Luận văn Nghiên cứu xác định oxalat trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc

điện di mao quản loại Isco Mode1 3 140 Electropherograph (Isco Inc., Lincoln, NE, USA) hoạt động ở -20 kV và ở 28 °C với mao quản 75 cmx75 id (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ, USA) có chiều dài hiệu dụng là 50cm. Chất phân tích được phát hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật hấp thụ gián tiếp. Giữa mỗi lần phân tích mao quản được rửa trong 2 phút bằng dung dịch đệm chứa 10% methanol, 10 mM natri cromat tetrahydrate và 4 mM OFM Anion-BT. Giới hạn định lượng đạt được là 0,01g/100 g. Nghiên cứu này được áp dụng để xác định axit oxalic trong rau và một số loại đồ uống. Một nghiên cứu đáng tin cậy khác của Corinne Rivasseau [8] sử dụng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) với detector UV đã định lượng được axit citric, malic, succinic, oxalic, formic, fumaric, acetic, và phosphoric chứa trong thực vật với thời gian tích ngắn trong khi vẫn giữ độ phân giải tốt bằng cách tối ưu chiều dài mao quản, điện áp tách, thành phần và pH của dung dịch đệm. Quá trình phân tích được thực hiện trong một mao quản không tráng silica, chiều dài hiệu dụng 30cm, đảo ngược dòng điện di thẩm thấu và thế điện di là -30 kV. Dung dịch đệm chứa 3.10-4 mol/L tetradecyltrimethylammonium và 10- 2 mol/L trimellitate pH = 9,0. Quá trình tách đạt được trong 100s. Khoảng tuyến tính đối với oxalate từ 6.10- 5 đến 10- 3 mol/L. Phương pháp điện di mao quản Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường nhất định do thế (V) đặt vào hai đầu mao quản sinh ra. Cấu tạo của hệ điện di được cho trong hình 1.1 [1]. Hình 1.1 Sơ đồ phân tích hệ điện di mao quản Độ điện di, tốc độ điện di và thời gian điện di Trong điện di, tốc độ di chuyển của các hạt tích điện (v) tỉ lệ thuận với cường độ điện trường (E): v = μ. E (1.1) Trong đó: v: tốc độ di chuyển của ion μ: là độ diện di E: là điện trường ngoài Trong điều kiện tốc độ của dòng ổn định, lực tác động lên các tiểu phân tích điện từ phía điện trường ngoài và lực ma sát sẽ cân bằng: q.E= fe.v (1.2) Trong đó: q: là điện tích hạt nhân fe: là lực ma sát, fe = 6.π.η.r (η: là độ nhớt của dung dịch, r là bán kính ion) Từ các công thức trên có thể suy ra công thức tính độ linh động của ion như sau: μ = v/E = q/(6.π.η.r) (1.3) Như vậy độ linh động điện di tỉ lệ thuận với điện tích của ion chất phân tích và tỷ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch pha động điện di và độ lớn (bán kính hydrat r) của ion chất phân tích. Mao quản Mao quản là một bộ phận quan trọng trong phương pháp điện di mao quản. Đây chính là một trong các yếu tố quyết định sự điện di hỗn hợp của các chất mẫu. Mao quản được chế tạo chủ yếu là silica được gọi là mao quản silica. Trong một số trường hợp cũng có thể dùng mao quản teflon, khi mao quản silica không phù hợp, ví dụ mẫu có ion F- và tách ở pH thấp [1]. Hình 1.2 Mặt cắt ngang của mao quản Lớp điện kép trên thành mao quản và dòng điện di thẩm thấu Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế của chúng (thế Zêta) xuất hiện ở sát thành mao quản, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện di. Hình 1.3 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển cùng tốc độ với dòng EOF. Hình 1.4 Ảnh hưởng của dòng EOF đến tốc độ của các ion trong quá trình điện di Do vậy, để có được hiệu quả tách cao cần thiết phải tìm được điều kiện tối ưu và/hoặc sử dụng