Luận văn Nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử ssrs liên kết với locus kiểm soát chất lượng xơ ở cây bông

Chỉ thị RFLP đƣợc sử dụng khá phổ biến ở thập kỷ 90 trong nghiên cứu lập bản đồ liên kết di truyền ở cây trồng, trong đó có cây bông và hiện nay đang dần đƣợc thay thế bằng chỉ thị SSR, SNP... [70][78] RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): là kỹ thuật chỉ thị phân tử dựa trên PCR thế hệ đầu tiên do Williams và cs. phát hiện năm 1990 [95]. RAPD sử dụng những mồi PCR ngẫu nhiên, dài từ 9 - 12 nucleotide để nhân bội những trình tự ngẫu nhiên trên hệ gen. Kỹ thuật này có nhiều ƣu điểm hơn RFLP ở chỗ nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích thấp, không cần biết những thông tin về trình tự, dễ dàng phân tích số lƣợng mẫu lớn. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của RAPD là chỉ thị trội, do đó không có khả năng phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Kỹ thuật RAPD thiếu khả năng lặp lại do kết quả phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm nhƣ kỹ năng phòng thí nghiệm, chu kỳ chạy PCR, chất lƣợng và nồng độ mồi... Kỹ thuật RAPD trƣớc đây đƣợc sử dụng khá phổ biến trong phân tích đa hình của hệ gen thực vật, chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử trong những quần thể lai khác loài... RAPD cũng đƣợc sử dụng kết hợp với các loại chỉ thị khác trong nghiên cứu lập bản đồ liên kết ở cây bông [99]. Tuy nhiên, gần đây chỉ thị RAPD chỉ còn đƣợc sử dụng chủ yếu ở những đối tƣợng cây trồng còn thiếu thông tin về hệ gen. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism): đƣợc phát triển bởi Vos và cs. (1995) cũng là một kỹ thuật chỉ thị phân tử dựa trên PCR. Ƣu điểm của AFLP là kỹ thuật có độ nhạy cao dễ phát hiện đa hình trong toàn bộ hệ gen [85]. AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, số liệu đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống. Trƣớc đây, kỹ 24 thuật AFLP đƣợc sử dụng khá phổ biến để đánh giá đa dạng di truyền ở cây bông, phát triển lập bản đồ liên kết cùng với các chỉ thị khác. Nhƣợc điểm của AFLP là chỉ thị di truyền trội do đó không có khả năng phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử, phƣơng pháp phức tạp, giá thành nghiên cứu tƣơng đối cao, do vậy chỉ thị AFLP hiện nay cũng không còn đƣợc sử dụng rộng rãi trên đối tƣợng cây trồng nói chung và cây bông nói riêng. SSR (Simple Sequence Repeats): còn gọi là các microsatellite, là những đoạn ADN có trình tự đơn giản đƣợc lặp lại nhiều lần, mỗi đơn vị lặp dài từ 1- 6 bp, đƣợc mô tả đầu tiên bởi Litt và cs. (1989) [59]. Các chỉ thị SSR có ƣu điểm là khá phong phú, phân bố trên toàn hệ gen, di truyền đồng trội, đa alen, nhân bản dễ dàng, độ phân giải cao và dễ dàng thao tác dựa trên kỹ thuật PCR. Nhờ những lợi thế sẵn có đó, SSR đã đƣợc phát triển trên nhiều đối tƣợng thực vật khác nhau. Mặc dù còn những hạn chế trong sự hiểu biết về chức năng của các đơn vị lặp lại, SSR đã trở thành loại chỉ thị đƣợc sử dụng rộng rãi trong phân tích hệ gen thực vật. Cho đến nay, chỉ thị SSR đã và đang đƣợc sử dụng thành công cho nhiều ứng dụng trong lĩnh vực di truyền và cải tiến giống cây trồng nói chung cũng nhƣ cây bông nói riêng nhƣ lập bản đồ gen hữu ích, xây dựng bản đồ liên kết di truyền, chọn lọc dựa vào sự trợ giúp của chỉ thị và lai trở lại (MAS, MABC), nhận biết giống cây trồng, xác minh phả hệ, phân tích đa dạng di truyền và nghiên cứu tiến hóa [40][47]. 