Luận văn Phân tích cấu trúc một số hợp chất trong cây an xoa (helicteres hirsuta l.) ở Việt Nam bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

hành đổ dung môi ngập dƣợc liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết. Để tăng cƣờng hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút dịch chiết ở dƣới rồi đổ lên trên. Có thể ngâm một lần hoặc nhiều lần. - Chiết bằng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một cách mãnh liệt- gây ra sự khuyếch tán vào trong dung môi của các chất 13 cần chiết xuất. Phƣơng pháp siêu âm hiệu quả hơn và nhanh hơn phƣơng pháp chiết xuất bằng ngâm lạnh nhƣng có nhƣợc điểm là chỉ áp dụng đƣợc với quy mô nhỏ. 1.4.2. Các phƣơng pháp sắc ký  Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dƣợc liệu vì đơn giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao. Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp phụ đƣợc lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, đƣợc trải mỏng đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển trên lớp mỏng theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, thu đƣợc một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 1.8). Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến giá trị Rf. Hình 1.8: Cách tính giá trị Rf  Các bƣớc trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình 1.9): Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng trƣớc khi dùng phải hoạt hóa trong tủ sấy và sấy ở 105-110°C trong một giờ. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm. Dùng bút chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đƣờng chấm chất phân tích (cách 14 mép dƣới của bản mỏng 1,2 cm), đƣờng giới hạn di chuyển của dung môi (cách mép trên của bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm). Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ, lƣợng chất phải đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng không quá nhỏ khó hiện vết bằng thuốc thử. Triển khai sắc ký: Bình triển khai thƣờng là bình thủy tinh, có nắp đậy kín và đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Đặt bản mỏng gần nhƣ thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi chạy đến đƣờng giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết. Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bƣớc sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là Ce(SO4)2). Hình 1.9: Các bƣớc tiến hành sắc ký bản mỏng Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, kích thƣớc 20×20 cm, dày 0,2 mm.  Phương pháp sắc ký cột (CC) Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh đƣợc nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh. Giống nhƣ sắc ký lớp mỏng, phƣơng pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong 15 quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất đƣợc sử dụng làm cột.  Kỹ thuật sắc ký cột (Hình 1.10): Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải đƣợc hoạt hóa ở 120°C trong 4 giờ trƣớc khi đƣa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc. Nhồi cột: Chất hấp phụ phải đƣợc phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách nhồi cột: nhồi khô và nhồi ƣớt với dung môi. Sau khi đƣa chất hấp phụ lên cột, rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không đƣợc để khô dung môi trong cột. Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đƣa chất lên cột sao cho chất phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đƣa chất lên cột: phƣơng pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lƣợng chất hấp phụ Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thƣờng hoặc áp xuất nén. Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích. Hình 1.10: Các bƣớc tiến hành sắc ký cột 1.4.3. Các phƣơng pháp phân tích xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc Quá trình xác định cấu trúc của một chất là một quá trình tập hợp và phân tích các dữ liệu từ nhiều nguồn khác nhau, mỗi nguồn cung cấp một số thông tin về cấu trúc của chất. Cấu trúc của chất đƣợc xác định phải phù hợp với tất 16 cả các thông tin cấu trúc từ các nguồn trên. Hiện nay, các phƣơng pháp phân tích cấu trúc hiện đại đã đƣợc sử dụng để xác định cấu trúc gồm có: các phƣơng pháp phổ hấp thụ nhƣ phổ tử ngoại (UV)/khả kiến (Vis) và phổ hồng ngoại (IR), các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lƣợng (MS). Ngoài ra, sự phát triển và ứng dụng các phƣơng pháp “ghép-nối" giữa sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các phƣơng pháp khác nhƣ HPLC-MS, HPLC-NMR, đã làm tăng tốc độ và độ nhạy của các phƣơng pháp xác định cấu trúc. Phƣơng pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phƣơng pháp phổ hiện đại. Tuy nhiên, phƣơng pháp phổ biến nhất là các phƣơng pháp đo phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC). 1.4.3.1. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ hồng ngoại IR (Infrared Spectroscopy) Phƣơng pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹ thuật phân tích rất hiệu quả, cung cấp thông tin nhanh về cấu trúc phân tử mà không đòi hỏi các phƣơng pháp tính toán phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lí là các phân tử khác nhau sẽ hấp thụ ở các vùng bức xạ khác nhau. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử ở trạng thái kích thích sẽ dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tƣơng ứng với các nhóm chức đặc trƣng và các liên kết có trong phân tử. Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng từ 10000 đến 100 cm-1 và biến thành năng lƣợng của dao động phân tử. Sự biến đổi năng lƣợng dao động này luôn đi kèm với sự biến đổi năng lƣợng quay. Sự hấp thụ này có định lƣợng và biểu hiện thành các dải hấp thụ với cƣờng độ khác nhau, gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR). Mỗi loại dao động hấp thụ ở một tần số hay độ dài sóng xác định, phụ thuộc vào khối lƣợng tƣơng đối của các nguyên tử, hằng số lực các dây nối và cấu trúc hình 17 học của nguyên tử. Do đó, phổ hồng ngoại cho phép xác định thông tin về cấu trúc hóa học nhƣ cấu dạng và nhóm chức đặc trƣng của hợp chất hữu cơ. Đơn vị trong phổ hồng ngoại là số sóng (cm-1). Sự hấp thụ có nhiều ý nghĩa trong việc ứng dụng phổ hồng ngoại để phân tích câu trúc các hợp chất hữu cơ là sự hấp thụ trong vùng 4000 – 660 cm-1 1.4.3.2. Phổ khối lượng MS (Mass spectrometry) Khối phổ là một trong các phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để xác định khối lƣợng phân tử của chất nghiên cứu. Cơ sở của phƣơng pháp này là sử dụng từ trƣờng và điện trƣờng để bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ thành ion phân tử hoặc các mảnh ion mang điện tích trong chân không. Phƣơng pháp MS khác với các phƣơng pháp phân tích phổ khác là nó không phụ thuộc vào độ hấp thụ của bức xạ điện từ mà dựa trên quá trình phân tử bị bắn phá bởi chùm electron mang năng lƣợng cao. Dƣới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi la ion mẹ) M+. Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa. Vì khối lƣợng của các electron rất nhỏ có thể bỏ qua, nên khối lƣợng của M + chính là khối lƣợng của phân tử. Dựa trên số khối của ion phân tử (M+) có thể xây dựng đƣợc công thức phân tử của hợp chất. 1.4.3.3. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance ), là một phƣơng pháp phân tích cấu trúc các hợp chất hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học. Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trƣng liên quan đến cấu trúc hóa học của 1 phân tử là độ dịch chuyển hóa học () và hằng số tƣơng tác spin – spin (J). 