Luận văn Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên tại quy trình sản xuất vắcxin cúm

n ra châu Á làm chết khoảng 700.000 người. Chủng vi rút cúm A (A/H3N2) sau khi gây đại dịch thì giảm dần độc lực và trở thành một chủng cúm mùa hiện nay. Năm 2011, Trung Tâm Kiểm. Soát và Phòng Ngừa Dịch Bệnh (CDC, Mỹ) thông báo về 300 ca bệnh do một biến chủng vi rút cúm A (A/H3N2) hình thành từ sự tổ hợp di truyền giữa vi rút cúm A (A/H3N2) ở lợn với vi rút cúm A (A/H1N1) (10-16). Tuy nhiên, vi rút cúm A (A/H3N2) không thấy truyền trực tiếp từ người sang người. Tất cả các bệnh nhân đều tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với lợn. Tại Việt Nam hội chứng cúm (Influenza like illness ILI) là một trong 26 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc cao nhất trong các bệnh truyền nhiễm gây dịch ở nước ta. Từ năm 2006 đến nay, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương đã triển khai hệ thống giám sát cúm trọng điểm để phát hiện và xác định các chủng vi rút cúm gây bệnh hàng năm ở 15 điểm trên toàn quốc. Bảng 1.3. Báo cáo tổng kết giám sát cúm mùa năm 2014 [3] n (%) Tháng 1 Tháng 2 Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 Tháng 6 Tháng 7 Tháng 8 Tháng 9 Tháng 10 Tháng 11 Tháng 12 Năm 2014 Tổng số mẫu XN 146 124 154 178 177 220 144 205 302 332 258 220 2460 Tổng số (+) với vi rút cúm 42 (28.8) 37 (29.8) 43 (27.9) 73 (41) 71 (40.1) 54 (24.5 19 (13.2) 19 (9.3) 54 (17.9) 62 (18.7) 37 (14.3) 31 (14.1) 542 (22.0) Phân tuýp vi rút cúm B 18 (42.9) 21 (56.8) 14 (32.6) 31 (42.5) 31 (43.7) 13 (24.1) 12 (63.2) 14 (73.7) 48 (88.9) 60 (96.8) 29 (78.4) 23 (74.2) 314 (57.9) A/H3N2 19 (45.2) 3 (8.1) 4 (9.3) 24 (32.9) 37 (52.1) 41 (75.9) 6 (31.6) 5 (26.3) 6 (11.1) 2 (3.2) 5 (13.5) 4 12.9) 156 (28.8) A/H1N1 9 đại dịch 5 (11.9) 13 (35.1) 23 53.5) 18 (24.7) 3 (4.2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (8.1) 4 (12.9) 169 (12.7) A/H5N1 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) A/H7N9 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Ðồng nhiễm nhiều loại VR cúm 0 (0) 0 (0) 2 (4.7) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (5.3) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (0.6) 1.8. Sinh bệnh học Nhiễm trùng gây ra bởi vi rút cúm đầu tiên là viêm đường hô hấp trên. Vi rút phát triển trên tế bào biểu mô đường hô hấp và phá hủy nhung mao, nơi được coi là hàng rào bảo vệ đầu tiên, quan trọng của cơ thể trong hệ thống hô hấp. Kèm theo sự nhân lên của vi rút, interferon được phát hiện trong giai đoạn cấp tình của bệnh trong một thời gian ngắn là nguyên nhân của sự nguy hiểm do nhiễm vi rút cúm. Nhiễm trùng gây ra bởi vi rút cúm A thường để lại những dấu hiệu sinh bệnh học tại đường hô hấp dưới. Các chứng viêm thanh quản, khí quản, phế quản cấp xuất hiện cùng các triệu chứng viêm long đường hô hấp và phù nề. Nhiễm trùng gây ra bởi vi rút cúm A/H5N1 bao gồm triệu chứng máu khó đông, thăn hư, tan hạch bạch huyết và tổn trương phổi. Nhiễm trùng đường hô hấp dưới trên nền viêm phổi cấp có tỷ lệ tử vong cao. Viêm phổi thường là tình trạng bội nhiễm vi khuẩn như Streptococcus