1.3.2. Sự phát triển của chỉ thị SSR và các cơ sở dữ liệu về chỉ thị phân tử của cây bông Nhờ có những phƣơng pháp mới và hiệu quả trong việc phân lập các trình tự lặp lại đã giúp giảm giá thành sản xuất các cặp mồi SSR và thúc đẩy sự ứng dụng mạnh mẽ hệ thống chỉ thị này [65]. Các chỉ thị SSR có thể đƣợc phát triển trực tiếp từ thƣ viện ADN hệ gen hoặc từ những thƣ viện đƣợc làm 25 giàu đặc hiệu cho SSR. Hiện nay, số lƣợng lớn các chỉ thị SSR đã đƣợc phát triển và đƣợc tích hợp vào các cơ sở dữ liệu hệ gen cây trồng [40]. Trên đối tƣợng chi bông Gossypium, sự phát triển của chỉ thị SSR đƣợc ghi nhận từ những năm 90, với sự công bố quy trình phân lập và phân tích đặc tính của thƣ viện microsatellite với hơn 500 chỉ thị SSR [24]. Nguồn chỉ thị SSR mới liên tục đƣợc phát triển và bao phủ rộng trên hệ gen cây bông. Reddy và cs. (2001) đã công bố một quy trình phân lập microsatellite với chi phí thấp, dễ sử dụng và hiệu quả. Với quy trình tối ƣu này, hơn 10.000 SSR với đơn vị lặp 2 và 3 nucleotide từ hệ gen bông Luồi G. hirsutum L. đã đƣợc phân lập, trong đó 588 đoạn ADN đƣợc giải trình tự và 307 trình tự mồi đã đƣợc thiết kế. Kết quả thử nghiệm trên tập hợp các giống bông Luồi G. hirsutum L. và bông Hải đảo G. barbadense L. đã ghi nhận đƣợc khoảng 49% mồi cho đa hình [69]. Tác giả Nguyen và cs. (2004) đã phát hiện và định vị đƣợc 392 trình tự microsatellite và thiết kế mồi để sàng lọc đa hình giữa hai giống bông bố mẹ G. hirsutum và G. barbadense, kết quả đã ghi nhận đƣợc 56% tƣơng ứng với 204 cặp mồi cho đa hình. Nguồn chỉ thị này đã đƣợc sử dụng để xây dựng bản đồ liên kết di truyền trên cây bông tứ bội và xác định QTL kiểm soát các tính trạng quan tâm trên cây bông [64]. Những công bố rộng rãi về việc phát hiện các microsatellite ở các đoạn trình tự biểu hiện (EST) trên cây bông đã thúc đẩy những nghiên cứu phát triển chỉ thị EST- SSR. Từ dữ liệu 13.505 EST trong hai thƣ viện cDNA sợi và noãn bông Luồi, Han và cs. (2006) đã phát triển đƣợc 489 cặp mồi EST- SSR. Những cặp mồi này đã đƣợc sử dụng để sàng lọc đa hình giữa bông Luồi và bông Hải đảo và thu nhận đƣợc 114 cặp mồi EST-SSR đa hình tƣơng ứng với 130 locus EST-SSR. Trong số đó, 123 locus đƣợc tích hợp trên bản đồ liên kết di truyền cây bông dị tứ bội [35]. Ngoài ra, một công trình nghiên cứu khác năm 2009 cũng công bố một bộ mồi PCR cho 5.475 trình tự EST- 26 SSR, trong đó 2.937 trình tự đƣợc xác định là duy nhất và khuếch đại khoảng 4.000 locus trong hệ gen bông tứ bội. Bộ chỉ thị này đã đƣợc tích hợp trong cơ sở dữ liệu CMD và đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu lập bản đồ liên kết và bản đồ QTL trên cây bông [98]. Kết quả của các chƣơng trình nghiên cứu trên hệ gen cây bông, chỉ thị phân tử và những thông tin