18 Phổ proton 1H-NMR Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hoá học () của các proton đƣợc xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hóa của các nguyên tử cũng nhƣ cấu trúc hoá học của phân tử. Mỗi loại proton cộng hƣởng ở một từ trƣờng khác nhau, vì vậy chúng đƣợc biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ chuyển dịch hoá học, diện tích pic cũng nhƣ tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất. Dựa vào những đặc trƣng của  và tƣơng tác J để có thể cung cấp các thông tin giúp xác định cấu trúc hóa học của hợp chất. Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng đƣợc tính bằng ppm nhƣng với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm). Ngoài ra phổ 13C còn đƣợc ghi theo phƣơng pháp DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phân loại các bậc carbon khác nhau. Trên phổ DEPT 135 không cho tín hiệu của carbon bậc 4, tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía, còn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện. Trên phổ DEPT 90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH. Kết hợp phổ 13C-NMR và phổ DEPT sẽ cho ta biết chính xác số carbon bậc 1, 2, 3, 4. Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence ) Phổ HSQC cho biết sự liên quan giữa các tín hiệu của 1H và 13C. Phổ HSQC cho biết thông tin về liên kết trực tiếp giữa proton và cacbon. Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) Đây là phổ thể hiện tƣơng tác xa (2 liên kết và 3 liên kết) giữa cacbon và proton trong phân tử và nhờ đó mà từng phần của phân tử cũng nhƣ toàn bộ phân tử đƣợc xác định. Phổ này đặc biệt thích hợp trong trƣờng hợp phân tử chứa cacbon bậc bốn vì nó thể hiện mối liên quan của tín hiệu proton 1H ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của 13C khác ở cách xa nó 2-3 liên kết thậm chí trong một số trƣờng hợp là bốn liên kết. Phổ COSY (Correlation spectroscopy) 19 Phổ COSY biểu diễn các tƣơng tác giữa proton – proton. Các proton tƣơng tác với nhau trong phổ COSY là các proton liên kết với cùng một cacbon hoặc với cacbon liền kề. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử đƣợc xác định. Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy) Phổ NOESY biểu diễn các tƣơng tác không gian của các proton không kể đến độ dài các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách không gian của chúng đƣợc phân bố trong phân tử (khoảng 4A0). Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử. 20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Mẫu lá, thân loài cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) đƣợc thu hái tại Thừa Thiên-Huế tháng 9 năm 2017. Mẫu tiêu bản ký hiệu là TRA020917. Tên khoa học của các loài thực vật này đƣợc PGS.TS Trần Thế Bách, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định. Các mẫu tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hình 2.1.Hình ảnh cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) thu hái tại Thừa Thiên-Huế 2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hóa chất, dụng cụ - Các dung môi: n-hexane, dichlomethane, ethyl acetate, acetone, ethanol, methanol...đều đƣợc cất trƣớc khi sử dụng. - Sắc ký lớp mỏng (TLC): đƣợc tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel (Merch) 60-F254 có độ dày 0,25mm. - Sắc ký cột (CC): sử dụng các chất hấp phụ gồm: silica gel (Merck), cỡ hạt 40-60 µm và Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), cỡ hạt 25-100 µm. Cột sắc ký có kích cỡ khác nhau. 21 - Thuốc hiện trong phân tích TLC: sắc ký lớp mỏng đƣợc quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại với bƣớc sóng 254nm và 365nm, và đƣợc hiện màu bằng thuốc thử ceri sulfat. 