các biện pháp kiểm tra và khống chế (như thêm các chất hoạt hóa, thay đổi bề mặt mao quản,) sao cho dòng EOF có cường độ phù hợp với chất phân tích trong điều kiện nghiên cứu cụ thể. Dung dịch đệm pH và pha động trong phương pháp điện di mao quản Dung dịch đệm quyết định độ linh động điện di của các chất phân tích. Do yếu tố pH, loại dung dịch đệm mà trong đó, các ion và phân tử axit hay bazơ trong thành phần của dung dịch đệm góp phần tạo nên lực ion của chúng. Hơn nữa, chúng cũng ảnh hưởng đến độ tan, tốc độ phản ứng của các chất [1, 5]. Bảng 1.2. Các chất thường dùng làm pha động trong CE và giá trị pK của chúng Tên chất Giá trị pK Tên chất Giá trị pK Formate 3,75 Tricin 8,05 Acetate 4,76 Bicin 8,25 Citrate 3,12; 4,76; 6,40 Tris 8,30 MES 6,13 TAPS 8,40 ACES 6,75 Borat 9,14 MOPSO 6,79 CHES 9,55 BES 7,16 CAPS 10,40 MOPS 7,20 Phosphate 2,14; 7,10; 13,30 DIPSO 7,50 Histidine 1,78; 5,97; 8,97 HEPFS 7,51 Lysine 2,20; 8,90; 10,28 HEPPSO 7,9 Arginine 2,18; 9,09; 13,20 Nguồn điện thế cao Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều nhất định đặt vào hai đầu mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trường E và dòng điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Trong điện di mao quản, điện thế V một chiều thường được dùng để đặt vào hai đầu mao quản là từ 15 - 40 kV/1m, hay là từ 150 – 550 V/1cm mao quản. Tuy nhiên, thế V được dùng phải làm sao không cho dòng điện I quá lớn trong mao quản, dòng điện I này chỉ nên nằm trong vùng từ 10 – 75 µA. Việc chọn điện thế V là bao nhiêu tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích, chất nền của mẫu, giá trị pH của pha động điện di, [1]. Kỹ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản Trong điện di mao quản có ba phương pháp thường dùng nạp mẫu phân tích vào trong mao quản, bao gồm: Phương pháp thủy động lực học dùng áp suất Phương pháp thủy động lực học theo kiểu xiphông Phương pháp điện động học Hình 1.5 Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản * Kĩ thuật bơm mẫu kiểu thuỷ động học kiểu xiphông Trong kĩ thuật này, mẫu được bơm vào mao quản nhờ áp lực (hình 1.5 A, B). Khi đó, lượng mẫu bơm vào trong mao quản phụ thuộc vào áp lực sử dụng (áp suất, lực hút chân không hoặc chiều cao bơm mẫu) và thời gian bơm mẫu. Trong đó bơm mẫu theo nguyên lý xiphông (hình 1.5B): mẫu được dẫn vào mao quản nhờ chênh lệch độ cao giữa vị trí đặt lọ mẫu và vị trí đặt lọ đựng dung dịch đệm. Đây là giải pháp bơm mẫu đơn giản nhất, và được sử dụng cho các hệ điện di mao quản xách tay vận hành thủ công. * Kĩ thuật bơm mẫu kiểu điện động học Kĩ thuật này sử dụng lực điện khi áp thế cao (5 - 10 kV trong vài giây) để bơm mẫu vào mao quản (Hình 1.5 C). Phương pháp bơm mẫu này cho kết quả các pic phân tách có độ sắc nét cao. Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm rất lớn là diện tích pic (dùng để định lượng) có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khác nhau, do đó thường chỉ dùng để định tính [1, 2]. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE - C4D) Trong phương pháp điện di mao quản, detector đo độ dẫn là một trong những loại detector rất được chú ý, tuy có độ nhạy thấp hơn so với hai kĩ thuật điện hóa khác nhưng lại có ưu điểm là detector đa năng có thể dùng cho rất nhiều loại chất phân tích khác nhau. Detector này có thể thu nhỏ, thuận lợi khi kết hợp với các mao quản có đường kính hẹp, thậm chí với các microchip mà không ảnh hưởng đến độ nhạy và các tính chất khác của detector. Giới thiệu chung Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) với thiết kế hai điện cực đồng trục xuất hiện lần đầu trên thế giới vào năm 1998. Dựa trên thiết kế này, năm 2002 nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (khoa Hóa, trường đại học Basel, Thụy Sỹ) đã phát triển thành công dòng sản phẩm C4D với nguồn điện thế kích thích xoay chiều cao (HV-C4D, 200V). Hãng điện tử eDAQ của Úc sau đó đã phối hợp cùng nhóm nghiên cứu của GS.Peter Hauser để phát triển dòng sản phẩm C4D thương phẩm dựa trên nghiên cứu này [1]. Nguyên lý hoạt động C4D Nguyên lý hoạt động của C4D được minh họa trong hình 1.6. Hình 1.6 Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc Nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) được áp vào điện cực thứ nhất. Tại điện cực thứ hai, tín hiệu đo được ở dạng cường độ dòng điện (I). Theo đó, dòng điện thu được tại điện cực thứ 2 sẽ phụ thuộc vào độ lớn của điện thế V và tần số f. Hình 1.7 Sơ đồ biểu diễn cấu trúc (A) và mạch điện tương đương (B) của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc Tín hiệu đầu ra thu được ở dạng cường độ dòng điện (xoay chiều), sau đó sẽ được chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vôn thế (xoay chiều), thông qua việc sử dụng một điện trở khuếch đại (Rfeedback). Vôn thế xoay chiều sau đó được chuyển đổi thành vôn thế 1 chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa trước khi được hiển thị và lưu trữ trên máy tính. Như vậy, detector đo độ dẫn không tiếp xúc ngoài ưu điểm là phân tích đa năng còn có ưu điểm là không nhất thiết phải có sự tiếp xúc trực tiếp của các điện cực với dung dịch đo nhờ lợi dụng tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong mao quản hoặc ống phản ứng. Đây là một cách rất thông minh loại trừ ảnh hưởng của điện thế cao trong quá trình phân tách điện di đến hệ điện tử của detector và không làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM Mục tiêu và nội dung nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu xác định oxalate đồng thời với tartrate và citrate trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE – C4D). Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: Khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc xác định đồng thời oxalate, tartrate và citrate. Khảo sát thành phần dung dịch đệm điện di: thành phần, pH ứng với các nồng độ đệm khác nhau, các chất hoạt hóa bề mặt mao quản (nếu cần), Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị điện di: thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu, Khảo sát một số chất có thể gây ảnh hưởng đến việc xác định các chất phân tích trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp CE-C4D Đánh giá phương pháp nghiên cứu: Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). Đánh giá độ chụm, độ đúng của phương pháp phân tích. Áp dụng phân tích một sỗ mẫu thực tế như: bia lon, bia hơi, mì tôm gói, mẫu bia, mẫu trà túi lọc và mẫu trà vỉa hè. Phương pháp xử lý mẫu Các mẫu phân tích được lựa chọn gồm mẫu bia lon, bia chai, mỳ tôm dạng gói, trà túi lọc được mua tại các cửa hàng ở Hà Nội và nước trà vỉa hè tại khu vực Hoàn Kiếm Hà Nội. Các mẫu dạng lỏng (bia, nước trà khô vỉa hè) được lọc qua màng lọc 0,45µm, sau đó pha loãng với tỉ lệ thích hợp trước khi thực hiện phân tích trên thiết bị CE-C4D. Mẫu mì gói được nghiền nhỏ, trộn đều, cân một lượng nhất định trên cân phân tích (khoảng 