khoa học trên đối tƣợng Gossypium đã đƣợc tích hợp và công bố trên các trang web chuyên ngành. Cơ sở dữ liệu chỉ thị cây bông (Cotton Marker Database- CMD) [19][113] hiện đã cung cấp khả năng truy cập miễn phí với 17.448 SSRs và 312 trình tự RFLP có chứa SSR đã đƣợc lập bản đồ. CMD có chứa dữ liệu về các công trình công bố, trình tự, mồi, bản đồ và dữ liệu tƣơng đồng cho 9 dự án microsatellite. Hệ thống các mồi SSR trên cây bông đƣợc đặt tên tƣơng ứng từ những dự án phát triển chúng: BNL, CIR, JESPR, NAU, STV, TMB... Trong đó, một số nhóm mồi đƣợc sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống phân tử trên cây bông nhƣ BNL, CIR, NAU, JESPR, MUSS, STV, TMB. Số lƣợng các cặp mồi thuộc các nhóm cũng rất khác nhau trong CMD, với 379 cặp mồi BNL, 392 cặp mồi CIR, 3.251 cặp mồi NAU, 53 cặp mồi CM, 311 cặp mồi JESPR, 1.172 cặp mồi MUSS/MUCS, 150 cặp mồi STV, 750 cặp mồi TMB... [113] Ngoài CMD, Cơ sở dữ liệu cây bông (Cotton Database Resources- CottonGen) cũng là một nguồn cơ sở dữ liệu chứa thông tin di truyền, hệ gen và phân loại chi bông (Gossypium spp.) [112] . CottonGen vừa là cơ sở dữ liệu lƣu trữ vừa là cơ sở dữ liệu động, trong đó kết hợp các dữ liệu mới và các nguồn sử dụng. Đây thực sự là các cơ sở dữ liệu hữu ích, dễ truy cập, giúp cho các nhà nghiên cứu sử dụng hiệu quả hơn các nguồn chỉ thị microsatellite và sẽ giúp tăng tốc độ nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng trong chọn giống phân tử và lập bản đồ liên kết di truyền trong chi Gossypium spp. 27 1.4. NGHIÊN CỨU LẬP BẢN ĐỒ LIÊN KẾT DI TRUYỀN VÀ BẢN ĐỒ CÁC LOCUS QUY ĐỊNH CHẤT LƢỢNG XƠ Ở CÂY BÔNG 1.4.1. Những nghiên cứu lập bản đồ liên kết di truyền ở cây bông trên thế giới Bản đồ liên kết di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử đã trở thành công cụ quan trọng trong phân tích hệ gen, phát hiện các QTL liên quan đến các tính trạng quan trọng, lập bản đồ vật lý, chọn dòng dựa vào bản đồ và chọn lọc dựa vào chỉ thị (MAS) trên nhiều đối tƣợng thực vật khác nhau. Sau khi bản đồ liên kết di truyền đầu tiên dựa vào chỉ thị RFLP trên đối tƣợng cây bông đƣợc Reinisch và cs. công bố năm 1994, nhiều bản đồ dựa trên các chỉ thị RFLP, RAPD, SSR và AFLP cũng đã lần lƣợt đƣợc công bố và có những ứng dụng thực tiễn trong nghiên cứu và chọn tạo giống bông trên toàn thế giới. Các bản đồ liên kết di truyền đƣợc công bố sớm nhất là kết quả của những công trình nghiên cứu trên chỉ thị RFLP. Bản đồ liên kết đầu tiên do Reinisch và cs. công bố năm 1994 bao gồm 705 chỉ thị RFLP phân bố trên 41 nhóm liên kết, trải dài 4.675 cM, thu đƣợc khi phân tích quần thể con lai giữa G. hirsutum và G. barbadense. Bản đồ này đã đặt nền móng và tạo thêm cơ hội cho các nghiên cứu tiến hóa NST và khai thác nguồn di truyền Gossypium trong tự nhiên [70]. Năm 1998, Shappley và cs. đã công bố một bản đồ liên kết với 120 locus RFLP phân bố trên 31 nhóm liên kết, trải dài 865 cM. Mỗi nhóm liên kết bao gồm từ 2 đến 10 locus, chiều dài từ 0,5-107 cM [78]. Năm 1999, Brubaker và cs. công bố một bản đồ RFLP khác và so sánh kích thƣớc hệ gen giữa các loài dị tứ bội (hệ gen AD, n=26) và lƣỡng bội (hệ gen A và D, n=13). Tác giả đã nhận định rằng sự đa bội hóa trong chi Gossypium có liên quan đến tái tổ hợp tăng cƣờng vì chiều dài di truyền của hệ gen dị tứ bội lớn hơn 50% so với tổng các phần lƣỡng bội hệ gen A và D [21]. 