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Máy cô quay chân không Buchi 3120. - Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy melting point meter Buchi B545. - Phổ hồng ngoại đƣợc đo trên máy Spectrum Two PerkinElmer bằng phƣơng pháp viên nén KBr hoặc bao film. P - Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS) đƣợc đo trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC/MSD Agilen series 1100), sử dụng mode ESI và đầu dò DAD. - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) đƣợc ghi trên máy Bruker Avance 500,13 MHz spectrometer với TMS là chất nội chuẩn. Các thiết bị trên thuộc Viện Hóa học và Viện Hóa sinh biển- Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Xử lý mẫu thực vật Cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) sau khi thu hái đƣợc chia thành hai bộ phận riêng biệt là lá và thân cây. Từng bộ phận này đƣợc thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45o C, sau đó đem nghiền nhỏ riêng rẽ. 2.3.2. Điều chế các cặn chiết 3,2kg bột khô thân cây An xoa đƣợc ngâm chiết với ethanol 70o (2L/lần) bằng siêu âm ở 40-450C. Quá trình chiết đƣợc lặp lại 3-4 lần. Gộp chung dịch của 3 lần ngâm chiết và cất loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết ethanol tổng. Tiếp đó, hòa cao chiết tổng bằng dung dịch ethanol: H2O (1:1) và chiết phân bố lần lƣợt với dung môi n- hexane, ethyl acetate. Mỗi loại dung môi chiết 3 lần, mỗi lần sử dụng 500 ml dung môi. Gộp chung dịch chiết của các lần chiết và làm khô bằng Na2SO4 khan rồi cất loại dung môi dƣới áp suất giảm để thu đƣợc cặn cặn chiết tƣơng ứng gồm 22 cặn n- hexane (12g) và cặn ethyl acetate (40,5g). Phần dịch nƣớc còn lại đƣợc cất loại hết dung môi thu đƣợc cặn chiết nƣớc (45g). Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế các cặn chiết từ thân cây An xoa 2.3.3. Phƣơng pháp phân lập và phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên [35,36] Việc phân lập, tinh chế các hợp chất từ các cặn chiết đƣợc thực hiện bằng các phƣơng pháp kết tinh và sắc ký khác nhau nhƣ: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát, điều chế lƣợng nhỏ), sắc ký cột thƣờng (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck) và sephadex LH-20. Dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi nhƣ n-hexan/CH2Cl2, n-hexan/EtOAc, n-hexan/axetone, CH2Cl2/MeOH, với tỉ lệ thích hợp. Phƣơng pháp chung để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý nhƣ điểm nóng cháy, độ quay cực []D với các phƣơng pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS), các phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một 23 chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) đƣợc sử dụng để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất đƣợc phân lập). Phổ hồng ngoại (Infrared - IR) Phổ hồng ngoại cho phép nhận biết sự có mặt của các nhóm chức có trong phân tử hợp chất nghiên cứu, dựa vào cực đại hấp thụ đặc trƣng của các nhóm chức đó. Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS) Khối phổ là một trong các phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để xác định khối lƣợng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M] + , [M+H] +, từ đó giúp xây dựng công thức phân tử. Phân tích cấu trúc hợp chất bằng phổ khối lượng MS (Mass spectrometry) Phổ khối lƣợng dựa trên sự phân tách chất tƣơng ứng khối lƣợng phân tử và nguyên tử bằng cách sử dụng từ trƣờng và điện trƣờng để tác động lên các hạt tích điện (ion) trong chân không. Phổ khối không xác định trực tiếp khối lƣợng của ion mà xác định tỉ lệ giữa khối lƣợng (m) và điện tích (z) của ion (m/z). Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion thƣờng là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lƣợng của ion. Dƣới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi la ion mẹ) M+. Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa. Vì khối lƣợng của các electron rất nhỏ có thể bỏ qua, nên khối lƣợng của M+ chính là khối lƣợng của phân tử. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ NMR là phƣơng pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hƣởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi đƣợc đặt trong một từ trƣờng. Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trƣng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tƣơng tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo. Các hợp chất sau khi đƣợc tinh chế bằng các phƣơng pháp sắc kí sẽ đƣợc tiến hành đo phổ NMR. Trƣớc tiên, các hợp chất sẽ đƣợc đo phổ proton 24 1 H-NMR. Nếu chất đảm bảo đủ độ tinh khiết sẽ đƣợc tiến hành đo tiếp phổ cacbon 13 C-NMR và DEPT. Với những hợp chất có cấu trúc đơn giản, hay gặp có thể xác định đƣợc cấu trúc chỉ với số liệu cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT). Với các chất phức tạp hơn thì cần tiến hành đo thêm các phổ NMR hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ IR, phổ X-ray để cung cấp thêm thông tin cho việc xác định cấu trúc. Hợp chất sau khi đã đƣợc xác định cấu trúc bằng các phƣơng pháp phổ đã nêu sẽ đƣợc khẳng định công thức phân tử dựa trên kết quả phổ MS hoặc phổ HR- MS. 2.3.4. Chiết xuất, phân lập các hợp chất tự nhiên từ thân cây An xoa Tiến hành sắc ký cột silica gel cặn EtOAc (50g) với hệ dung môi n- Hexan/EtOAc gradien (100:0-0:100), thu đƣợc 12 phân đoạn chính, kí hiệu F1- F12. Từ phân đoạn F1(1,95g), sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/EtOAc gradien, thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ kí hiệu F1.1- F1.3. Tinh chế tiếp F1.2 (300mg) trên cột Sephadex LH-20 và cột silica gel (n- hexan/aceton) thu đƣợc hợp chất HH08 (11mg) và hợp chất HH06 (9mg). Phân đoạn F3 (2,5g) đƣợc tinh chế trên cột silica gel sử dụng hệ dung môi n- hexan/aceton gradient (95:5-0:100) thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ F3.1-F3.3. Hợp chất HH04 (12mg) thu đƣợc từ phân đoạn nhỏ F3.1 sau khi kết tinh trong axetone. Phân đoạn nhỏ F3.3 (450mg) đƣợc phân tách trên cột silica gel (n- hexan/aceton 93:7-0:100) thu đƣợc hợp chất HH07 (30mg). Phân đoạn F4(1,75g) đƣợc tinh chế trên cột sephadex LH-20 (hệ dung môi MeOH) thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ F4.1-F4.3. Tiếp tục tinh chế F4.3 bằng cột silica gel (diclometane/aceton 98:1-0:100) thu đƣợc hợp chất HH05 (15mg). Từ phân đoạn F6 (3,7g) tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ aceton gradient (0-100%) thu đƣợc 5 phân đoạn nhỏ ký hiệu F5.1-F5.5. Phân đoạn nhỏ F6.3 (700mg) đƣợc tinh chế trên cột sephadex LH-20 (hệ dung môi MeOH/diclometane: 9/1) thu đƣợc hợp chất HH02. Phân đoạn nhỏ F6.5 (900mg) đƣợc tinh chế trên cột sephadex LH-20 (hệ dung môi MeOH/diclometane: 9/1) sau đó rửa giải trong hệ dung môi aceton thu đƣợc hợp chất HH03. Phân đoạn F9 (3,8g) đƣợc phân tách trên cột silica gel với hệ 25 dung môi rửa giải là diclometan/methanol gradient (0-70%) thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ ký hiệu F9.1- F9.3. Phân đoạn nhỏ F9.3 tinh chế bằng sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan/aceton 8/2 thu đƣợc hợp chất HH01 (15mg). Sơ đồ 2.2: Sơ đồ điều chế các hợp chất từ cặn chiết EtOAc 2.4. DỮ KIỆN PHỔ VÀ HẰNG SỐ VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 2.4.1. Betulin (HH01) CẶN CHIẾT EtOAc Sephadex LH-20 và cột silica gel n-He/Aceton Điều chế bản mỏng hệ dm CH 2 Cl 2 /aceton 8/2 n-Hexan/EtOAc gradient (0:100-100:0) F1 1,95g F3 2,5g F4 1,75g F6 3,7g F9 3,8g F1.2 300mg n-He/EtOAc gradien HH08 11mg HH06 9mg n-He/Aceton gradient (95:5-0:100) F3.1 15mg F3.3 450mg Kết tinh trong Aceton HH04 12mg n-He/aceton 93:7-0:100 HH07 30mg sephadex LH-20 hệ dm MeOH F4.3 27.5mg CH 2 Cl 2 /aceton 98:1-0:100 HH05 15mg n-He/aceton gradient 0- 100 F6.3 