pneumonia, Staphyloccus aureus và Hemophilus influenza, trong đó Staphyloccus aureus là nguyên nhân thường gặp và rất nguy hiểm, gây nên suy hô hấp, thiếu oxy và diễn biến nặng sau 2-3 ngày sau khi nhiễm bệnh. 1.9. Vắcxin cúm Vi rút là tác nhân gây bệnh cúm. Miễn dịch ngừa cúm là phương pháp căn bản để kiểm soát cúm ở mức độ cá nhân và cộng đồng. Vắcxin cúm được phát triển và được cấp phép sử dụng ở người dưới dạng vi rút sống giảm độc lực và vi rút bất hoạt. Các phương pháp chủng ngừa cúm có chung mục tiêu là kích thích miễn dịch đối với hemagglutinin (HA) và có thể đối với neuraminidase (NA), do đó thành phần của vắcxin cúm thường xuyên được thay đổi sao cho tương thích nhất với chủng vi rút đang lưu hành đã được tiên lượng trước. Vai trò kích thích các đáp ứng miễn dịch khác của vắcxin trong phòng ngừa bệnh vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Vắcxin cúm an toàn, hiệu quả, và được TCYTTG khuyến cáo sử dụng cho phụ nữ có thai, trẻ từ 6 đến 59 tháng tuổi, người già, người đang mắc bệnh “đặc biệt”, và cán bộ y tế. Thành phần của vắcxin thay đổi phản ánh tiến hóa không ngừng của vi rút cúm. Từ năm 1977, vắcxin cúm đã chứa các thành phần kháng nguyên đại diện cho cúm A/H3N2, A/H1N1, và cúm B, gọi là vắcxin ngừa cúm 3-valent (TIV: trivalent influenza vaccine). Từ năm 2004, hai dòng vi rút cúm B khác biệt về bản chất kháng nguyên đã đồng thời lưu hành, dòng Victoria và dòng Yamagata. Do đó, vắcxin cúm TIV được bổ sung thêm hai kháng nguyên của cúm B-Victoria và cúm B-Yamagata đã được cấp phép sử dụng ở Mỹ từ năm 2012, vắcxin này được gọi là vắcxin ngừa cúm 4-valent [45]. Nuôi cấy vi rút dựa trên trứng gà là phương pháp được ưa chuộng trong sản xuất vắcxin sống và vắcxin bất hoạt hàng thập kỷ qua. Tuy nhiên, phương pháp này có một số bất cập như hạn chế về: nguồn cung cấp trứng, khả năng mở rộng quy mô sản xuất, lựa chọn chủng vi rút cúm thích hợp với môi trường nuôi cấy trứng có thể làm thay đổi bản chất kháng nguyên so với chủng hoang dại. Do đó, các phương pháp sản xuất vắcxin đã được tìm hiểu nghiên cứu áp dụng như hệ thống nuôi cấy tế bào động vật có vú, tế bào côn trùng, và tế bào thực vật. Năm 1943, vắcxin cúm đầu tiên được thử nghiệm thành công trong lâm sàng ở Mỹ và được cấp phép sử dụng năm 1945. Vắcxin là vi rút cúm được lấy từ túi niệu của trứng gà có phôi, rồi bất hoạt bằng formalin. Chế phẩm tương đối thô này thường gây phản ứng cục bộ hoặc phản ứng toàn thân nhưng đạt 70% hiệu quả ngừa cúm A (A/H1N1) [62]. Các nhà sản xuất vắcxin đã nắm bắt những tiến bộ của công nghệ đang nổi lên trong sản xuất, nhu cầu sử dụng vắcxin ngày càng gia tăng, đa dạng về kiểu loại vắcxin, và một số tiến bộ về hiệu quả ngừa cúm sau khi dùng vắcxin, nhiều loại vắcxin đã được phép đưa ra thị trường cho các nhóm tuổi khác nhau (như vắcxin tiêm trong cơ, tiêm trong da, vắcxin xịt mũi, vắcxin liều đơn, vắcxin đa liều, vắcxin 0.5 mL, vắcxin 0.25 mL). Chỉ riêng ở Mỹ có 9 vắcxin cúm dạng bất hoạt do 6 nhà sản xuất cung cấp trong năm 2012 – 2013 [8]. [11]. Xây dựng một cơ sở sản xuất vắcxin cúm dạng bất hoạt dựa trên tế bào trứng có phôi hoặc dựa trên