Luận văn Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ các chủng nấm sợi ở rừng ngập mặn Cần Giờ

nh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo, độ nhuyễn của bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn cho sản phẩm. Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn . Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt, làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của ĐV. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ VK (B. mesentericus, B. subtilis), NS (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng . Trong công nghiệp dệt: protease VSV được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được được bóng, dễ nhuộm. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. - Protease của NS và VK phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. - Điều chế MT dinh dưỡng của VSV để sản xuất vacxin, KS,… - Sản xuất chất giặt tổng hợp, sản xuất mỹ phẩm,… 1.3.2.5. Một số chế phẩm của protease [19,21, 23].  Pepsin Pepsin được thu nhận từ màng nhầy dạ con của heo và bê. Pepsin thường được sử dụng chung với rennet trong sản xuất phomai và làm thuốc tiêu hóa. Hỗn hợp này hoạt động mạnh ở pH 2-4 và nhiệt độ 50oC.  Rennet Thường được sản xuất từ bao tử của cừu, bê, người ta thường phối hợp với pepsin để sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa.  Papain Papain được thu nhận bằng cách sấy khô mủ cây đu đủ carica papaya. Trong mủ cây đu đủ có chứa papain, chymopapain, và một lượng nhỏ protease khác. Papain được ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh và công nghiệp chế biến thịt. Ngoài ra, papain còn ứng dụng trong y học để làm lành các vết thương ngoài da.  Ficin Ficin có nhiều trong nhựa cây sung, được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến sữa.  Protease của VK Có hai loại protease từ VK được bán trên thị trường thế giới. Hai loại này khác nhau về pH hoạt động, mức độ hoạt động và cấu trúc của trung tâm hoạt động. +Protease kiềm Chế phẩm này có tên thương mại là subtilisin, có khoảng pH hoạt động 7-11, trung tâm hoạt động có chứa serin. Chế phẩm này còn được gọi là enzyme tẩy rửa vì được ứng dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa. +Protease trung tính Protease trung tính là metalloenzyme, hoạt động ở pH 6-9. Chế phẩm này được ứng dụng trong công nghiệp da, bia và công nghiệp sản xuất protein thủy phân.  Protease từ NS. Nhiều chủng NS có khả năng sinh protease mạnh. Một số protease từ NS đã được sản xuất trên qui mô công nghiệp. Bảng 1.1. Một số loại NS có khả năng tổng hợp protease mạnh [21] Chủng nấm sợi Loại protease A. oryzae A. awamori A. niger A. fumigatus P. chrysogenum P. cyaneo fulvum R. nodous Protease trung tính, acid và kiềm Protease acid Protease acid và kiềm Nhiều loại nấm sợi có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại NS này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Các loại NS đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3. Một số NS khác như A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát. Protease từ NS gồm cả protease acid, kiềm và trung tính. Các protease acid và trung tính được ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease kiềm được ứng dụng trong công nghệ thuộc da. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu. - Các chủng NS được phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lý Nhơn, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Bình Khánh ở RNM Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. - Các chủng VSV kiểm định: E. coli, B. subtilis được cung cấp từ viện Pasteur. - Nguyên liệu làm MT thu protease: cám gạo, trấu, bột đậu nành mua từ chợ. 2.2. Hoá chất. - Các hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc: K2HPO4, KH2PO4, KCl, NaCl, NaOH, NaNO3… - Các hóa chất có nguồn gốc từ Việt Nam: dầu DO, glucose, pepton, casein, agar, tinh bột, cồn, nước cất… - Các hóa chất có nguồn gốc từ Đức: Yeast extract, malt extract… - Các hoá chất có nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối seignet… 2.3. Thiết bị, dụng cụ. Thiết bị máy móc. Nồi hấp vô trùng Huxlex (Đài Loan). Tủ cấy vô trùng ( Việt Nam). Tủ sấy Memmert (Đức). Tủ ấm Binder (Đức) Kính hiển vi Olympus CHL (Nhật Bản). Tủ lạnh Hytachi (Nhật Bản). Máy đo pH Hana (Nhật Bản). Máy ly tâm Heraeus (Nhật Bản). Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ). Máy đo quang phổ UV (Đức). Máy chụp hình kĩ thuật số Olympus 5.1 (Nhật Bản). Dụng cụ thí nghiệm: que cấy móc, qua cấy vòng, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đèn cồn, que trang, đĩa petri, thước đo, giấy lọc, bông mỡ, bông thấm nước, giấy lọc, khăn lọc, lame, lammel,….. 2.4. Các MT sử dụng trong thí nghiệm. - MT phân lập, nuôi cấy, giữ giống và định danh NS MT1-MT Czapek_Dox cải tiến [19] NaNO3: 3,5g. K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. Glucoza: 20g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT2- MT Zea [19] Cao nấm men: 4g. Glucoza: 20g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 5,5-6. Khử trùng 1atm trong 30 phút. MT3-MT Malt Extra Agar (MEA) [4] Cao malt: 20g. Pepton: 1g. Glucoza: 20g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 5,5-6,0. Khử trùng 1atm trong 30 phút. - MT nuôi cấy VK kiểm định. MT4- MT Meat Pepton Agar (MEA) [20] Pepton: 5g. NaCl: 5g. Cao thịt: 5g. Agar: 20g. Nước cất: 1000ml. pH: 7,5. Khử trùng 1atm, 30 phút. - MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào. MT5- MT thử hoạt tính amylase [5] NaNO3: 3,5g. K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. Tinh bột tan: 15g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT6- MT thử hoạt tính protease [5] K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. Casein: 15g Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT7- MT thử hoạt tính cellulase [5] NaNO3: 3,5g. K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. CMC: 10g. Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT8- MT thử hoạt tính kitinase [5] NaNO3: 3,5g. K2HPO4: 1,5g. MgSO4.7H2O: 0.5g. KCl: 0.5g. FeSO4.7H2O: 0.01g. Bột kitin: 10g Agar: 20g. Nước biển: 1000ml. pH: 6.5. Khử trùng 1atm/30phút MT9- MT bán rắn khảo sát hoạt độ protease [20]. Cám gạo: 7g.(70%) Trấu: 2.5g.(25%) Bột đậu nành: 0.5g. (5%) Độ ẩm :60%. pH 5-5,5. Khử trùng 1atm/30 phút. 2.5. Phương pháp nghiên cứu. 2.5.1. Phương pháp phân lập mẫu từ RNM (theo Fazzani 1975, Kuthubuthen, 1981, 1984) [32]. Thu mẫu tại 5 xã: An Thới Đông, Lý Nhơn, Bình Khánh, Long Hòa, Tam Thôn Hiệp. Mỗi xã thu mẫu ở 5 địa điểm khác nhau, các địa điểm cách nhau khoảng 200m. Tại mỗi địa điểm thu mẫu ở đất mặt, đất sâu, lá vàng, lá mục, cành khô, cành mục. Cách thu mẫu: dùng kéo, dao cắt khoảng 20g cành, lá cho vào túi nilon, cho vào thùng đá, chuyển về PTN, giữ lạnh ở 4o C. Các mẫu phân lập ngay, không giữ quá 24h. Các mẫu thu từ đất thì dùng muỗng xúc khoảng 20g đất và tiến hành tương tự trên. 2.5.2. Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu (theo Uyenco, 1988) [28]. Lấy 10g mẫu, cho vào túi lọc có 90 ml nước biển Cần Giờ vô trùng. Dập mẫu bằng máy dập trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/phút. Thu dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Nhỏ hai giọt dung dịch của mỗi nồng độ lên đĩa petri có MT 1, 2, 3. Dùng que trang dàn đều dung dịch khắp bề mặt đĩa. Lật ngược đĩa petri, gói giấy báo, để ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Chọn KL riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng. Làm thuần [6] Lấy một KL riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa với nước biển vô trùng, cấy trang lên đĩa petri. Ủ mẫu ở 30oC cho đến khi xuất hiện KL. Nếu thấy các dạng KL đồng đều về hình dạng, màu sắc thì giống phân lập đã thuần khiết. Chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống thạch nghiêng. Nuôi cấy ở 30oC trong 7 ngày, sau đó bảo