sau: Axít tổng số (g axít tactaric/L) =[(mL NaOH X N X 0,075)/V] X 1000 Trong đó: N: nồng độ NaOH, V: thể tích mẫu (mL). Phương pháp phân tích etanol Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller System (Đức), sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter. Xác định hàm lượng đường tổng số bằng phương pháp Graxianop [1]. Phương pháp xác định đường sót: theo Nelson Somogy (1952) [36]. Phương pháp xác định hàm lượng axít L-malic: Hàm lượng axit L-malic được đo bằng phương pháp kít chuẩn enzym (BOEHRINGER MANNHEIN, Cat.No.10139068035). - Phương pháp xác định SO2 tự do và SO2 tổng số [20]. - Phương pháp xác định diaxetyl: theo AOAC (1995) [9]. - Phương pháp phân tích các chất thơm furfural, cis-lacton, trans-lacton và anillin: bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) [21]. - Xác định hàm lượng cồn theo TCVN 378:1986. Etanol được xác định bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller của Merck, sau đó xác định độ cồn bằng alcohol metter. - Xác định hàm lượng axít L-malic, L-lactic và axít axetic bằng phương pháp kit chuẩn enzim (Boehringer Mánnhein, Đức). CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rượu vang Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận Các vi khuẩn có khả năng phân giải axít malic trong rượu vang được gọi là vi khuẩn malolactic. Để phân lập được các chủng malolactic này, trước hết phải tiến hành phân lập sơ bộ có định hướng (vi khuẩn gram dương, catalaza âm tính, khả năng phân giải CaCO3,...) để thu nhận được các chủng vi khuẩn lactic, rồi tiếp theo xác định khả năng lên men malolactic của các chủng nhằm tìm ra chủng có đặc tính công nghệ phù hợp nhất cho lên men malolactic rượu vang đỏ. Phân lập sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic và có định hướng lên men malolactic từ lá và quả nho tại Ninh Thuận, kết quả được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được Tên chủng Mầu sắc và hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào Phân giải CaCO3 Gram (+) NT1 Vàng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ Que ngắn, chuỗi 2, 3 tế bào + + NT2 Trắng, tròn, xù xì, to Cầu nhỏ, chuỗi 2 tế bào + + NT3 Trắng, tròn, gồ ghề, to Cầu, chuỗi 2 , 3 tế bào + + NT4 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu nhỏ, chuỗi 2 tế bào + + NT5 Trắng, tròn, gồ ghề, vừa Cầu to, chuỗi 2 tế bào + + NT6 Trắng, tròn, nhẵn, to Que ngắn, chuỗi 2, 3 tế bào + + Tên chủng Mâu săc và hình dạng khuẩn lạc Hình dạng tế bào Phân giải CaCO3 Gram (+) NT7 Vàng nhạt, tròn, xù xì, vừa Que dài, chuỗi 2 tế bào + + NT8 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 3, 4 tế bào + + NT9 Trắng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2, 4 + + NT10 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2,4 tế bào + + NT11 Trắng sữa, nhẵn, to Cầu, chuỗi 2 tế bào + + NT12 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 2, 3 tế bào + + NT13 Trắng , tròn, nhẵn, nhỏ Que dài, chuỗi 2 tế bào + + NT14 Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ Cầu, chuỗi 3, 4 tế bào + + NT15 Vàng, tròn, nhẵn, to Que ngắn, đơn bào + + NT16 Vàng, tròn, xù xì, dẹt Que dẹt, đơn bào + + NT17 Vàng, xù xì, nhỏ Que dẹt, chuỗi 2 tế bào + + NT18 Trắng, xù xì, to Que ngắn, chuỗi 2 tế bào + + NT19 Trắng, tròn, to Que, chuỗi 2, 4 tế bào + + NT20 Vàng, xù xì, to Que, chuỗi 2 tế bào + + Kết quả bảng 3.1 cho thấy 20 chủng vi khuấn đều gram (+) và có vòng phân giải CaCO3 đã được phân lập. Trong đó, tương ứng với mỗi loại nguyên liệu là lá nho và quả nho. Các chủng này đều có hình thái khuấn lạc tròn, nhưng có bề mặt nhẵn hoặc xù xì, kích thước thay đổi từ nhỏ sang to và chủ yếu có mầu trắng. Hình dạng tế bào của các vi khuẩn này cũng thay đổi từ hình que đến hình cầu, có các tế bào đơn lẻ hoặc chuỗi đôi, chuỗi 3 và 4. Từ các đặc tính hình dạng bên ngoài trên, từ các chủng phân lập được này chúng tôi tiến hành các thí nghiệm xác định khả năng lên men malolactic trong các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2 Xác định khả năng lên men malolactic của các chủng vi khuẩn phân lập Các chủng vi khuấn lactic phân lập được đã được thí nghiệm lên men trong bình dulham nhằm xác định khả năng sinh khí và kiểu hình lên men, hoặc được thí nghiệm dưới các điều kiện có hoặc không có ôxy để xác định đặc tính kỵ khí hoặc hiếu khí. Kết quả của các thí nghiệm này được trình bày ở bảng 3.2 Từ bảng 3.2 cho thấy: Trong số 20 chủng vi khuấn lactic đã được phân lập: Có 15 chủng sinh khí và 5 chủng không sinh khí. Có 15 chủng lên men dị hình và 5 chủng lên men đồng hình. Có 6 chủng lên men hiếu khí, 6 chủng lên men kỵ khí tùy tiện và 8 chủng lên men kỵ khí. Có 12 chủng không có khả năng lên men malolactic và 8 chủng có khả năng lên men malolactic. Cả 20 chủng đều là các chủng có hoạt tính catalaza âm tính. Từ những nhận xét trên chúng tôi chọn 8 chủng là NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14, NT19 có khả năng lên men malolactic. Chúng đều là các chủng có hoạt tính catalaza âm tính, lên men dị hình, kỵ khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện cho nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của các chủng vi khuân lactic phân lập được Tên chủng Sinh khí Kiểu hình lên men Kiểu hô hấp Phân giải axít malic Hoạt tính catalaza NT1 + Dị hình Hiếu khí - - NT2 - Đồng hình Kỵ khí tùy tiện - - NT3 + Dị hình Kỵ khí + - NT4 + Dị hình Hiếu khí - - NT5 + Dị hình Hiếu khí - - NT6 + Dị hình Kỵ khí + - NT7 - Đồng hình Kỵ khí - - NT8 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT9 + Dị hình Kỵ khí + - NT10 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT11 - Đồng hình Kỵ khí - - NT12 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT13 - Đồng hình Kỵ khí - - NT14 + Dị hình Kỵ khí tuỳ tiện + - NT15 + Dị hình Hiếu khí - - NT16 - Đồng hình Kỵ khí - - NT17 + Dị hình Hiếu khí - - NT18 + Dị hình Hiếu khí - -