nuôi tế bào kéo dài ít nhất 4-5 năm, nhưng có thể ngắn hơn đối với sản xuất vắcxin cúm giảm độc lực dựa trên trứng có phôi. [19]. Sản xuất vắcxin cúm đã tăng gấp đôi trong thập kỷ đầu tiên của thế kỷ 21 với hơn 450 triệu liều trong năm 2009 [11]. Tuy nhiên, 75% số liều vắcxin này chỉ dùng ở 12 nước Bắc Mỹ và châu Âu, 25% còn lại được chuyển đến Tây Thái Bình Dương chủ yếu cho Nhật Bản và Australia. Sử dụng vắcxin cúm ở các nước đang phát triển rất hạn chế [39]. Hiệu quả sản xuất vắcxin cúm phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong những yếu tố quan trọng nhất là chủng vi rút được sử dụng. Chủng vi rút này sẽ quyết định số liều được tạo ra. Chủng vi rút cúm A hoang dại thường có đặc điểm tăng trưởng chậm, nên từ những năm đầu 1970 kỹ thuật HGRs (high growth reassortants) đã được phát triển nhằm tăng hiệu quả của chủng vi rút giống. Sự sắp xếp lại di truyền sẽ tạo dòng vi rút cúm mang gen mã hóa protein bề mặt HA và NA của các chủng vi rút kiểu dại và một trong 6 gene của một vi rút có tốc độ mọc nhanh (ví dụ như gen A/PR/8/34 ở vi rút cúm A hoặc gene B/Lee/40 hoặc gene B/Panama/45/90 ở vi rút cúm B). Các gene này được tái tổ hợp bằng cách đồng thời gây nhiễm cho trứng vi rút cúm kiểu dại và vi rút PR8 hoặc vi rút B/Lee khi có mặt kháng huyết thanh chống lại protein bề mặt của vi rút PR8 hoặc vi rút B/Lee. Sau đó, chọn dòng vi rút cúm tái tổ hợp dựa trên đặc điểm mọc nhanh so với các vi rút mọc chậm hơn [31]. Các hạt vi rút thường mọc ở các tốc độ khác nhau, bao gồm cả các chủng vi rút tạo bằng kỹ thuật HGR. Do đó, thành phần kháng nguyên của các hạt vi rút có thể thay đổi lớn phụ thuộc vào đặc điểm mọc của chủng vi rút. Để đảm bảo mỗi liều vắcxin chứa tối thiểu 15 µg HA, cần một thử nghiệm nhằm chuẩn hóa nồng độ HA trong vắcxin. Cuối những năm 1970, thử nghiệm SIRD (the single radial immuno Diffusion) đã được phát triển để đánh giá vắcxin cúm. SRID đã được xác lập vào năm 1979 sau thử nghiệm lâm sàng vắcxin ở Mỹ và Anh lần đầu tiên chứng minh rằng hàm lượng kháng nguyên HA của vắcxin cúm bất hoạt được xác định bởi SRID tương quan tốt với tính sinh miễn dịch của vắcxin. SRID phụ thuộc vào kháng huyết thanh và kháng nguyên chuẩn độ tiêu chuẩn cúa mỗi thành phần vắcxin. Các kháng huyết thanh này được cung cấp toàn cầu từ bốn phòng thí nghiệm chịu trách nhiệm điều tiết phát triển vắcxin của thế giới [49]. Sự phát triển của vắcxin cúm đạt được dựa trên nhiều yếu tố và được thúc đẩy từ nhu cầu nâng cao chất lượng vắcxin về hiệu quả, độ an toàn cũng như sự phong phú về kiểu loại, làm tăng nhu cầu sử dụng vắcxin, đặc biệt trong thập kỷ đầu tiên của thế kỷ 21, và nỗ lực để nâng cao năng lực sản xuất. Tuy nhiên, vắcxin chiếm lĩnh thị trường vắcxin cúm hiện vẫn là vắcxin giảm độc lực nuôi cấy dựa trên tế bào trứng gà có phôi [11, 34]. Khi nguồn trứng gà vẫn được ổn định và chất lượng tốt thì vắcxin cúm dựa trên tế bào trứng gà có phôi vẫn là một sản phẩm thương mại rất cạnh tranh trong một vài năm tới. Hiện nay có 5 vắcxin cúm giảm độc lực nuôi cấy dựa trên trứng gà có mặt trên thị trường vắcxin, một loại sản xuất ở Nga [27] và 4 loại