0,5 g), thêm 4ml nước deion, rung siêu âm trong 30 phút, ly tâm (8000 rpm) trong 30 phút, lọc qua màng lọc 0,45µm, pha loãng với tỉ lệ thích hợp (nếu cần) rồi phân tích bằng thiết bị CE-C4D. Mẫu trà nhúng Lipton: Xác định khối lượng trung bình của một túi trà. Lựa chọn ngẫu nhiên 01 túi trà, ngâm 3 phút trong 150 ml nước deion đã đun sôi. Lọc qua màng lọc 0,45µm, pha loãng với tỷ lệ thích hợp và phân tích trên thiết bị CE-C4D. Hóa chất và thiết bị Hóa chất Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết phân tích (P.A.). Chất chuẩn Natri citrate (Fluka, 99%) Axit oxalic (Fluka, 99%) Axit tartaric (Fluka, 99%) Axit butyric (Fluka, 99%) Axit formic (Fluka, 99%) Axit clohydric (HCl) (Merck, Đức) Hóa chất dung môi Cetyl trimetylamoni bromine (Fluka, 99%) L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lượng > 99,5%) L- Histidine ( C6H9N3O2) ( Fluka, hàm lượng 99,5%) Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Fluka, 99%)-Tris Axit 2-(cyclohexylamino) ethanesunlfomic (Fluka, 99%) 2-(N-morphonlino)ethane sulfonic axit (Fluka, 99%) Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức) Methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức) Axit axetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức) Nước siêu tinh khiết: là nước cất hai lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 µm. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất Pha dung dịch chuẩn Các dung dịch chuẩn oxalate, tartrate và citrate được pha nước siêu tinh khiết có nồng độ ban đầu là 10-2M. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC. Pha dung dịch đệm Các dung dịch đệm điện di được cân và pha trực tiếp vào bình định mức bằng nước siêu tinh khiết. Tất cả các dung dịch đều được rung siêu âm và chuẩn lại giá trị pH trước khi sử dụng. Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày. Thiết bị dụng cụ Thiết bị Thiết bị phân tích sử dụng trong nghiên cứu là hệ CE-C4D tự chế, bán tự động (hình 2.1) được thiết kế lắp đặt với sự tài trợ của Công ty 3Sanalysis và đối tác tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Basel, Thụy sĩ. Hình 2.1 Hệ thiết bị điện di mao quản CE-C4D tự chế, bán tự động (1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D), 4: Bộ phận kết nối bán tự động, 5: Núm điều chỉnh, 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén) Bộ lọc nước đêion (Mỹ) Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521 Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH Cân phân tích của hãng S¢ientech (Mỹ), độ chính xác 0,1mg Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu Máy ly tâm LCEN-200 Dụng cụ Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, ống nghiệm, cốc thủy tinh Pipet pasteur với các cỡ khác nhau: 100; 1000 và 5000 µL và đầu tip tương ứng Các bình định mức nhựa polypropylen (PP) 25 và 100 mL được sử dụng để pha các dung dịch gốc của các chất phân tích và các dung dịch đệm Các lọ Falcon 15 mL, 45 mL và lọ polypropylen (PP) để đựng các dung dịch chuẩn Đầu lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 µm Các xylanh lọc để lọc mẫu Mao quản sử dụng là mao quản silica, chiều dài 60cm, đường kính trong (ID) là 75µm Các dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Đối với các quá trình sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 3 [3]. Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền. Thông thường, giá trị LOQ được xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 [3]. Độ chụm của phương pháp Độ lặp lại đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi tiến hành trên các mẫu thử giống hệt nhau, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm (cùng người phân tích, cùng trang thiết bị, phòng thí nghiệm, trong các khoảng thời gian ngắn) [4]. Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) Công thức tính độ lêch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) như sau [3]: (2.1) (2.2) Trong đó: - Si là diện tích của pic điện di thứ i - Stb là diện tích trung bình của n lần chạy - n là số lần chạy lặp (n =6) Độ đúng của phương pháp Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng cách xác định độ thu hồi [6, 10]. Độ thu hồi (H): (2.3) Trong đó: H: hiệu suất thu hồi (%) Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích thu được (tính theo đường chuẩn) Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính toán từ lượng chuẩn thêm vào CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện phân tích Khả năng tách, giới hạn phát hiện, cũng như thời gian phân tích của các chất là những tiêu chí quan trọng trong phương pháp điện di mao quản. Do đó, cần phải khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến các thông số này như: dung dịch đệm điện di (thành phần cấu tử đệm, pH và nồng độ đệm tương ứng, chất hoạt hóa bề mặt,), thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu,. Ngoài ra, một số thành phần trong nền mẫu thực có thể ảnh hưởng đến việc tách và xác định các chất phân tích cũng được khảo sát và tìm biện pháp khắc phục (nếu có ảnh hưởng). Khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm Khảo sát ảnh hưởng của thành phần cấu tử đệm Qua tham khảo tài liệu [15,29] và trên cơ sở các hóa chất sẵn có, các hệ đệm được lựa chọn để khảo sát gồm: His 50 mM - Ace (pH=6,1), Arg 10mM – Ace (pH=6), His 90mM - MES 90 mM và Tris 70mM -CHES 70mM. Kết quả khảo sát thành phần hệ đệm điện di được thể hiện trong Hình 3.1. Hình 3.1 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thành phần đệm đến sự phân tách của 1-oxalate 5,0.10-4 M, 2-citrate 1,0.10-3 M và 3-tartrate 1,0.10-3 M. Mao quản silica đường kính trong 75µm, chiều dài 60cm, chiều dài hiệu dụng 50cm, thế tách -15kV, thời gian bơm mẫy 20s, chiều cao bơm mẫu 20cm. Kết quả cho thấy các đệm Tris-CHES và Arg-Ace cho thời gian phân tích dài, tín hiệu các pic bị giãn rộng; đệm His-Ace cho kết quả thời gian di chuyển của các chất phân tích ngắn hơn nhưng tín hiệu nhiễu đường nền rất lớn. Trong khi đó, hệ đệm His-MES cho tín hiệu các chất phân tích thấp hơn nhưng thời gian phân tích ngắn hơn khá nhiều và tín hiệu đường nền tốt. Do đó, hệ đệm His-MES được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt Trong phương pháp điện di sử dụng mao quản silica, dòng điện di thẩm thấu (EOF) ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình phân tích, đặc biệt khi phân tích các anion ở pH cao. Trong nghiên cứu này, dù không thực hiện phân tích điện di ở pH cao nhưng dòng EOF cũng có ảnh hưởng nhất định khi di chuyển ngược chiều với các ion chất phân tích, làm cho thời gian di chuyển của chúng dài và giãn rộng pic. Để khắc phục điều này, chất hoạt động bề mặt dạng cation CTAB được thêm vào dung dịch đệm làm thay đổi dòng EOF, rút ngắn thời gian phân tích và làm cho các pic sắc nét hơn. Qua tham khảo tài liệu [26] và khảo sát sơ bộ CTAB ở nồng độ CTAB 25µM cho hiệu quả tốt nhất với hệ đệm His-MES. Kết quả phân