28 Những bản đồ liên kết di truyền cây bông đƣợc công bố trong thời gian tiếp theo đã đƣợc xây dựng từ chỉ thị SSR hoặc kết hợp nhiều loại chỉ thị khác nhau. Tác giả Nguyen và cs. (2004) đã công bố bản đồ liên kết với 233 locus SSR. Bản đồ liên kết này đã đƣợc cập nhật vào bản đồ trƣớc đó với tổng số 1.160 locus (gồm cả RAPD, RFLP và SSR) trải dài trên 5.519 cM, khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị là 4,8 cM. Bản đồ gồm 466 chỉ thị SSR, với khoảng cách trung bình giữa hai chỉ thị SSR là 12 cM, đã cung cấp thông tin hữu ích cho những nghiên cứu về QTLs [64]. Tác giả Rong và cs. (2004) cũng công bố bản đồ liên kết di truyền cho hệ gen Gossypium lƣỡng bội (D) và dị tứ bội (AD) bao gồm 2.854 locus SSR cho hệ gen AD và 763 locus cho hệ gen D. So sánh hai bản đồ đã nhận thấy tái tổ hợp đôi không nhiều nhƣ mong đợi ở cả bông lƣỡng bội và bông tứ bội và tác giả cho rằng hiện tƣợng này là do quá trình trao đổi chéo bị ảnh hƣởng (negative crossover interference) [72]. Việc nhận biết những SSR nằm trong 312 trình tự RFLP cùng với bản đồ 124 SSR và sự phát hiện những chỉ thị CAPS và SNPs đã chứng minh khả năng thay đổi vị trí của những locus SSR ở các quần thể và các hệ thống chỉ thị này có ích cho việc cải tiến phƣơng pháp MAS ở cây bông. Kết quả này đã thúc đẩy những nghiên cứu về cấu trúc, chức năng và tiến hóa hệ gen. Các bản đồ liên kết di truyền do Song và cs. (2005) xây dựng dựa trên những quần thể khác nhau giữa G. hirsutum L. và G. barbadense L. gồm 440 SSR trải dài 4.331,2 cM đƣợc lập từ quần thể đơn bội kép và bản đồ gồm 444 SSR với chiều dài 3.262,9 cM đƣợc lập từ quần thể BC1. Sự khác nhau có ý nghĩa trong tái tổ hợp giữa các bản đồ đã đƣợc quan sát ở mức độ NST và hệ gen. Nhờ việc so sánh các bản đồ và kết hợp các bộ dữ liệu, tác giả đã cung cấp thông tin hữu ích cho những nghiên cứu về đa dạng, cấu trúc quần thể, cũng nhƣ các nghiên cứu lập bản đồ QTL/ gen trong chi Gossypium [81]. 29 Tuy nhiên, để có đƣợc những phân tích toàn diện về hệ gen bông và lập bản đồ QTL, các nhà khoa học cũng đã nhận định rằng cần thiết phải phát triển nhiều chỉ thị hơn nữa và phát hiện những bộ chỉ thị mới. Các đoạn trình tự biểu hiện (EST- Expressed sequence tags) đã cung cấp nguồn chỉ thị phong phú và đƣợc các nhà khoa học bổ sung vào các bản đồ liên kết cây bông đã công bố [35][61][66][86]. Với mục đích lập đƣợc bản đồ liên kết di truyền mật độ cao và xác định đƣợc những gen kiểm soát chất lƣợng xơ phục vụ chọn tạo giống, Park và cs. (2005) đã sử dụng một bộ chỉ thị microsatellite mới bao gồm cả dạng đơn giản (simple- SSR) và dạng phức hợp (complex- CSR) để phân tích trên 183 dòng nội phối tái tổ hợp (RIL) phát triển từ phép lai khác loài giữa G. hirsutum TM1 và G. barbadense Pima 3-79. Từ tổng số 1.232 cặp mồi EST-SSR (MUSS) và CSR (MUCS), 1.019 (83%) cặp mồi cho sản phẩm