sản xuất ở một số quốc gia châu Mỹ, châu Âu, châu Á, và Trung Đông [5]. Hơn 100 triệu người lớn và trẻ em đã được ngừa cúm bằng vắcxin của Nga trong hơn 30 năm qua. Cả hai chủng vắcxin cúm này đều có nguồn gốc từ các chủng vi rút giảm độc lực thích nghi tốt ở nhiệt độ 250C nhưng hạn chế mọc ở nhiệt độ 37-390C. Do đó, các chủng vi rút này nhân lên ở đường hô hấp trên nhưng không nhân lên ở đường hô hấp dưới. Chủng cho ở vắcxin Nga là A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) và B/USSR/60/69, ở vắcxin Mỹ là A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) và B/Ann Arbor/1/66. Sản xuất vắcxin giảm độc lực dựa trên nuôi cấy dòng tế bào liên tục gặp nhiều nhiều thách thức và đang được một số nhóm nghiên cứu phát triển. Hiện nay trên thị trường có khoảng 110 loại vắcxin cúm bất hoạt và 5 loại vắcxin cúm giảm độc lực. Các loại vắcxin giảm độc lực dùng đường xịt mũi, còn các loại vắcxin bất hoạt dùng đường tiêm [6] Việt Nam đã có nhiều cách tiếp cận khác nhau trong nghiên cứu sản xuất vắcxin cúm như tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), trên trứng gà có phôi (IVAC), trên tế bào Vero (Viện Pasteur TP. HCM), trong đó VABIOTECH đã hoàn thành 3 đợt thử nghiệm lâm sàng và kết quả cho thấy vắcxin cúm A/H5N1 do VABIOTECH sản xuất là an toàn trên người tình nguyện. Các chỉ số sinh hóa học ở những người tình nguyện sau tiêm vắcxin là bình thường. Vắcxin A/H5N1 sản xuất trên dây truyền công nghệ đã nghiên cứu cho kết quả đáp ứng tốt ở tất cả các đối tượng được tiêm từ liều 7,5µg trở lên và đáp ứng tiêu chuẩn của châu Âu. Từ những kinh nghiệm có sẵn trong sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 VABIOTECH cũng đã xây dựng được một quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 có tính ổn định và hiệu suất cao. Người Việt Nam sẽ được sử dụng vắcxin cúm do Việt Nam sản xuất trong một ngày không xa. 1.10. Một số dạng vắcxin cúm Hiện nay có nhiều cách tiếp cận công nghệ khác nhau để sản xuất vắcxin cúm và cũng có nhiều loại vắcxin cúm khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ thuật sử dụng: Vắcxin toàn tế bào (vi rút toàn phần) Chủng sản xuất được nuôi cấy trên trứng gà có phôi với nhiệt độ dao động từ 35-37oC tùy thuộc vào từng chủng, sau đó được làm lạnh ở 4oC và gặt nước niệu đệm từ những trứng phôi còn sống. Nhiều nhà sản xuất bất hoạt vi rút sau khi ly tâm nhưng cũng có một số quy trình bất hoạt vi rút ở bước cuối cùng. Hóa chất thường được sử dụng để bất hoạt vi rút là formaldehyde và β- propiolactone. Tiếp theo, vi rút được tinh khiết bằng sắc ký cột hoặc siêu ly tâm phân vùng. Vắcxin hạt vi rút vỡ (split vaccine) Tiếp theo quá trình tinh khiết như trên, vi rút được xử lý bằng chất tẩy hoặc dung môi như diethyl ether, tween 80, triton X100 và ammonium deoxycholate để phá vỡ màng lipit. Một số quy trình tiếp tục các bước loại bỏ chất tẩy bằng cách siêu ly tâm, phân tách phase, thẩm tích Vắcxin tiểu đơn vị (subunit vaccine) Quy trình sản xuất sử dụng chất tẩy như SDS, triton N101, enzyme bromelain để phân tách hai thành phần kháng nguyên HA và NA. Vi rút tinh khiết bằng siêu ly tâm