quản ở 4oC. Sau thời gian 2 tháng cấy truyền lại một lần. 2.5.3. Phương pháp bảo quản NS trên MT thạch có dầu khoáng. Chuẩn bị các ống thạch nghiêng nuôi NS đạt độ trưởng thành. Dầu khoáng chứa trong eppendoff đã hấp vô trùng ở 121oC trong 2 giờ rồi sấy khô ở 170oC trong 1-2 giờ, để nguội. Dùng que cấy lấy một ít bào tử NS cho vào eppendoff chứa dầu khoáng vô trùng. Hàn kín eppendoff bằng keo paraphin, bảo quản ở 4oC. Phương pháp này có thể bảo quản từ 1-3 năm. 2.5.4. Phương pháp quan sát đại thể NS [6] Cho vào ống nghiệm 5ml nước biển vô trùng. Dùng que cấy cho một ít bào tử từ ống giống vào ống nước biển, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi cấy chấm điểm vào giữa hộp petri. Ủ trong tủ ấm 1 tuần, mỗi ngày lấy ra quan sát các đặc điểm hình thái, sinh lý (kích thước KL, màu sắc KL mặt phải, mặt trái, hình dạng KL, đặc điểm mép khuẩn lạc, màu sắc MT, ….) 2.5.5. Phương pháp quan sát vi thể NS [4] Đổ một lớp mỏng MT nuôi cấy vào đĩa petri. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch. Chuẩn bị đĩa petri sạch, đặt vào giữa đĩa một ít bông có thấm nước để làm ẩm, đặt trên lớp bông một phiến kính, đem hấp vô trùng 121oC, 30 phút. Đặt một hoặc hai khối thạch lên phiến kính, cấy bào tử xung quanh mép khối thạch, đặt các lá kính vô trùng lên bề mặt khối thạch. Để các hộp petri này ở nhiệt độ phòng 3-4 ngày. Gỡ lá kính ra, úp một phiến kính sạch có nhỏ một giọt lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất. Gỡ bỏ lớp thạch để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ vào một giọt lactophenol, đậy lá kính lên, ta được tiêu bản thứ hai. Quan sát dưới kính hiển vi và mô tả các đặc điểm: Hình dạng cuống sinh bào tử, hình dạng thể bình, sợi nấm có phân nhánh và có vách ngăn hay không, đặc điểm bào tử đính, màu sắc, kích thước bào tử…. 2.5.6. Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme ngoại bào bằng đo đường kính vòng thủy phân Nguyên tắc. Cho enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh KL. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt động của enzyme. 2.5.6.1. Phương pháp cấy chấm điểm. Chuẩn bị các chủng NS cần nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào. Cấy chấm điểm các chủng NS lên bề mặt MT. Ủ ấm trong 30oC, để 3-4 ngày. Đo đường kính vòng phân giải. Phương pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa nghiên cứu sâu. 2.5.6.2. Phương pháp khoan lỗ thạch. Thu dịch nuôi cấy: Nuôi cấy NS trên MT xốp, ủ ba ngày ở 30oC, hòa 10g MT vào nước cất, đem lắc trong 1h tốc độ 200 vòng/phút. Đem lọc qua vải để thu dịch lọc. Ly tâm dịch lọc 15 phút, tốc độ 5000 vòng/phút. Thu được dịch enzyme thô. Chuẩn bị các đĩa petri có MT thử hoạt tính các enzyme ngoại bào cần nghiên cứu. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính các enzyme ngoại bào. Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml vào các lỗ khoan. Giữ các hộp petri trong tủ lạnh 4oC trong 8h, sau đó chuyển ra nhiệt độ phòng 24h. Dùng thuốc thử nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải. Kiểm tra kết quả. Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase, pectinase, dùng thuốc thử là lugol. NS có hoạt tính của các enzyme này sẽ tạo nên vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan. Kiểm tra hoạt tính của protease: thuốc thử là dung dịch HgCl2. Nếu NS có sinh protease sẽ tạo ra một vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan do protease đã phân huỷ chất cảm ứng casein, phần còn lại có màu trắng đục do phản ứng của casein với HgCl2. Cách pha dung dịch HgCl2: hòa 30g HgCl2 vào 100ml nước có pha với 15ml HCl. Cách đánh giá khả năng tạo enzyme: Dùng thước đo đường kính vòng phân giải tại mặt sau đĩa petri. D-d ≥ 25mm: hoạt tính enzyme rất mạnh. D-d ≥ 20mm: hoạt tính enzyme mạnh. D-d ≥ 10mm: hoạt tính enzyme trung bình. D-d ≤ 10mm: hoạt tính enzyme yếu. Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính KL hoặc là đường kính của khoan khối thạch (8mm) nếu làm bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch. 2.5.7. Phương pháp xác định hoạt độ protease (phương pháp Anson cải tiến). Nguyên tắc. Cho protease tác dụng với cơ chất casein, sản phẩm tạo thành là các peptit ngắn hay các acid amin. Trong các loại acid amin, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định hoạt tính protease theo định nghĩa: hoạt tính protease được biểu thị là số micromol tyrosin sinh ra do thuỷ phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5oC, pH 7,6). Hoá chất. Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,96g Na2HPO4 trong nước thành 250ml. Dung dịch KH2PO41/15M: hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml. Dung dịch đệm sorensen 1/15 M, pH 7,6: trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4, đo và chỉnh lại pH cho đúng. Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng sorense cho đủ 100ml. Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml. Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 100ml. Dung dịch tyrosin 20mM/l: khuấy nghiền 0,118g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N cho vừa đủ 50ml. Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l: pha loãng 5ml tyrosin 20mM/l trong HCl 0,2N thành 100ml. Tiến hành thí nghiệm. Dựng đường chuẩn tyrosin. Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dung dịch tyrosin chuẩn 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dung dịch HCl 0,2N 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Dung dịch NaOH 0,5N 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử folin 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lượng tyrosin (micromol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆OD) theo lượng tyrosin ở các ống. Xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên cứu. Cách tính: Hoạt tính protease: HT (UI) = X.V.K t.v (UI/ml) X: số micromol tyrosin suy ra từ đường chuẩn. V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11ml). V: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml). K: độ pha loãng mẫu. t: thời gian phản ứng. 1UI (Anson) = 1 micromol tyrosin/ml/phút hoặc 1 micromol/mg/phút. Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Casein 1% (ml) 5 5 TCA 10% (ml) 0 5 Dịch enzyme mẫu (ml ) 1 0 Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 30 phút TCA 10% (ml) 5 0 Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1 Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm 2.5.8. Phương pháp kiểm tra hoạt tính KS. Nguyên tắc. Chất KS do nấm tiết ra ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV không phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch KS hay khối thạch tạo thành vòng vô khuẩn trong suốt. Cách tiến hành. Cấy NS trên môi trường MEA, nuôi 3 ngày. Dùng khoan nút chai đường kính 8mm khoan các khối KL nấm. Môi trường MPA sau khi hấp khử trùng, để nguội khoảng 45-50 độ, dùng que cấy vòng lấy một vòng VK kiểm định (B. subtilis hoặc E. coli) hòa vào MT, đổ MT vào đĩa petri. Khi môi trường MPA trong đĩa petri đã đông cứng lại, dùng kim mũi mác đặt khối thạch có KL nấm vào. Để vào tủ lạnh 4oC trong 8h để dịch KS khuyết tán vào trong thạch, sau đó chuyển sang nhiệt độ phòng để trong 24h. Kiểm tra kết quả. Khả năng sinh KS được đánh giá bằng hiệu số D-d (D: đường kính vòng vô khuẩn, d=8mm: đường kính của lỗ khoan nút chai. D-d ≥ 25mm: hoạt tính KS rất mạnh. D-d ≤ 20mm: mạnh. D-d ≥ 10: trung bình. D-d < 15mm: yếu. 2.5.9. Phương pháp xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố MT lên khả năng ST của NS. Đánh giá khả năng ST của NS bằng cách đo đường kính KL Qui ước: d = 0mm: không mọc. d = 1-2mm: mọc yếu. d = 2,1-5: mọc trung bình. d = 5,5-10: mọc tốt. d = 11-30mm: mọc rất tốt. 2.5.9.1. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian lên ST của NS. Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu vào MT1, mỗi ngày đo đường kính KL, đo trong 7 ngày. 2.5.9.