PCR với những giống nghiên cứu, tuy nhiên chỉ có 202 chỉ thị (19,8%) cho đa hình giữa hai giống bông bố mẹ. Trong số đó, chỉ có 86 chỉ thị (42,6%) biểu hiện trình tự thực sự tƣơng đồng với những gen kiểm soát những chức năng đã biết. Bản đồ liên kết di truyền đƣợc tạo ra gồm có 193 locus, trong đó có 121 locus chất lƣợng xơ mới chƣa đƣợc xác định trƣớc đó. Phân tích đã cho thấy các NST số 2,3,15 và 18 có thể tập trung nhiều locus chất lƣợng xơ. Những chỉ thị EST-SSR này có tính ứng dụng cao trong các nghiên cứu lập bản đồ liên kết di truyền mật độ cao, nghiên cứu cấu trúc và chức năng gen kiểm soát chất lƣợng xơ và ứng dụng MAS trong cải tiến chất lƣợng xơ của cây bông [66]. Trong nghiên cứu của mình, tác giả Guo và cs. (2007) cũng sử dụng 2.218 SSR từ EST (1.554 từ G. raimondii và 754 từ G. hirsutum) để sàng lọc đa hình phục vụ cho việc lập bản đồ liên kết di truyền khung ở bông dị tứ bội. Trong số những chỉ thị đƣa vào sàng lọc, có 47,9% chỉ thị từ G.raimondii và 23,9% chỉ thị từ G. hirsutum cho đa hình giữa hai giống bố mẹ. Bản đồ liên 30 kết di truyền bao gồm 1.790 locus với 26 nhóm liên kết và bao phủ 3.425,8 cM với khoảng cách giữa hai chỉ thị là 1,91 cM. Bản đồ liên kết giàu gen dựa vào microsatellite (microsatellite-based, gene-rich linkage map) của nhóm tác giả đã chứa 71,96% locus chỉ thị chức năng, với 87,11% là các locus SSR [32]. Ngoài các loại chỉ thị thông dụng nhƣ RFLP, SSR, AFLP, nhiều hệ thống chỉ thị khác cũng đƣợc đƣợc phát hiện và sử dụng thành công trong các nghiên cứu lập bản đồ liên kết di truyền ở cây bông. Hệ thống chỉ thị SRAP (Sequence-related amplified polymorphism) đã đƣợc Li và cs. phát hiện năm 2001 và đƣợc sử dụng kết hợp cùng các hệ thống chỉ thị SSR, RFLP trong một số công trình nghiên cứu lập bản đồ liên kết di truyền trên cây bông [54][56][104]. Hệ thống chỉ thị TRAP (target region amplification polymorphism) cũng dựa trên PCR đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây trồng và trên cả cây bông [102]. Chỉ thị phân tử đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu gần đây có xu hƣớng tăng về số lƣợng nhằm mục đích xây dựng đƣợc những bản đồ liên kết di truyền với mật độ chỉ thị cao hơn. Bản đồ liên kết mật độ cao của Yu và cs. (2007) xây dựng từ quần thể con lai F2 thu đƣợc từ phép lai khác loài giữa hai giống bông dị tứ bội G. hirsutum và G. barbadense. Bản đồ gồm có 1.097 chỉ thị với 697 SSR, 171 TRAPs, 129 SRAP, 98 AFLP và 2 chỉ thị hình thái, trải dài 4.536,7 cM với khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị là 4,1 cM [102]. Bên cạnh đó, bản đồ liên kết di truyền do He và cs. (2007) xây dựng với các chỉ thị dựa vào PCR rất có ích cho chƣơng trình chọn giống dựa vào chỉ thị. Bản đồ của nhóm tác giả gồm 4 loại chỉ thị SSR, SRAP, RAPD và REMAP đƣợc sử dụng để phân tích quần thể con lai F2 thu đƣợc từ phép lai giữa Handan208 (G. hirsutum) và Pima (G. barbadense). 