phân vùng trong sucrose được tiếp tục chạy qua lớp gradient sucrose khác có chứa triton N101 để phân tách HA và NA. Vắcxin bất hoạt sản xuất trên tế bào Hầu hết các vắcxin cúm thông thường đều sản xuất trên trứng gà có phôi. Tuy nhiên đã có một số nghiên cứu phát triển văc xin trên các dòng tế bào Vero, BHK-21, MDCK và PMKC. Các quy trình này đều cố gắng phát triển vắcxin tế bào sử dụng công nghệ nuôi cấy trên micro carrier. Vắcxin tái tổ hợp và hấp phụ Kháng nguyên HA của vi rút cúm được biểu thị trên tế bào côn trùng bằng baculovi rút tái tổ hợp. Toàn bộ dòng cDNA của đoạn gen HA được cài đặt vào hệ thống đó và HA tái tổ hợp được tinh khiết trong điều kiện không làm biến tính cho độ tinh khiết đạt 95%. Một số tá chất đã được nghiên cứu để bổ sung vào thành phần vắcxin làm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch cũng như làm giảm hàm lượng kháng nguyên như: nhôm, MF59, AS02, AS03. Vắcxin sống giảm độc lực Vắcxin sống cũng được sản xuất trên trứng gà có phôi giống như vắcxin bất hoạt. Điểm khác biệt chủ yếu là vắcxin này không được bất hoạt do vậy cần đảm bảo không có các yếu tố ngoại lai. Điều lưu ý là vắcxin này không cần phải có tinh khiết cao vì sử dụng theo đường mũi nhưng thử nghiệm an toàn phải xác định không có các yếu tố ngoại lai. Vắcxin này thường ở dạng đông khô để tăng tính ổn định. Vắcxin giảm độc lực thích ứng lạnh cũng đã được Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ (FDA) cấp phép lưu hành. Vi rút cúm được giảm độc lực bằng cách cấy truyền trên tế bào (tế bào thận gà) và trên trứng gà có phôi ở nhiệt độ 25oC. 1.11. Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm Kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm - Từng mẻ gặt đơn chứa vi rút cần được chuẩn độ hiệu vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) hoặc tạo đám hoại tử (PFU) tùy từng chủng cúm và từng hãng sản xuất. - Nhận dạng: Xác định các kháng nguyên đặc hiệu bằng phản ứng khuyếch tán miễn dịch hoặc ứng chế ngưng kết hồng cầu sử dụng các kháng thể đặc hiệu. - Xác định hàm lượng kháng nguyên HA: Hàm lượng kháng nguyên HA trong bán thành phẩm và bán thành phẩm cuối cùng được xác định bằng phương pháp miễn dịch khuyếch tán vòng tròn đơn (SRID). Nếu là vắcxin cúm có chất hấp phụ, thử nghiệm xác định hàm lượng kháng nguyên HA phải tiến hành trước khi bổ sung chất hấp phụ. - Thử nghiệm về các nguyên liệu tồn dư: các nhà sản xuất phải chứng minh các nguyên liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua quá trình tinh chế bằng phương pháp chạy SDS-PAGE nhưng vấn phải giữ nguyên đặc tính kháng nguyên bằng phương pháp kính hiển vi điện tử. - Hàm lượng Protein tổng số được xác định bằng phương pháp Lorry. Hàm lượng Protein tổng số không được vượt quá 6 lần hàm lượng kháng nguyên HA. Đối với vắcxin cúm mùa hiện nay, theo quy định hàm lượng Protein tổng số không được vượt quá 100µg cho một chủng vi rút cho một liều tiêm cho người và tổng số ba chủng không vượt quá 300 µg cho một liều tiêm cho người. Kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin thành phẩm - Thử nghiệm nhận dạng: Thử nghiệm nhận dạng được