700mg Sephadex LH-20 MeOH/CH 2 Cl 2 9/1 HH02 21mg F6.5 900mg Sephadex LH-20 hệ MeOH/CH 2 Cl 2 9/1 HH03 13mg CH 2 Cl 2 /MeOH gradient 0-70% F9.3 900mg HH01 15mg F1.1-F1.3 F3.1-F3.3 F4.1-F4.3 F6.1-F6.5 F9.1-F9.3 26 Bột vô định hình màu trắng, đnc. 251-252oC. ESI-MS: m/z 443 [M+H] + . C30H50O2 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ ppm 0,76 (3H, s, H-24-CH3), 0,83 (3H, s, H- 25-CH3), 0,97 (3H, s, H-23-CH3), 0,98 (3H, H-27-CH3), 1,02 (3H, s, H-26- CH3), 1,68 (3H, s, H-30-CH3), 2,38 (1H, dt, J= 5,5 và 11,0Hz, H-19), 3,18 (1H, dd, J 5,0 và 11,5 Hz, H-3), 3,33 (1H, d, H-28a), 3,79 (1H, dd, J= 1,5; 10,5Hz H-28b), 4,58 (1H, d, J= 2,0Hz, H-29a), 4,68 (1H, J= 2,0Hz, H-29b). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ ppm 14,77 (C-27); 15,35 (C-24); 16,0 (C- 25); 16,1 (C-26); 18,3 (C-6); 19,1 (C-30); 20,8 (C-11); 25,2 (C-12); 27,1 (C- 2); 27,4 (C-15); 28,0 (C-23); 29,2 (C-21); 29,8 (C-16); 34,0 (C-7); 34,2 (C- 10); 37,2 (C-22); 37,3 (C-13); 38,7 (C-1); 38,9 (C-4); 39,9 (C-8); 42,7 (C-14); 47,8 (C-19); 48,8 (C-18), 50,4 (C-9); 50,8 (C-17), 55,3 (C-5); 60,6 (C-28); 79,0 (C-3); 109,7 (C-29); 150,5(C-20). 2.4.2. Axit betulinic (HH02) Chất rắn màu trắng, đnc: 315-317oC ESI-MS: m/z 439 [M-H2O+H] + . C30H48O3 1 H-NMR (500,13 MHz, CD3OD): δH 0,78 (3H, s, H-25), 0,88 (3H, s, H-24), 0,98 (3H, s, H-26), 1,00 (3H, s, H-27); 1,03 (3H, s, H-23); 1,72 (3H, s, H- 30); 3,15 (1H, dd, J 5,0 và 11,5 Hz, H-3); 3,03 (1H, dt, J= 4,5 và 11,0Hz, H- 19); 4,61 (1H, dd, J 2,0 và 3,5 Hz, H-29); 4,73 (1H, br. d, J = 2,0 Hz, H- 29). 13 C-NMR (125,76 MHz, CD3OD): δ 15,1 (C-27); 16,0 (C-24); 16,6 (C-25); 16,7 (C-26); 19,5 (C-6); 19,6 (C-30); 22,1 (C-11); 27,0 (C-12); 28,1 (C-2); 28,6 (C-23); 30,9 (C-15); 31,8 (C-21); 33,4 (C-16); 35,7 (C-7); 38,1 (C-10); 38,4 (C-22); 39,8 (C-13); 40,0 (C-1); 40,2 (C-4); 42,1 (C-8); 43,7 (C-14); 27 49,8 (C-19); 50,7 (C-18), 52,1 (C-9); 57,0 (C-5); 57,5 (C-17); 79,8 (C-3); 110,0 (C-29); 152,0 (C-20); 180,0 (C-28, COOH). 2.4.3. Axit alphitolic (HH03) Chất rắn màu trắng, đnc: đnc: 276-278oC ESI-MS: m/z 473 [M+H] + . C30H48O4 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): 0,81 (3H, s, CH3-25), 0,94 (3H, s, CH3-24), 0,99 (3H, s, CH3-26), 1,01 (3H, s, CH3-27); 1,03 (3H, s, CH3-23); 1,72 (3H, s, H-30); 2,91 (1H, d, J=1,0 Hz, H-3); 3,03 (1H, dt, H-18); 3,63 (1H, dt, H- 2); 4,62 (1H, s, H-29); 4,73 (1H, br. d, J=2,0 Hz, H-29). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 15,1 (C-27), 16,6 (C-26), 17,2 (C-24), 17,8(C-25), 19,5 (C-6), 19,6 (C-30), 22,2 (C-11), 26,8 (C-12), 29,1 (C-21); 30,8 (C-15), 31,7 (C-16), 33,3 (C-7); 35,5 (C-22); 38,1 (C-13), 39,5 (C-10); 39,6 (C-8); 40,5 (C-4); 41,9 (C-14); 43,6 (C-1); 48,3 (C-2); 48,4 (C-24); 50,4 (C-18), 51,9 (C-19), 56,8 (C-9); 57,5 (C-5); 69,7 (C-17); 84,4 (C-3), 110,2 (C-29), 151,9 (C-20), 180,0 (C-28). 2.4.4. Axit oleanolic (HH04) Chất rắn màu trắng, đnc: !300oC ESI-MS (m/z): 457 [M+H] + ; C30H48O3 28 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3 & CD3OD): δH (ppm) 0,77 (3H, s, CH3), 0,80 (3H, s, CH3), 0,90 (3H, s, CH3), 0,92 (3H, s, CH3), 0,93 (3H, s, CH3), 0,97 (3H, s, CH3), 1,15 (3H, s, CH3), 2,84 (1H, dd, J= 4,0; 13.5 Hz, H-18), 3,17 (1H, dd, J= 5,0; 11,0 Hz, H-3), 5,26 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12). 13 C-NMR (125MHz, CD3OD): 39,3 (C-1); 27,4 (C-2); 79,3 (C-3); 39,4 (C-4); 56,2 (C-5); 19,1(C-6); 33,3 (C-7); 40,0 (C-8); 48,6 (C-9); 37,7 (C-10); 23,7 (C-11); 123,1 (C-12); 144,7 (C-13); 42,1(C-14); 28,4 (C-15); 24,1 (C-16); 47,2 (C-17); 42,5 (C-18); 46,7 (C-19); 31,2 (C-20); 34,6 (C-21); 33,5 (C-22); 28,5 (C-23); 15,7 (C-24); 16,1 (C-25); 17,4 (C-26); 26,4 (C-27); 181,6 (C- 28); 33,4 (C-29); 23,9 (C-30). 2.4.5. Hibiscolactone A (HH05) ESI-MS (m/z): 257 [M -H] - . C15H14O4