69 cây F2 đƣợc sử dụng để xây dựng bản đồ với 834 SSR, 437 SRAP, 107 RAPD và 16 31 REMAP. Qua phân tích liên kết, nhóm tác giả nhận thấy rằng 1.029 locus đã đƣợc lập thành 26 nhóm liên kết, bao phủ 5.472,3 cM, khoảng cách trung bình giữa hai locus là 5,32 cM [37]. Bản đồ của Ma và cs. (2008) xây dựng từ quần thể con lai F2 thu đƣợc từ phép lai cùng loài của bông lƣỡng bội hệ gen A (G. arboreum L.) với các chỉ thị SSR bao gồm 267 locus với chiều dài 2.508,71 cM, khoảng cách trung bình giữa hai chỉ thị là 9,40 cM [61]. Bản đồ này đã đƣợc nhiều nghiên cứu khác tham khảo và làm bản đồ đối chiếu trong nghiên cứu của mình [6]. 1.4.2. QTL và những nghiên cứu lập bản đồ QTL chất lƣợng xơ ở cây bông trên thế giới Nhận biết những locus đóng góp vào biến dị di truyền các tính trạng số lƣợng trong tự nhiên (nhƣ năng suất và chất lƣợng của cây trồng) luôn đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Số lƣợng và hiệu quả của những locus này (còn gọi là những locus tính trạng số lƣợng- QTLs) sẽ cung cấp cơ sở di truyền học, hóa sinh học của những tính trạng nghiên cứu cũng nhƣ sự tiến hóa của chúng trong quần thể qua thời gian. Thêm vào đó, những hiểu biết về QTLs sẽ hỗ trợ đắc lực trong việc nghiên cứu cải tiến chất lƣợng cây trồng. Cải tiến chất lƣợng xơ luôn là một hƣớng trọng tâm trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống cây bông trên toàn thế giới. Chất lƣợng xơ là tính trạng số lƣợng, điều khiển bởi đa gen. Nhận biết những QTL ổn định đóng góp hiệu quả vào những tính trạng chất lƣợng xơ quan trọng sẽ cung cấp những chìa khóa cơ bản cho những dự án chọn giống dựa vào chỉ thị phân tử. Nhiều công trình nghiên cứu về các QTL chất lƣợng xơ trên cây bông tứ bội sử dụng những loại quần thể khác nhau (F2, BC, RIL...) đã đƣợc công bố trên thế giới. Nhóm tác giả Lacape và cs. (2005) đã tiến hành nghiên cứu trên các quần thể lai trở lại thế hệ BC1 và BC2 và định vị đƣợc 26 QTL trên 32 bản đồ NST và công bố hiệu quả của chúng. Các QTL đƣợc phát hiện có ảnh hƣởng tới các tính trạng kinh tế quan trọng nhƣ chiều dài xơ, độ bền xơ, độ mịn xơ và màu sắc xơ. Tác giả cũng nhận biết 19 vùng trên 15 NST khác nhau là v ng đích cho những chiến lƣợc chọn lọc bằng chỉ thị phân tử [52]. Công trình nghiên cứu của Shen và cs. (2005) đã xác định đƣợc 39 QTL chất lƣợng xơ thông qua lập bản đồ kết hợp dựa trên 3 quần thể bông Luồi G. hirsutum, trong đó có 11 QTL chiều dài xơ, 10 QTL độ bền xơ, 9 QTL độ mịn xơ và 9 QTL độ giãn xơ. Trong số đó có 5 QTL ổn định ở các quần thể phân ly, chỉ ra tiềm năng lớn cho việc sử dụng MAS trong cải tiến chất lƣợng xơ. Tác giả cũng nhận định kết quả thu đƣợc đã cung cấp những hiểu biết tốt hơn trong nghiên cứu di truyền các tính trạng xơ ở cây bông tứ bội [80]. Đến năm 2007, cũng nhóm tác giả Shen và cs. đã công bố kết quả nghiên cứu xây dựng bản đồ QTL năng suất và chất lƣợng xơ khi phân tích các dòng nội phối tái tổ hợp (RIL) phát triển từ quần thể con lai F2 của giống bông Luồi G. hirsutum L. Bản đồ liên kết di truyền đƣợc xây dựng bao gồm 156 locus SSR, với chiều dài 1.024,4 cM. Tác giả đã phát hiện đƣợc 25 QTL chất lƣợng xơ và các yếu tố cấu thành năng suất, trong đó có 4 QTL có hiệu quả ảnh hƣởng lớn đến chất lƣợng xơ và 7 QTL ảnh hƣởng lớn đến các yếu tố cấu thành năng suất. Tác giả cũng