thực hiện với ít nhất 1 lọ cho mỗi loạt vắcxin. - Hàm lượng kháng nguyên HA: Yêu cầu hàm lượng kháng nguyên HA đối với cúm mùa hiện nay là 15 µg/chủng/liều tiêm . - Thử nghiệm an toàn chung: Mỗi loạt thành phẩm đều phải thử nghiệm về độc tính không mong muốn (độc tính bất thường) sử nghiệm các thử nghiệm an toàn chung trên chuột lang và chuột nhắt trằng theo yêu cầu của Kiểm định Quốc gia. - Thử nghiệm chất gây sốt: Mỗi loạt thành phẩm đều phải thử nghiệm về chất gây sốt trên thỏ trưởng thành theo tiêu chuẩn của Kiểm định Quốc gia. - Thử nghiệm công hiệu: Mỗi loạt thành phẩm đều phải đánh giá đáp ứng miễn dich trên chuột và khỉ theo tiêu chuẩn của Kiểm định Quốc gia. Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Tế bào Tế bào thận chó thường trực (Madin- Darby Canine Kidney): MDCK (London – Anh) 2.1.2. Mẫu thử nghiệm Mẫu nước nổi sau gặt vi rút trong quy trình sản xuất vắc xin cúm. Mẫu bán thành phẩm trong quy trình sản xuất vắc xin cúm. 2.1.3. Môi trường và hóa chất * Môi trường và hóa chất sử dụng trong phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm (CCID50) Tên môi trường hóa chất Hãng sản xuất MEM GIBCO DMEM GIBCO LH3E VABIOTECH HANK’S VABIOTECH Trypsin- EDTA SIGMA Trypsin đã xử lý TPCK SIGMA Fetal Bovine Serum ( FBS) SIGMA * Môi trường và hóa chất sử dụng trong phương pháp chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu Hồng cầu gà VABIOTECH Dung dịch alsever VABIOTECH Dung dịch đệm phốt phát ( PBS) pH 7,4 VABIOTECH Mẫu chứng dương VABIOTECH * Môi trường và hóa chất sử dụng trong phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID Kháng nguyên chuẩn NIBSC Kháng huyết thanh khỉ VABIOTECH PBS SIGMA Zwittergent 10% VABIOTECH Agarose 1% VABIOTECH Dung dịch nhuộm màu VABIOTECH Dung dịch tẩy mầu VABIOTECH * Môi trường và hóa chất sử dụng trong phương pháp định lượng Protein tổng số Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml VABIOTECH Natri hydroxyt (NaOH) VABIOTECH Natri cacbonat (Na2CO3) VABIOTECH Dung dịch đồng sulfat (CuSO4) 2% VABIOTECH Dung dịch Tricloacetic acid (TCA) 5% VABIOTECH Dung dịch Tricloacetic acid (TCA) 10% VABIOTECH Thuốc thử Folin SIGMA * Môi trường và hóa chất sử dụng trong phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE Acrylamide GIBCO N,N’ Methylenebisacrylamide GIBCO Tris base BIORAD Sodium dodecylsulfate (SDS) BIORAD Glycine BIORAD Axit HCl TRUNG QUỐC Ammonium persulfate (APS) BIORAD TEMED (N,N,N,N’-Tetramethylenediamine) BIORAD Methanol 99% TRUNG QUỐC Axit acetic 99% TRUNG QUỐC Coomassie Brilliant Blue R-250 BIORAD Dung dịch oxi hóa (oxidizer) BIORAD Dung dịch nhuộm bạc (silver reagent) BIORAD Dung dịch hiện màu (deverloper) BIORAD Trọng lượng phân tử protein chuẩn (Marker) SIGMA * Môi trường và hóa chất sử dụng trong phương pháp kính hiển vi điện tử Glutaraldehyte 1% NIHE Cacodylate 0.1M pH 7,2 NIHE Photphotungstic acid (PTA) 0,25% NIHE 2.1.4. Trang thiết bị và dụng cụ * Trang thiết bị Buồng cấy an toàn sinh học SANYO Tủ ấm CO2 SANYO Kính hiển vi lộn ngược OLYMPUS Kính hiển vi điện tử truyền qua -TEM NHẬT BẢN Máy lắc STUART Máy quang phổ GBC Máy ly tâm EPPENDORF