Luận văn Nghiên cứu vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis Thaliana (Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

u, tùy thuộc vào các quá trình cân bằng giữa sự sản sinh và loại bỏ ROS tại các trung tâm hoạt động theo thời gian. Khi điều kiện môi trường thay đổi, những tín hiệu đáp ứng sớm được tạo ra bao gồm: tăng tỷ lệ ion đi qua màng tế bào, tăng cường Ca2+ có mặt trong bào tương, kích hoạt protein MAPKs và đặc biệt là sản sinh ra ROS chỉ sau một vài phút bị kích thích bởi các tác nhân sinh học và phi sinh học. ROS được sinh ra ở các bào quan khác nhau và dẫn 3 đến sự thay đổi của hệ phiên mã trong nhân tế bào, do vậy thông tin phải được chuyển từ các bào quan đến nhân tế bào. Các tín hiệu thông qua ROS cần phải được tiếp nhận và khuếch đại, thường là thông qua kinase hay phosphatase. Hydrogen peroxide có khả năng oxy hóa trực tiếp hai axit amin có chứa lưu huỳnh là Cys và Met. Đặc biệt, việc oxy hóa cysteine đã được tập trung ở nhiều nghiên cứu khác nhau, tình trạng oxy hóa khác nhau cũng dẫn đến những thay đổi khác nhau đối với protein. Ngược lại, sự oxy hóa Met nhận được ít sự quan tâm hơn. Trong thực vật, chức năng của protein bị thay đổi do quá trình oxy hóa Met đã từng được công bố. 1.2.2. Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng Khi ROS tồn tại ở hàm lượng cao, Met tự do cũng như Met trên các phân tử protein dễ dàng bị oxy hóa để tạo thành Met sulfoxide (MetO) và Met sulfone (MetO2) khi gắn thêm các nguyên tử oxy. MetO tồn tại với hai dạng đồng phân quang học là methionine-S-sulfoxide (Met-S-O) và methionine-R-sulfoxide (Met-R-O). Ngược lại với MetO2 (một hợp chất hiếm khi được tìm thấy trong các hệ thống sinh học), cần một lực oxy hóa mạnh và không có tính thuận nghịch thì quá trình chuyển hóa giữa Met và MetO lại có tính thuận nghịch . Protein là mục tiêu mạnh nhất của quá trình oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do so với các đại phân tử khác như lipid và DNA, chiếm đến 68% phân tử bị oxy hóa trong tế bào. Trong tự nhiên, Met đóng vai trò như chất chống oxy hóa, bảo vệ protein cũng như các đại phân tử khác. Dưới điều kiện hiếu khí, có tới 6% Met trong protein có thể cùng bị oxy hóa đồng thời. Tuy nhiên, không phải tất cả các gốc Met trong protein có cùng mức nhạy cảm đối với quá trình oxy hóa; mức này phụ thuộc vào việc các tác nhân oxy hóa có thể tiếp cận Met ở các vị trí khác nhau bên trong cấu trúc protein như nằm ở bề mặt hay trong phần lõi protein. Shechter đã phát hiện chỉ các gốc Met trong chuỗi peptide và protein đã bị biến tính đều bị oxy hóa hoàn toàn, trong khi đối với các protein tự nhiên thì chỉ các gốc Met nằm ở bề mặt mới có thể bị oxy hóa. 4 1.2.3. Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine Oxy hóa Met xảy ra trong điều kiện hiếu khí là điều không thể tránh khỏi, chính vì vậy các tế bào trong sinh vật sống đã phát triển nhiều cơ chế phức tạp cũng như các enzyme để chống lại quá trình oxy hóa Met. Ngược lại với MetO2, MetO có thể được chuyển hóa một cách thuận nghịch thành Met nhờ xúc tác của enzyme Msr. MsrA có thể tham gia khử dạng Met-S-O tự do và Met-S-O trên protein trong khi MsrB khử Met-R-O tự do thành Met kém hiệu quả hơn so với dạng liên kết trong protein do ái lực thấp hơn với cơ chất này ở dạng tự do. Cả MsrA và MsrB đều là những enzyme có tính bảo thủ cao trong vi khuẩn nhân thực, tế bào nhân thực bao gồm cả tế bào người và hầu hết các sinh vật có chứa cả 2 dạng enzyme MsrA và MsrB. MsrA là một dạng enzyme phổ biến, được tìm thấy trong hầu hết các sinh vật từ vi khuẩn đến cây trồng đến động vật có vú, trong đó có cả người. Gần đây, một họ enzyme Msr mới được tìm thấy ở E.coli, chỉ có tính đặc hiệu trong hoạt tính khử Met-R-O dạng tự do và không có khả năng khử MetO liên kết trong protein được gọi là fRMsr (free Met-R-O). Đặc biệt, fRMsr chỉ được tìm thấy trong một vài sinh vật đơn bào. Tuy nhiên trong điều kiện môi trường sống có nhiều bất lợi như hiện nay, đảm bảo cân bằng giữa việc sản sinh và loại bỏ ROS bị phá vỡ bởi nhiều tác nhân bất lợi như ánh sáng cao, hạn hán, nhiệt độ thấp hoặc cao và những tổn thương cơ học. Chính điều đó đã gây ra ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng dẫn đến những thiệt hại lớn về sản lượng. 1..3. Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy phản ứng 1.3.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới Các ảnh hưởng của MetO đến các protein trong chuỗi dẫn truyền tín hiệu cũng được ghi nhận. Nhóm nghiên cứu Takahashi và cs đã nghiên cứu trên protein Calmodulin tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu trong tế bào và chức năng ổn định ROS trên đối tượng thực vật. Mối liên quan giữa quá trình oxy hóa Met với sự 5 mất ổn định cấu trúc của protein calmodulin và sự mất chức năng của protein này cũng được ghi nhận. Rosen và cs sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích khả năng phân giải protein của các tế bào E.coli khi bị xử lý bởi H2O2, HOCl hoặc với bạch cầu trung tính (neutrophil). Các phân đoạn peptide được phân tích bằng sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò ion hóa kết hợp phương pháp khối phổ. Peptide được phát hiện tăng 16 Da. Tuy nhiên, đáng tiếc rằng nghiên cứu này lại không chỉ ra được danh sách hoàn chỉnh các protein và vị trí các gốc Met bị mẫn cảm với quá trình oxy hóa. Le và cs (2009) cũng đã chỉ ra rằng việc biểu hiện quá mức gen mã hóa Msr có thể đem lại tính kháng tác nhân oxy hóa cho tế bào nấm men hoặc tế bào động vật. Bên cạnh đó, Liang và cs đã tách dòng, biểu hiện, tinh sạch và phân tích khối phổ cho bốn MRP mới (chứa > 20% Met, chứa ít hay thiếu cystein) để nghiên cứu quá trình oxy hóa Met và quá trình sửa chữa được diễn ra nhờ Msr. Thông qua đó, natri hypochlorite (NaOCl) được chỉ ra là có hiệu quả cao trong việc tạo MetO trên MRP. Năm 2015, Jacques và cs đã sử dụng một phương pháp mới được gọi là COFRADIC để khảo sát phân bố của các vị trí MetO trên hệ protein của cây mô hình trong điều kiện bất lợi oxy hóa. Sử dụng cây Arabidopsis thaliana bị bất hoạt enzyme catalase 2, nhóm tác giả đã tìm thấy gần 500 vị trí Met bị oxy hóa trong 400 protein, đồng thời cũng định lượng protein giữa cây đột biến bất hoạt enzyme catalase 2 và cây kiểu dại. Tuy nhiên người ta vẫn không biết được các ứng viên tiềm năng để tiếp cận bằng phương pháp sắc kí ái lực và khối phổ. Hiện nay, có bao nhiêu protein mẫn cảm với oxy hóa Met và trong số đó có bao nhiêu protein có thể được sửa chữa bởi Msr vẫn là điều chưa được biết đến. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng đến cây trồng như Mai Văn Chung đã công bố một số kết quả bước đầu về biểu hiện của các dạng oxy phản ứng trong phản ứng bảo vệ của cây đậu (Pisum 6 sativum L.) khi chịu sự tấn công của rệp đậu (Acyrthosiphon pisum Harris) - loại côn trùng chích hút nhựa cây có mức độ phá hoại được đánh giá là nguy hiểm đối với nhiều cây trồng họ Fabaceae. Bên cạnh đó, điều kiện tách chiết cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của diệp hạ châu, một loài dược liệu quý được trồng phổ biến theo quy mô công nghiệp tại nhiều tỉnh của Việt Nam. Tuy nhiên, đó mới chỉ là những nghiên cứu rất sơ lược, bước đầu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng với thực vật tại Việt Nam. Tính đến thời điểm hiện nay, vẫn chưa có bất kỳ công bố chính thức nào về các protein chứa Met mẫn cảm với các tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met và ảnh hưởng qua lại của chúng đến hoạt động của Msr trên thực vật. Đồng thời, để phát hiện và chứng minh các protein đích tiềm năng cho việc can thiệp bằng kĩ thuật di truyền, chúng ta cần phải biết protein nào là mẫn cảm với oxy hóa Met và bao nhiêu trong số chúng có thể sửa chữa bởi Msr. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây Arabidopsis thaliana”. Nghiên cứu này hứa hẹn mở ra một hướng nghiên cứu mới về protein chứa Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa tại Việt Nam. Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Sau khi tìm được các gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã với điều kiện bất lợi, các dòng Arabidopsis biểu hiện quá mức các gen này được tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu của Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN (RIKEN BRC, Nhật Bản). Hạt Arabidopsis thaliana biểu hiện quá mức gen mã hóa MRP nằm trong thư viện dòng FOX (Full-length cDNA Over-eXpressing), được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN, Tsukuba, Nhật Bản. Trong thư viện dòng FOX, cDNA hoàn chỉnh của Arabidopsis được điều khiển bởi promoter 35S và được chèn vào plasmid mang 7 gen chống chịu kháng sinh hygromycin. Plasmid được chuyển vào cây Arabidopsis bằng phương pháp nhúng hoa. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình được trình bày trong Hình 2.1. 2.2.1. Phƣơng pháp tiếp cận bằng tin sinh học 2.2.1.1. Phương pháp chú giải chức năng gen mã hóa MRP Danh sách các gen mã hóa MRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp. Trình tự polypeptide của gen mã hóa MRP với định dạng fasta được đưa vào phần mềm MAPMAN ( và phần mềm Blast2goBasic phiên bản 3.0 (https://www.blast2go.com) để tiến hành phân loại chức năng gen. Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 8 Trong nghiên cứu này, để dự đoán vị trí cư trú của MRP trong tế bào, tệp fasta chứa toàn bộ trình tự của MRP trên Arabidopsis thaliana được sử dụng làm đầu vào để tìm kiếm trên 3 cơ sở dữ liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP ( pSORT ( và CELLO ( 2.2.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện bình thường và điều kiện bất lợi Sử dụng dữ liệu microarray của những nghiên cứu trước đó để đánh giá mức độ biểu hiện của MRP dưới điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn. Các thử nghiệm này được tiến hành theo quy trình như sau: Xử lý hạn: kết quả phân tích được thu thập từ GEO của NCBI. Số hiệu truy cập là GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04 năm 2015, nền tảng là Platforms GPL12621, mẫu phân tích là Samples từ GSM 1037236-GSM 1037247. Xử lý mặn: dữ liệu của nghiên cứu được truy cập theo số hiệu series GSE32087, mẫu phân tích là Samples từ GSM795503 - GSM795514. Tất cả các dữ liệu này được thu thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu. Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng với điều kiện bất lợi sẽ được xác định theo trình tự nhận biết. Trình tự 1-kb ngược dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của mỗi gen AtMRP được tìm kiếm yếu tố cis nhờ phần mềm MEGA 4. 2.2.