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của độ mặn lên ST của NS. Chuẩn bị MT1 có pha NaCl để tạo các nồng độ muối: 1%, 3%, 5%, 10%, 20%. Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu lên MT. Nuôi nấm trong 3 ngày ở 30oC. Đo đường kính KL. 2.5.9.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên ST của NS. Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 nuôi ở các nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC trong 3 ngày. Đo đường kính KL. 2.5.9.4. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH lên ST của NS. Chuẩn bị MT1 được điều chỉnh pH bằng NaOH 10% và HCl 10% để tạo các giá trị pH = 3,4,5,6,7,8. Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu. Nuôi trong 3 ngày ở 30oC. Đo đường kính KL. 2.5.9.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nguồn N lên ST của NS. Sử dụng MT1. Nguồn NaNO3 lần lượt được thay thế bằng cao thịt, cao nấm men, casein, bột ĐN, (NH4)2SO4. Mẫu đối chứng là MT1. Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu. Nuôi trong 3 ngày ở 30oC. Đo đường kính KL. 2.5.10. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận protease. [6] Chuẩn bị MT lên men: cho vào bình tam giác 250ml 15g MT bán rắn, hấp khử trùng 121oC trong 30 phút. Chuẩn bị giống bào tử: Chuẩn bị ống nghiệm chứa 15ml nước cất vô trùng. Hoà lượng nước cất vô trùng này vào ống giống. Dùng que cấy mốc cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy bào tử, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù. Tiến hành đếm bào tử bằng phòng đếm hồng cầu. Nuôi cấy: Cho vào các erlen chứa MT một thể tích huyền phù sao cho mật độ bào tử là 105- 106 bào tử/gam MT (2ml). Nuôi cấy ở 30oC. Canh trường nuôi cấy được thu nhận sau 1 khoảng thời gian xác định. Thu dịch enzyme thô: Sau thời gian nuôi cấy NS, cho vào mỗi bình tam giác 100ml nước cất. Lắc 1h, sau đó lọc qua vải lọc thu lấy dịch lọc. Đem dịch lọc ly tâm 5000 vòng trong 10 phút. Thu lấy dịch ly tâm rồi định mức 100ml, ta được dung dịch enzyme thô. 2.5.11. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các yếu tố MT đến hoạt độ protease của NS. 2.5.11.1. Ảnh hưởng của độ mặn. Chuẩn bị MT9. Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử, dùng NaCl để thay đổi độ mặn: 0%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%. Nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC trong ba ngày. Thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ protease để xác định độ mặn tối ưu. 2.5.11.2. Ảnh hưởng của nguồn N. - Chuẩn bị MT9, thay 5% bột ĐN bằng các nguồn N khác nhau: cao thịt, cao nấm men, casein, (NH4)2SO4. Nuôi cấy ở độ mặn tối ưu, nhiệt độ phòng, thời gian 3 ngày. Thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ protease để xác định nguồn N thích hợp nhất. -Sau khi chọn được nguồn N thích hợp, tiến hành chọn tỉ lệ N tối ưu cho hoạt độ protease của các chủng NS nghiên cứu. Các tỉ lệ khảo sát: 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. 2.5.11.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy. Chuẩn bị MT nuôi cấy thích hợp, độ mặn tối ưu. Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử. Nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC. Sau ba ngày thu enzyme thô và xác định hoạt độ protease. Từ đó xác định giá trị nhiệt độ tối ưu để thu protease. 2.5.11.4. Ảnh hưởng của độ ẩm. Chuẩn bị MT thích hợp, độ mặn và nhiệt độ nuôi cấy tối ưu. Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử. Độ ẩm thay đổi 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. Sau ba ngày, thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ protease từ đó xác định độ ẩm tối ưu. 2.5.11.5. Ảnh hưởng của pH. [1] Chuẩn bị MT thích hợp, độ mặn, nhiệt độ và độ ẩm nuôi cấy tối ưu. Dùng NaOH và HCl để thay đổi pH của MT ở các giá trị khác nhau: 3,4,5,6,7,8. Sau ba ngày, thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ protease từ đó xác định pH tối ưu. 2.5.11.