tách các chất phân tích bằng phương pháp CE-C4D khi có sử dụng chất hoạt hóa bề mặt CTAB 25µM thể hiện trong hình 3.2. Hình 3.2 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa bề mặt CTAB (1-oxalate 5,0.10-5 M, 2-tartrate 1,0.10-4 M, 3-citrate 1,0.10-4 M. Dung dịch đệm điện di MES-His 50mM, pH = 6. Các điều kiện khác như ở hình 3.1) Như vậy, có thể thấy khi thêm CTAB 25µM vào dung dịch đệm điện di thì thời gian phân tích giảm rõ rệt, thời gian xuất hiện citrate từ gần 1200 giây xuống chỉ còn hơn 400 giây, tín hiệu pic tăng lên và sắc nét hơn rất nhiều. Kết quả diện tích pic và khả năng tách các chất phân phân tích tốt trong nền mẫu thực. Vì vậy, nồng độ CTAB 25µM được lựa chọn để thêm vào dung dịch đệm điện di, làm tăng hiệu quả phân tích cho các nghiên cứu tiếp theo. Khảo sát ảnh hưởng của pH Qua tham khảo tài liệu, ở khoảng giá trị pH = 6 cho kết quả tách tốt đối với các ion chất phân tích [17]. Do đó, khoảng pH khảo sát sẽ thay đổi xung quanh giá trị này. Việc khảo sát pH và nồng độ đệm được thực hiện bằng cách thay đổi tỷ lệ nồng độ của hai hợp phần trong hệ đệm là His và MES. Trong đó, nồng độ của His thay đổi trong khoảng 20mM đến 50mM và thay đổi nồng độ của MES để có các giá trị pH từ 5,8 đến 6,5. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.3. Hình 3.3 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của pH. 1-oxalate 5,0.10-4 M, 2-tartrate 5,0.10-4M, 3-citrate 5,0.10-4M và . Mao quản silica đường kính trong 75µm, chiều dài 60cm, chiều dài hiệu dụng 50cm, thế tách -15kV, thời gian bơm mẫu 20s, chiều cao bơm mẫu 20cm. Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của oxalate, tartrate và citrate Nồng Độ (mM) His-Mes pH Diện tích pic (mV.s) và thời gian di chuyển (s) Oxalate Tartrate citrate Spíc tdc Spíc tdc Spíc tdc 30-50 5,8 115,3 312,6 123,6 353,9 55,1 395,3 50-50 6,1 110,1 264,5 58,9 297,9 53,3 321,9 50-40 6,2 108,9 332,8 62,1 380,9 51,7 392,6 50-30 6,3 224,2 315,8 125,0 371,8 111,8 407,8 50-20 6,5 215,2 282,4 122,0 321,1 98,7 343,8 Kết quả thu được cho thấy, khi giá trị pH thay đổi từ 5,8 đến 6,5 thì thời gian di chuyển của các chất thay đổi không đáng kể nhưng diện tích pic và tín hiệu đường nền bị ảnh hưởng nhiều hơn. Ở pH = 6,3 (tương ứng thành phần đệm là His 50mM-MES 30mM) cho tỷ số tín hiệu so với nhiễu đường nền tốt nhất, diện tích pic và sự phân tách giữa các pic đảm bảo, thời gian phân tích hợp lý. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây [12]. Do đó, hệ đệm His 50mM-MES 30mM, pH = 6,3 được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu Trong quá trình nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu hay vùng mẫu nạp phải đủ lớn để đảm bảo đạt được độ nhạy tốt nhưng nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì sự phân tán (mở rộng vùng mẫu) sẽ xuất hiện do hiện tượng khuếch tán làm giảm hiệu suất tách. Vì vậy, thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu hợp lý cũng cần được khảo sát để đảm bảo thu được tín hiệu lớn nhất mà pic không bị giãn rộng. Việc khảo sát thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu được thực hiện theo phương pháp thủy động lực học kiểu xiphông với thời gian bơm mẫu từ 10s đến 40s và chiều cao bơm mẫu từ 10cm đến 30cm. Kết quả được thể hiện trong hình 3.4 và 3.5. Hình 3.4 Điện di đồ khảo sát thời gian bơm mẫu xác định điều kiện tối ưu xác định đồng thời 3 chất 1-oxalate 5,0.10-4 M, 2-citrate 5,0.10-4M và 3-tartrate 5,0.10-4M. Mao