công bố những cặp chỉ thị liên kết liền kề hai phía với các QTL năng suất và chất lƣợng xơ. Ví dụ, trên NST D8, cặp chỉ thị JESPR127- CIR070a liên kết với QTL độ bền xơ qFS-D8-1; cặp NAU1037- BNL2961 liên kết với QTL độ mịn xơ qFMIC-D8-1; cặp chỉ thị NAU1262-NAU1125 liên kết chặt với QTL kích thƣớc hạt qBS-D8-1 và QTL năng suất bông hạt qSY-D8-1. Đây là những QTL có ảnh hƣởng lớn tới tính trạng tƣơng ứng với tỷ lệ quy định biến dị kiểu hình đều trên 15% [79]. 33 Những nghiên cứu về ứng dụng chỉ thị ADN trong cải tiến cây bông tiếp tục đƣợc quan tâm nghiên cứu trên thế giới trong những năm gần đây. Loại chỉ thị đƣợc sử dụng thông dụng nhất vẫn là SSR. Trong nghiên cứu của mình, tác giả Wu và cs. (2009) đã phân tích 14 tính trạng nông học và chất lƣợng xơ của quần thể gồm 188 dòng RIL phát triển từ 94 dòng F2 giữa hai giống bố mẹ „HS 46‟ và „MARCABUCAG8US-1-88‟. Kết quả phân tích di truyền số lƣợng đã cho thấy các yếu tố di truyền đã chi phối hơn 20% biến dị kiểu hình đối với tất cả các tính trạng nghiên cứu trừ chu vi sợi (18%). 56 QTL liên quan tới 14 tính trạng nông sinh học và chất lƣợng xơ đã đƣợc định vị trên 17 NST, trong số đó có một số QTL quy định trên 10% biến dị kiểu hình. Nhóm nghiên cứu cũng công bố những cặp chỉ thị SSR liên kết liền kề hai phía QTL quan tâm. Ví dụ, trên NST số 5, cặp chỉ thị CIR328- BNL3029 liên kết với QTL độ bền xơ, cặp chỉ thị BNL3241- BNL2609 liên kết với QTL độ mịn xơ. Các NST 3, 5, 12, 13, 14, 16, 20 và 26 mang những QTL quan trọng cho cả tính trạng năng suất và chất lƣợng xơ. Tác giả nhận định những QTL này sẽ rất có ích cho chọn lọc dựa vào chỉ thị nhằm cải thiện một cách có hiệu quả công tác chọn tạo giống bông [97]. Đa số những nghiên cứu lập bản đồ QTL chất lƣợng xơ trên thế giới đều có định hƣớng ứng dụng cho chọn tạo và cải tiến các giống bông. Chỉ riêng với tính trạng độ bền xơ, tác giả Chee và Campell (2009) đã tổng kết đƣợc hơn 80 QTL từ 17 nghiên cứu lập bản đồ QTL khác nhau đã đƣợc công bố trên thế giới. Số lƣợng QTL độ bền xơ đƣợc phát hiện trong mỗi nghiên cứu thay đổi từ 1 tới 21, giải thích từ 2,4 đến 53,8% tổng số biến dị kiểu hình của tính trạng [22]. Do vậy, việc quy tụ những QTL quan tâm vào cùng một nền di truyền là việc hoàn toàn có thể thực hiện. Tuy nhiên, việc nhận biết đƣợc các QTL chính và ổn định để cải tạo hiệu quả chất lƣợng xơ đòi hỏi một thời gian dài nghiên cứu liên tục của các nhà khoa học và sự kế thừa kết quả 34 của các công trình trƣớc đó. Nghiên cứu của nhóm tác giả Kumar và cs. (2012) là một ví dụ. Kế thừa kết quả của các nghiên cứu trƣớc về QTL độ bền xơ chính đƣợc định vị trên NST 24 ở giống bông Suyuan 7235, nhóm tác giả đã nghiên cứu liên tục từ năm 2007 trở lại đây và đã xác nhận đƣợc hiệu quả của QTL độ bền xơ quy định trên 40% biến dị kiểu hình, ổn định qua các thế hệ và các quần thể nghiên cứu khác nhau. Cặp chỉ thị SSR BNL2621- BNL3145 liên kết liền kề hai phía với v ng định vị của QTL và 10 chỉ thị SSR nằm giữa hai chỉ thị này đã đƣợc sử dụng để sàng lọc những dòng ƣu tú mang QTL độ bền xơ trong chƣơng trình cải tạo giá trị kinh tế cho giống