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy. Nguyên tắc: Mỗi loài VSV có đường cong tăng trưởng khác nhau. Tại mỗi thời điểm khác nhau của quá trình tăng trưởng, chúng sử dụng các nguồn cơ chất khác nhau của MT nuôi cấy bằng cách tiết ra hệ enzyme thuỷ phân đặc hiệu với các hoạt độ khác nhau. Cách tiến hành. Chuẩn bị MT xốp nuôi cấy. Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử. Nuôi cấy ở độ mặn, độ ẩm, pH tối ưu. Thu dịch enzyme thô sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau: 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h. Tiến hành khảo sát hoạt độ protease tại mỗi thời điểm. Từ đó xác định thời gian nuôi cấy để hoạt độ protease cao nhất. 2.5.12. Thu nhận enzyme bán tinh khiết [21]. Chế phẩm enzyme thô từ canh trường nuôi cấy được giã bằng cối sứ với sự trợ giúp của cát, thạch anh hoặc bột thuỷ tinh. Sau đó, cho vào 1 lượng nước gấp 4-5 lần khối lượng canh trường để hòa tan enzyme từ canh trường. Tiến hành lọc và thu dịch lọc ở 4oC. Phương pháp kết tủa bằng muối (amonium sulfat) Nguyên tắc: nồng độ muối cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme. Phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ (cồn, axeton) Nguyên tắc: dung môi hữu cơ có ảnh hưởng lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvate hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử sẽ tăng lên. Cách tiến hành: Lấy cồn (hoặc aceton hoặc các muối trung tính…) đã làm lạnh đổ từ từ vào dịch lọc enzyme, khuấy nhẹ để cồn hòa đều với dịch enzyme. Để hỗn hợp này vào tủ lạnh. Sau 15-24 giờ hỗn hợp này sẽ phân thành 2 lớp. Đem ly tâm hoặc lọc để thu enzyme dạng tủa. Sấy tủa này ở nhiệt độ < 40oC ta được chế phẩm enzyme bán tinh khiết. 2.5.13. Định danh hai chủng NS bằng phương pháp di truyền phân tử Bước 1. Chạy PCR. Nguyên tắc. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa vào những đặc tính đó của các DNA polymerase. Qui trình. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94-95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút. - Giai đoạn lai: Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi (40-70oC), cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. - Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuyếch đại . Một chu kì gồm 3 bước trên được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng mẫu gấp đôi của lần trước. Đây là sự khuyếch đại theo cấp số nhân. Cách tiến hành. Lấy mẫu nấm nuôi cấy một lượng khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendorf. Cho thêm 180µl TE1X vào 20 µl Prokprep rồi đem ủ ở 560C qua đêm. Thêm 500 µl phenol Buffer và 500µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi ở 100oC trong 15 phút. Sấy nhẹ rồi thêm vào 250 µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex, lắc đều. Ly tâm 14000 vòng/ phút trong 10 phút. Hút 450 µl dịch nổi sang một tube eppendorf mới. Sau đó thêm vào 500 µl Isopropanol. Giữ tube ở nhiệt độ -20oC trong 1 đến 2 giờ. Ly tâm 14000 vòng /phút trong 15 phút ở 4 oC. Đổ bỏ dịch nổi. Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500 µl Ethanol 70% vào, úp ngửa tube 3-4 lần. Ly tâm 14000 vòng/ phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi. Làm khô cặn DNA ở 56oC trong 10-15 phút. Hòa tan cặn DNA trong 50 µl TE1X. Lấy 5µl dịch ly trích này để thực hiện kĩ thuật PCR. Lấy 5µl DNA của vi nấm sau ly trích cho vào PCR mix. Bước 2. Điện di kiểm tra trên gel agarose. Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer. Bước 3. Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEXII của Qiagen. Bước 4. Giải trình tự đoạn RNA 28s. Sản phẩm PCR được giải trình tự trên hệ thống ABI 3130 hoặc CEQ 8000. Sau khi giải trình tự gen của NS nghiên cứu, tiến hành so sánh với trình tự gen trong hệ thống ngân hang gen của Mỹ để xác định chi và loài của chúng. 2.5.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm. Dùng xác suất thống kê