quản silica đường kính trong 75µm, chiều dài 60cm, chiều dài hiệu dụng 50cm, thế tách -15kV, chiều cao bơm mẫu 20cm. Hình 3.5 Điện di đồ khảo sát chiều cao bơm mẫu xác định điều kiện tối ưu xác định đồng thời 3 chất1-oxalate 5,0.10-4 M, 2-citrate 5,0.10-4M và 3-tartrate 5,0.10-4M. Mao quản silica đường kính trong 75µm, chiều dài 60cm, chiều dài hiệu dụng 50cm, thế tách -15kV, thời gian bơm mẫu 30s. Kết quả cho thấy, khi tăng thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu sẽ làm cho lượng mẫu đi vào mao quản nhiều hơn, cho tín hiệu các pic tăng lên tương ứng. Tuy nhiên, trên cơ sở khảo sát với nền mẫu mỳ tôm (mẫu có thể có thành phần nền phức tạp nhất trong các mẫu lựa chọn) cho thấy nếu thời gian bơm mẫu trên 30s và chiều cao bơm mẫu trên 25cm sẽ có thể xảy ra hiện tượng chen lấn pic của chất phân tích với các chất có trong nền mẫu thực. Vì vậy, thời gian bơm mẫu 30s và chiều cao bơm mẫu 25cm được lựa chọn là điều kiện tối ưu trong nghiên cứu này. Khảo sát ảnh hưởng của thế tách Quá trình điện di trong mao quản chỉ có thể xảy ra khi có nguồn thế một chiều nhất định đặt vào hai đầu mao quản. Thế này tạo ra lực điện trường trong mao quản để điều khiển, duy trì sự điện di và là một trong các yếu tố chính quyết định kết quả của sự điện di. Các thế tách được lựa chọn để khảo sát là: -10kV, -15kV, -18kV, -20kV. Kết quả được thể hiện trong hình 3.6. Hình 3.6 Điện di đồ khảo sát thế điện di xác định điều kiện tối ưu xác định đồng thời 3 chất 1-oxalate 5,0.10-4 M, 2-citrate 5,0.10-4M và 3-tartrate 5,0.10-4M. Mao quản silica đường kính trong 75µm, chiều dài 60cm, chiều dài hiệu dụng 50cm, chiều cao bơm mẫu 25cm, thời gian bơm mẫu 30s. Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế điện di đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của oxalate, tartrate và citrate Thế điện di (kV) Diện tích pic (mV.s) và thời gian di chuyển (s) Oxalate Tartrate citrate Spíc tdc Spíc tdc Spíc tdc -10 434,3 489,0 191,9 590,0 194,4 660,0 -15 260,1 318,0 121,0 371,0 113,4 408,0 -18 220,1 269,0 99,80 312,0 96,70 340,0 -20 192 243,0 79,30 280,0 77,60 305,0 Kết quả cho thấy, khi tăng thế áp vào hai đầu mao quản từ -10kV đến -20kV, thời gian phân tích giảm, khả năng tách giảm, tín hiệu nhiễu nền tăng lên. Tuy nhiên, khi thế tách thấp thì thời gian phân tích tăng lên, có thể làm giãn rộng pic. Do đó, thế tách được lựa chọn trong nghiên cứu này là -15kV để đảm bảo cho kết quả phân tích tốt nhất. Khảo sát các chất ảnh hưởng Các mẫu thực tế được lựa chọn có thể có các chất phụ gia, bảo quản thực phẩm như butyrate, formate, chloride. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các chất này đến việc xác định hàm lượng các chất oxalate, tartrate, citrate được thể hiện trong hình 3.7. Hình 3.7 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của butyrate, formate 7,0.10-5M, chloride 3,0.10-3M đến Oxalate, Citrate và Tartrate 1,0.10-5M. Các điều kiện phân tách khác như hình 3.6. Kết quả cho thấy chloride bắt đầu ảnh hưởng đến pic oxalate ở nồng độ 3,0.10-3M, formate bắt đầu ảnh hưởng đến pic tartrate ở nồng độ 7,0.10-5M và butyrate không ảnh hưởng đến các chất phân tích. Do đó, trong trường hợp các mẫu phân tích có hàm lượng các chất ảnh hưởng như chloride (nồng độ > 3,0.10-3M), formate (nồng độ > 7,0.10-5M) thì cần thiết phải pha loãng mẫu. Tuy nhiên, thực tế khảo sát đối với các nền mẫu lựa chọn cho thấy các chất này có nồng độ nhỏ hơn ngưỡng ảnh hưởng. Đá