bông ở Hoa Kỳ [46]. Trong một nghiên cứu khác, Zhang và cs. (2012) đã phát triển quần thể lai phức hợp (composite cross population) từ ba giống bông Luồi ƣu tú với mục đích xây dựng đƣợc bản đồ liên kết di truyền mật độ cao và nhận biết những QTL có liên quan đến chất lƣợng xơ bông. Bản đồ liên kết di truyền đƣợc xây dựng bao gồm 978 chỉ thị SSR phân bố trên 69 nhóm liên kết, chiều dài bản đồ là 4.184,4 cM, bao phủ khoảng 94,1% hệ gen bông tứ bội. Tổng số 63 QTL đƣợc phát hiện dựa trên dữ liệu kiểu hình trong ba năm 2007, 2008 và 2009. Những QTL này phân bố trên 18 NST, giải thích từ 8,1- 55,8% biến dị kiểu hình, trong đó có 11 QTL độ giãn xơ, 16 QTL chiều dài xơ, 9 QTL độ mịn xơ, 10 QTL độ bền xơ và 17 QTL độ đều xơ. Tuy nhiên, trong số những QTL đƣợc phát hiện, chỉ có 6 QTL đƣợc phát hiện liên tục trong 2 năm. Điều này cho thấy tác nhân môi trƣờng có ảnh hƣởng quan trọng đến sự biểu hiện của QTL. Nhóm tác giả cũng nhận biết sự tƣơng đồng về vị trí của 11 QTL trong nghiên cứu của mình với các công trình đã công bố trƣớc đó. Những QTL đƣợc phát hiện trong hai môi trƣờng và ở các quần thể khác nhau rất có giá trị cho chƣơng trình chọn giống dựa vào chỉ thị, do vậy tác giả đã đặt mục tiêu cho bƣớc nghiên cứu tiếp theo là kết hợp bản đồ liên kết di truyền của 35 mình với hai bản đồ của các tác giả khác thành một bản đồ kết hợp mật độ cao phục vụ cho việc xác định chính xác QTL sử dụng trong chọn tạo giống [105]. Việc nhận biết những QTL chất lƣợng xơ ổn định qua nhiều thế hệ và các môi trƣờng khác nhau sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử nhằm cải tiến chất lƣợng của các giống bông trồng trọt. Nghiên cứu liên tục nhiều năm trên những quần thể từ thế hệ đầu (F2, F2:3) cho đến các quần thể nội phối tái tổ hợp (RIL, F6:8) đã đƣợc Sun và cs. tiến hành từ năm 2001 đến 2012 nhằm phát hiện những QTL thực sự ổn định qua các thế hệ khác nhau và ở các môi trƣờng khác nhau. Các quần thể phân ly thu đƣợc từ phép lai cùng loài giữa hai giống bông Luồi 0-153 có chất lƣợng xơ tốt và giống sGK9708 là giống chuyển gen chất lƣợng xơ trung bình đã đƣợc thƣơng mại hóa. Tác giả đã sử dụng 5.742 cặp mồi SSR để sàng lọc đa hình giữa hai giống bố mẹ. Bản đồ liên kết di truyền của quần thể con lai F2 và RIL đƣợc xây dựng bao gồm 155 và 190 locus với tổng chiều dài tƣơng ứng là 959,4 cM và 700,9 cM. QTL chất lƣợng xơ đƣợc sàng lọc qua các thế hệ và các môi trƣờng thông qua lập bản đồ kết hợp CIM (composite interval mapping). Tổng số 50 QTL chất lƣợng xơ đƣợc phát hiện, trong đó 10 QTL độ bền xơ, 10 QTL chiều dài xơ, 10 QTL độ mịn xơ, 8 QTL độ đều xơ và 12 QTL độ giãn xơ. Trong số đó có 9 QTL đƣợc nhận biết trong cả ba loại quần thể nghiên cứu là F2, F2:3 và RIL. Hai QTL độ bền xơ trên NST C7 và C25 đƣợc nhận thấy là ổn định qua các thế hệ và các môi trƣờng nghiên cứu, đã giải thích 16,67- 27,86% và 9,43- 21,36% biến dị kiểu hình. Tác giả cũng công bố những cặp chỉ thị liên kết liền kề hai phía của các QTL ổn định này, ví dụ cặp NAU1085- TMB1618 trên NST số 7 và cặp chỉ thị NAU3298b- CM067 trên NST số 25 có thể sử dụng hiệu quả cho MA