Nồi cách thủy MEMMERT Tủ ấm MEMMERT Máy trộn OSI (PHÁP) Bộ chạy điện di BIORAB Pipet aid EPPENDORF Pipetman EPPENDORF Pipet nhiều kênh EPPENDORF Và một số trang thiết bị khác * Dụng cụ Phiến nhựa nuôi cấy tế bào 96 giếng đáy bằng CORNING Phiến nhựa vi lượng 96 giếng đáy chữ U NUNC Phiến thủy tinh (120mm´120mm´20mm) VIỆT NAM Phiến nhựa có khoét lỗ NHẬT Khuôn và dụng cụ đục lỗ 4mm NHẬT Pipet dùng 1 lần các loại COSTA Đầu côn vô trùng các loại NUNC Và các dụng cụ cần thiết khác 2.2. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) 2.2.1.1. Pha môi trường * Môi trường MEM Công thức pha môi trường MEM Bảng 2.1. Công thức pha môi trường MEM STT Hóa chất Đơn vị Công thức pha 1 lít 1 MEM g 13,4 2 NaHCO3 g 0,5 3 L- Glutamin g 0,292 4 Kanamycin g 0,1 5 Fungizone ml 1 6 Nước cất pha tiêm vừa đủ ml 1000 * Môi trường DMEM Công thức pha môi trường DMEM Bảng 2.2. Công thức pha môi trường DMEM STT Hóa chất Đơn vị Công thức pha 1 lít 1 DMEM g 13,4 2 NaHCO3 g 0,5 3 L- Glutamin g 0,292 4 Kanamycin g 0,1 5 Fungizone ml 1 6 Nước cất pha tiêm vừa đủ ml 1000 * Môi trường LH3E Công thức pha môi trường LH3E Bảng 2.3. Công thức pha môi trường LH3E STT Tên hóa chất Đơn vị Công thức pha 1 lít 1 NaH2PO4 g 0,061 2 MgSO4 g 0,0485 3 CaCl2.2H2O g 0,133 4 NaCl g 3,4,0 5 KCl g 0,2, 6 Glucose g 3,5 7 Lactalbumin hydrolyzate g 2,5 8 MEM g 4,8 9 Đỏ phenol ml 0,5 10 NaHCO3 g 1,4 11 Nước cất pha tiêm vừa đủ lít 1,0 2.2.1.2. Chuẩn bị tế bào MDCK Soi chai tế bào MDCK trên kính hiển vi, tế bào phải kín một lớp. Hút bỏ hết nước nổi trong chai tế bào. Cho Hanks vào chai tế bào, láng đều cho sạch hết tế bào chết rồi hút bỏ hết nước nổi. Cho Trypsin-EDTA vào chai tế bào, để 36 ± 1oC/ 3-5 phút cho tế bào bong ra. Cho môi trường MEM 10% FBS/chai tế bào đã tách, trộn đều bằng pipet. Bổ sung môi trường MEM 10% FBS vào chai tế bào, trộn đều. Chia hỗn dịch tế bào vào phiến 96 giếng, 100ml/ giếng. Nuôi cấy phiến tế bào ở 37 oC, CO2 5% trong 2 ngày. Soi tế bào trên kính hiển vi hàng ngày. 2.2.1.3. Gây nhiễm vi rút trên tế bào MDCK Pha loãng mẫu thử theo cấp 10 từ 10-1 đến 10-8 Rửa các giếng tế bào bằng 100ml Hank’s Gây nhiễm 100ml các nồng độ pha loãng mẫu thử vào các giếng khác nhau trên phiến, mỗi nồng độ pha loãng 4 giếng. Làm song song 4 giếng chứng âm bằng cách thay thế mẫu thử bằng dung dịch Hank’s. Ủ phiến tế bào trong tủ ấm ở các nhiệt độ 32°C và 37 oC- 5% CO2 trong 1 giờ. Sau 1 giờ hút hết hỗn dịch vi rút trong các giếng. Cho 100ml các môi trường duy trì có bổ sung Trypsin đã xử lý TPCK vào mỗi giếng. Sử dụng 3 loại môi trường duy trì MEM, DMEM và LH3E ở từng phiến tế bào. Nuôi cấy phiến tế bào ở các nhiệt độ 32°C và 37°C, CO2 5% trong 3, 4 và 5 ngày. Lặp lại các thử nghiệm trên 3 lần. 2.2.1.4. Đọc kết quả Soi kính hiển vi xác định các giếng có sự hủy hoại tế bào (CPE) Tiêu chuẩn chấp thuận: + Hàng tế bào chứng mọc đẹp, không có huỷ hoại + Mức độ huỷ hoại tế bào giảm dần theo mức độ pha loãng mẫu thử Công thức: N = A – 50% A - B Trong đó: N: Khoảng cách 50% CCID50 A: Tỉ lệ % (+) trên 50% B: Tỉ lệ % (+) dưới 50% CCID50 = (Log A + N ) x 10 - So sánh hình ảnh trên kính hiển vi điện tử và kết quả CCID50 các mẫu thử nuôi cấy ở các điều kiện: + Nhiệt độ: 32oC và 37oC + Môi trường duy trì: MEM, DMEM và LH3E + Thời gian nuôi cấy: 3, 4 và 5 ngày. 2.2.2. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu [47] Nguyên lý Hiệu giá kháng nguyên HA của mẫu thử được xác định qua khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Chuẩn bị dung dịch hồng cầu gà 0,5% Dùng bơm tiêm lấy 3 ml máu gà vào ống ly tâm đã có sẵn 5ml dung dịch chống đông Alsever. Rửa hồng cầu gà 3 lần trong PBS 0,01M, ly tâm 2000 vòng/ phút, trong 5 phút, loại bỏ nước nổi. Cặn hồng cầu gà pha thành 0,5% trong PBS 0,01M. Các bước tiến hành: sử dụng phiến 96 giếng đáy chữ U Pha loãng mẫu thử nghiệm bậc hai trong các giếng trên phiến nhựa bằng dung dịch đệm PBS 0,01M từ nồng độ 2-1 đến 2-12 (có thể pha loãng với nồng độ thấp hơn tùy thuộc vào hiệu giá HA của mẫu thử), thể tích mỗi giếng là 50ml. Bổ sung vào tất cả các giếng, mỗi giếng 50ml dung dịch hồng cầu gà 0,5%. Song song với các mẫu thử nghiệm tiến hành làm các mẫu chứng dương và chứng âm bằng cách thay thế thành phần mẫu thử nghiệm bằng chứng dương và thay thế thành phần mẫu thử nghiệm bằng dung dịch đệm PBS (chứng âm). Lắc nhẹ phiến. Để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút. Kết quả Trước tiên đọc các giếng chứng. Chứng âm phải không có ngưng kết hồng cầu, chứng dương đúng như hiệu giá đã biết. Độ pha loãng cao nhất của kháng nguyên còn gây ngưng kết hồng cầu với một đơn vị, giá trị nghịch đảo của độ pha loãng đó là hiệu giá kháng nguyên (HAU). 2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID [47]. Nguyên tắc Hàm lượng kháng nguyên HA được xác định qua phản ứng ngưng kết miễn dịch khuyếch tán đơn (SRID). Các bước tiến hành Chuẩn bị 2 phiến thạch miễn dịch giống hệt nhau: được tiến hành trên bàn thăng bằng. Một cặp phiến SRID (13ml agarose 1%) có thể làm được 3 mẫu thử nghiệm và 1 mẫu kháng nguyên chuẩn. Làm tan chảy dung dịch agarose 1%, giữ trong bể ủ nhiệt 56oC trong ít nhất 30 phút. Chuẩn bị 2 phiến thủy tinh, lau sạch bề mặt bằng agarose 1%. Đặt khuôn thủy tinh khoét lỗ đường kính 90 nm lên trên và hàn kín khe hở bằng agarose 1%, giữ trong 5 phút. Pha loãng kháng huyết thanh chuẩn 10 lần bằng dung dịch PBS 0,01M. Trộn đều, tránh tạo bọt 150µl kháng huyết thanh chuẩn đã pha loãng ở trên vào 13ml agarose 1%. Đổ vào khuôn đang được đặt trên mặt bàn thăng bằng, Sau khi agarose đông (khoảng 30 phút), đục các giếng đường kính 4mm trên bề mặt agarose. Chuẩn bị kháng nguyên Đánh dấu các ống eppendorf 1,5 ml để pha loãng kháng nguyên chuẩn và mẫu thử nghiệm. Pha loãng kháng nguyên chuẩn và các mẫu thử bằng dung dịch PBS 0,01M sao cho nồng độ kháng nguyên HA đạt khoảng 50µl/ml. Xử lý các mẫu thử nghiệm và kháng nguyên chuẩn đã pha loãng bằng dung dịch Zwittergent 10% (450µl mẫu và 50 µl Zwittergent 10%). Trộn đều, ủ ở nhiệt độ 20-25oC trong 30 phút. Tiếp tục pha loãng các mẫu đã xử lý với Zwittergent ở trên bằng dung dịch PBS 0,01M theo bảng dưới. Bảng 2.4. Pha loãng mẫu thử nghiệm và kháng nguyên chuẩn Độ pha loãng Thể tích (µl) Mẫu đã xử lý với Zwittergent PBS 1,0 200 0 0,75 150