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm 2.2.2.1. Đánh giá hình thái cây chuyển gen At3G55240 Hạt Arabidopsis chuyển gen và đối chứng sau khi khử trùng được gieo trên đĩa petri chứa môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh hygromycin, trong điều kiện của phòng nuôi cấy mô tế bào, quang chu kỳ sáng: tối là 16:8 giờ, nhiệt độ phòng 9 nuôi 24±2 o C. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ½ MS ở các giai đoạn khác nhau. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Quan sát sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất ở tuần tuổi khác nhau. 2.2.2.2. Đánh giá mức độ đáp ứng của cây chuyển gen trong các điều kiện bất lợi Thử nghiệm tính kháng mặn: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin. Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM. Cây sống sót trên môi trường có bổ sung NaCl sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7. Thử nghiệm tính kháng với kim loại nặng cadmium: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin. Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride ở nồng độ 750 µM. Cây sống sót trên môi trường có bổ sung CdCl2 sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8. Thử nghiệm với paraquat trên lá cây Arabidopsis: Thí nghiệm được tiến hành dựa trên nghiên cứu trước đây của Yang và cs (2007) có cải biến. Gieo hạt cây chuyển gen và đối chứng trên môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh Hygromycin. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Lá cây 3 tuần tuổi được cắt ra và ngâm trong dung dịch paraquat ở các nồng độ khác nhau: 0µM (đối chứng), 0,5µM, 1µM và 2µM, được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng trong vòng 1-2h sau đó được chuyển ra điều kiện ánh sáng liên tục ở 24 oC và quan sát sự mất màu xanh của lá sau 24 giờ. 10 Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP 3.1.1. Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis Tất cả những gen mã hóa cho protein có kích thước lớn hơn 95 gốc axit amin và chứa hàm lượng Met từ 6 % được coi là MRP. Danh sách 121 gen AtMRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp. MAPMAN là một công cụ cho phép chú giải chức năng gen. Kết quả phân tích cho thấy khoảng 50 % gen AtMRP chưa rõ hoặc chưa xác định được chức năng trong tế bào. Số còn lại đóng vai trò quan trọng trong tế bào (Bảng 3.1). Trong đó, điều hòa phiên mã RNA (có 20 AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein (12 AtMRP tương đương 11 %) và con đường tín hiệu Ca2+ (tương ứng với 6 AtMRP, chiếm 5 %) là 3 nhóm chức năng chính được quan tâm khi phân tích MRP. Những phân tích trên MRP đã biết chức năng đều cho thấy vai trò thiết yếu của các protein giàu Met nói riêng tham gia vào trong tế bào thực vật. MRP Bảng 3.1. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo Mapman Nhóm chức năng gen AtMRP Kiểm soát ion kim loại 2 Phản ứng điều kiện bất lợi 1 Xử lý RNA 4 Điều hòa phiên mã RNA 20 Biến đổi protein 12 Truyền dẫn tín hiệu (Ca2+) 6 Chu trình tế bào 3 Sự phát triển 1 Vận chuyển (kim loại) 6 Chưa biết chức năng 56 (Một số gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng) 11 Sản phẩm của các gen AtMRP cũng được phân loại dựa vào phần mềm BLAST2GO phiên bản 3.0 để phân loại thành nhóm chức năng: quá trình sinh học (Hình 3.1), thành phần của tế bào (Hình 3.2) và chức năng phân tử (Hình 3.3). Kết quả phân loại chức năng gen nhờ phần mềm BLAST2GO cũng cho thấy tầm quan trọng của MRP, tham gia vào nhiều chức năng trong các quá trình sinh học của thực vật, giữ chức năng phân tử cũng như tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào. Hình 3.1. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học. (Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng) Hình 3.2. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào (Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng) 12 Hình 3.3. Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử (Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng) Để nhận biết đích đến của MRP trong tế bào, chúng tôi đã sử dụng 3 công cụ bao gồm ChloroP, pSORT và CELLO để dự đoán dựa trên trình tự polypeptide của 121 MRP ở định dạng fasta. Kết quả là 21 MRP được dự đoán có đích đến ở lục lạp bởi ChloroP và/hoặc pSORT, trong khi chỉ có 9 MRP được dự đoán là cư trú trong ty thể của tế bào thực vật bởi pSORT và/hoặc CELLO (Hình 3.4). Trong đó, chỉ có 2 protein cùng được dự đoán là nằm trên lục lạp bởi ChloroP và pSORT và chỉ có 1 protein cũng được dự đoán ở ty thể bởi pSORT và CELLO (Hình 3.4). Hình 3.4. Dự đoán vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng phần mềm ChloroP, pSORT và CELLO Như vậy, để làm rõ hơn đích tác động quá trình oxi hóa và khử Met trong thực vật, nghiên cứu đã chỉ ra một số lượng lớn MRP tham gia vào các quá trình quan trọng trong tế bào như kiểm soát quá trình phiên mã RNA, tín hiệu Ca2+. Sản phẩm của các gen được dự đoán nằm ở các bào quan giàu ROS là lục lạp và ty thể, góp phần làm sáng tỏ hơn chức năng của MRP trong tế bào. 10 92 ChloroP pSORT A. Lục lạp 21 2 61 CELLO pSORT B. Ty thể 9 13 3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện thường và điều kiện bất lợi Trong điều kiện chịu mặn, 11 và 17 gen có mức độ biểu hiện phiên mã tăng và giảm ít nhất 2 lần. Trong khi, 23 và 16 gen được lần lượt có mức độ biểu hiện tương ứng là cao hơn và thấp hơn trong điều kiện chịu hạn. Trong đó, 6 gen cùng có đáp ứng tăng gấp hơn 2 lần và 3 gen cùng giảm biểu hiện đi hơn 2 lần trong cả hai điều kiện cực đoan trong thí nghiệm. Gen At3G59900 có biểu hiện tăng 10,7 lần trong điều kiện chịu hạn nhưng lại giảm biểu hiện -2,6 lần trong điều kiện chịu mặn. Tổng số 10 gen mã hóa MRP có mức độ đáp ứng mạnh nhất trong cả điều kiện hạn hán và mặn được chỉ ra ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao TT Tên gen Met (%) Chiều dài (a.a) Số lần thay đổi ở mức độ biểu hiện Mô tả gen Xử lý hạn Xử lý mặn 1 At1G32560 6,02 134 135,3 3,3 Protein chứa vùng LEA nhóm I 2 At1G33860 8,55 153 2,4 2,2 Protein chưa biết 3 At3G55240 6,12 95 -60,3 -26,9 Biểu hiện quá mức dẫn đến sự “giả vàng úa dưới ánh sáng” 4 At3G59900 6,2 130 10,7 -2,6 Protein chưa biết 5 At3G62090 6,38 346 64,6 2,3 Nhân tố phiên mã bHLH liên quan đến yếu tố MYC 6 At4G12334 6,25 113 -9,8 -3,0 Gen giả mã hóa cho protein trong họ chuỗi truyền điện tử P450 7 At4G33467 8,91 102 337,5 6,2 Protein chưa biết 8 At4G34590 6,33 159 8,3 3,3 Nhân tố phiên mã bZIP11 9 At5G42325 6,03 233 2,7 2,4 Nhân tố phiên mã liên quan đến sự kéo dài 10 At5G67390 7,43 176 -4,2 -4,1 Protein chưa biết Ichikawa và cs (2006) đã báo cáo về sự biểu hiện quá mức của gen này gây ra hiện tượng “giả vàng úa trong điều kiện ánh sáng”. At3G55240 mã hóa cho protein nhỏ có chiều dài 95 axit amin với vùng 3’ không dịch mã tương đối dài (330 bp). 14 Các trình tự tương đồng với gen này cũng được tìm thấy trong các cây họ đậu và họ lúa nhưng không được tìm thấy trong động vật có vú. Điều này cho thấy đây là gen mã hóa cho protein đặc trưng chỉ được biểu hiện trong thực vật. Tuy nhiên, chưa có bất kỳ một công bố nào cho đến nay báo cáo về sự liên hệ của gen At3G55240 với sự chống chịu điều kiện bất lợi. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn At3G55240 là gen ứng viên cho các nghiên cứu tiếp theo để làm rõ hơn vai trò của gen đối với cây trồng trong các điều kiện cực đoan. 3.1.3. Dự đoán yếu tố điều hòa cis trên promoter của các gen mã hóa MRP đáp ứng điều kiện bất lợi Cả 5 yếu tố cis đều được tìm thấy trong các gen AtMRP. Trong đó, MYBR được tìm thấy trong 21 gen AtMRP, ABRE có mặt trong 19 gen AtMRP, 16 gen AtMRP có chứa MYC, 5 gen AtMRP có chứa ICEr2 và RSRE có mặt trong 4 gen AtMRP. Khi phân tích sự có mặt của một số yếu tố cis nằm vùng promoter của AtMRP, ABRE được tìm thấy lặp lại 3 lần trên gen At1G32560, mã hóa cho LEA nhóm I. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hundertmark và cs, trong đó chỉ ra rằng 82% gen LEA có chứa trình tự lõi nhận biết của yếu tố ABRE trong vùng promoter. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được có trung bình 0,61 yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của mỗi gen AtMRP. Ở Arabidopsis, 6 gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã tăng với hạn hán và độ mặn cao có trung bình 0,83 yếu tố cis này trên promoter của mỗi gen. Điều này cho thấy sự tăng nhẹ về tần số xuất hiện của các yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của các MRP có mức độ phiên mã tăng lên trong điều kiện hạn hán và chịu mặn. 15 3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cƣờng biểu hiện gen At3G55240 (dòng RBC1) 3.2.1. Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen Hạt giống dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện của gen At3G55420 (gọi tắt là dòng RBC1 (RIKEN Bioresource Center)) được tiến hành xác định tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử. Kết quả nảy mầm hạt cây RBC1 trên môi trường chứa và không chứa kháng sinh hygromycin được thể hiện qua Hình 3.5. Như vậy, với tỷ lệ nảy mầm 100% trên cả 2 môi trường và không xuất hiện cây bị chết trắng sau khi nảy mầm, hạt RBC1 là đồng hợp tử, đủ điều kiện để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, sức nảy mầm và sự phát triển của mỗi hạt có sự khác biệt nhất định, nguyên nhân là do độ mẩy và lép của hạt thí nghiệm. Hình 3.5. Dòng cây RBC1 đƣợc nảy mầm, A. môi trƣờng ½ MS đặc chứa kháng sinh hygromycin 15mg/l, B. môi trƣờng ½ MS đặc 3.2.2. Đánh giá hình thái của dòng cây chuyển gen a. Hình thái cây trên đĩa thạch Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ở các giai đoạn 7, 10 và 14 ngày tuổi. Kết quả so sánh hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch được trình bày trên Hình 3.6. 16 Hình 3.6. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch b. Hình thái cây trên giá thể đất Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½MS chuyển sang giá thể đất. Sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất được ghi nhận ở giai đoạn 3, 4 và 5 tuần tuổi. Kết quả so sánh hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên môi trường giá thể đất được minh họa trong Hình 3.7. Hình 3.7. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng trên giá thể đất A. Cây 3 tuần tuổi, B. Cây 4 tuần tuổi, C. Cây 5 tuần tuổi 17 Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch và cây trên giá thể đất ở các giai đoạn phát triển khác nhau, dòng cây RBC1 thể hiện kiểu hình có lá màu xanh lá cây nhạt khác biệt so với dòng cây đối chứng. Kiểu hình này tương tự như cây vàng úa trong điều kiện ánh sáng yếu hay còn gọi là “sự giả vàng úa dưới ánh sáng” gọi tắt là PEL (Pseudo-Etiolation in Light). Tuy nhiên, kiểu hình PEL lại không ảnh hưởng đến khả năng quang hợp của dòng RBC1. Lục lạp có cấu trúc tương đối bình thường ngoại trừ khả năng tổng hợp tinh bột thấp hơn so với dòng đối chứng. Các dòng tăng cường biểu hiện gen At3G55240 trong ngân hàng các dòng FOX của RIKEN đều có mức độ phiên mã của gen được tăng lên 1x103 cho đến hơn 1x108 lần so với cây kiểu dại. Khi mức độ biểu hiện của At3G55240 càng tăng thì số lượng lục lạp càng giảm. Như vậy, mức độ biểu hiện của At3G55240 tỷ lệ nghịch với hàm lượng lục lạp của cây. 3.2.3. Đánh giá đáp ứng của dòng cây chuyển gen với các điều kiện bất lợi Để kiểm tra việc giảm biểu hiện của At3G55240 có liên quan đến tín hiệu phòng vệ, gen At3G55240 được biểu hiện quá mức trong cây mô hình A. thaliana và thử nghiệm phản ứng của cây trong một số điều kiện bất lợi thường gặp. Gieo dòng hạt chuyển gen RBC1 và hạt đối chứng kiểu dại trên môi trường ½ MS tương ứng có và không có kháng sinh hygromycin 15mg/l . Chọn các cây có kích thước tương đương nhau ở giai đoạn 12 ngày tuổi chuyển sang 3 loại môi trường: (i) Môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM: đĩa thử nghiệm NaCl, lặp lại 3 lần. (ii) Môi trường ½ MS, có bổ sung CdCl2 ở nồng độ 750 µM: đĩa thử nghiệm CdCl2, lặp lại 3 lần. (iii) Môi trường ½ MS: đĩa đối chứng. Đếm các cây sống sót trên môi trường NaCl và CdCl2 bắt đầu từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8. Kết quả thử nghiệm kháng mặn ở nồng độ NaCl 175 mM được biểu hiện trên Hình 3.8 và Hình 3.9. 18 Hình 3.8. Đĩa thạch mang cây RBC1 và cây kiểu dại trên môi trƣờng ½ MS Hình 3.9. Thử nghiệm chịu mặn trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. Cây 12 ngày tuổi đƣợc chuyển sang môi trƣờng ½ MS có chứa 175 mM NaCl . Hình 3.10. Thử nghiệm cadmium trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. Cây 12 ngày tuổi đƣợc chuyển sang môi trƣờng ½ MS có chứa 750 µM CdCl2 Kết quả này cho thấy cả dòng cây đối chứng (kiểu dại) và dòng cây chuyển gen RBC-1 đều có biểu hiện đáp ứng nhạy cảm trong điều kiện nồng độ NaCl cao (sự xuất hiện các cây bị trắng lá sau 4 ngày chuyển đĩa). Như vậy, việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana nhiều khả năng đã làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào ở nồng độ NaCl cao. Sau 5 ngày kể từ ngày chuyển sang môi trường ½ MS có chứa CdCl2 750µM, lá của dòng cây RBC-1 bắt đầu có hiện tượng vàng úa dần dần. Như vậy, RBC-1 xuất hiện triệu chứng bị gây độc bởi Cd sớm hơn so với giống cây kiểu dại (Hình 3.8 và Hình 3.10). Do vậy, dễ dàng nhận thấy rằng việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mô hình A. thaliana cũng làm gia tăng mức độ nhạy cảm của tế bào với CdCl2 ở nồng độ cao. 20 Cuối cùng, dòng cây RBC1 được so sánh với dòng cây đối chứng trong thí nghiệm nhạy cảm với thuốc diệt cỏ paraquat. Paraquat là hợp chất có hoạt tính khử, nguyên nhân sinh ra anion superoxide trong tế bào được ghi nhận ở Arabidopsis và Nicotiana benthamian. Do đó, paraquat gây nên sự phá hủy và giết chết tế bào. Hình 3.11. Thử nghiệm paraquat trên dòng cây đối chứng và dòng cây RBC1 Kết quả của thí nghiệm cho thấy tăng cường mức độ phiên mã của gen At3G55240 trong dòng RBC1 cũng làm tăng tính nhạy cảm của tế bào với paraquat (Hình 3.11). Lá của dòng RBC1 xử lý với paraquat bị mất diệp lục và trở nên trắng hoàn toàn chỉ sau 24 giờ xử lý. Điều này được nhận thấy ở tất cả các nồn