Luận văn Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của genoshkt 2; 4 ở lúa (oryza sativa)

năm loại cây lƣơng thực chính của thế giới, cùng với ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz) và khoai tây (Solanum tuberosum L.)[39]. Lúa thuộc bộ Poales, họ Poaceae, chi Oryza; ngƣời ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa, hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa đã đƣợc thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza glaberrima) [70,73]. Hình 1.1. Cây lúa (Oryza sativa) và các bộ phận của cây lúa [73] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 4 Lúa (Oryza sativa) có nguồn gốc tại khu vực xung quanh vùng Đông Nam Á; sau đó đƣợc nhân rộng và phân hóa thành hai nhóm sinh thái là Indica và Japonica. Japonica đƣợc trồng ở nơi khô ráo, mát mẻ của vùng cận nhiệt đới và ôn đới trong khi Indica đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới Châu Á. Hai nhóm sinh thái này đƣợc phân biệt bởi các đặc điểm về hình thái (Hình 1.1.), sinh lý và đặc điểm sinh thái; Indica có lá bản rộng và sáng hơn, cây cao và đẻ nhánh tốt, hạt dài mảnh, còn Japonica có lá hẹp và xanh đậm hơn, chiều cao cây thấp hơn và đẻ nhánh trung bình, hạt tròn ngắn. Lúa (Oryza sativa) có rất nhiều giống thích nghi với nhiều điều kiện môi trƣờngvà đƣợc gieo trồng làm cây lƣơng thực trên khắp thế giới [70].Với tầm quan trọng trong cung cấp lƣơng thực toàn cầu, việc nghiên cứu tăng năng suất của cây lúa đang ngày càng đƣợc chú trọng; nghiên cứu đáp ứng mặn ở cây lúa là một trong những hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng. 1.2. GIớI THIệU Về Họ PROTEIN VậN CHUYểN ION XUYÊN MÀNG HKT ở THựC VậT VÀ ở LÚA Đất nhiễm mặn là một trong những vấn đề thách thức nền nông nghiệp các quốc gia trên thế giới.Cây trồng bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi đất nhiễm mặn ở nồng độ muối cao [9]. Stress mặn ở thực vật có thể phân ra các giai đoạn gồm mất cân bằng thẩm thấu xảy ra ở giai đoạn sớm, gây độc do tích tụ ion Na+ và Cl-. Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính trong các cơ chế chống chịu với các stress do các nhân tố sinh học và phi sinh học gây ra (Hình 1.2.). Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K+ liên quan đến tính trạng chống chịu mặn [40;49], họ protein HKT có vai trò quan trọng trong sự chống chịu mặn ở thực vật [17;18;51]. Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 5 1.2.1. Họ protein HKT ở thực vật Schachtman và Schroeder là hai ngƣời đầu tiên đã phát hiện ra các protein HKT (High-affinity Potassium Transporters) chỉ có ở thực vật nhƣng có trình tự và chức năng tƣơng tự với lớp protein vận chuyển cation TrkH / TrkB ở vi khuẩn và nấm [56]. HKTs thuộc lớp các protein màng quan trọng (IMP), tham gia vào quá trình vận chuyển cation qua màng tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia vào khả năng chống chịu mặn ở thực vật [63]. HKT là nhân tố chính trong sự chống chịu mặn ở thực vật bằng cách loại bỏ Na+ khỏi xylem, giảm sự thẩm thấu của các ion theo gradien nồng độ [15;26;30]. Hình 1.2. Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp ứng stress mặn ở thực vật [75] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 6 Các nghiên cứu về chức năng đã chỉ ra rằng protein vận chuyển HKT có chức năng vận chuyển các cation hóa trị 1, với sự chọn lọc cation khác nhau giữa các thành viên cụ thể trong họ gen HKT [51;57]. Một số protein HKT có tính chọn lọc cao với Na+, trong khi một vài protein HKT có khả năng vận chuyển cả Na+ và K + ; thậm chí, một số protein HKT có thể thay đổi tính chọn lọc của nó tùy thuộc vào các ion trong môi trƣờng [57]. Bảng 1.1.Các protein họ HKT đã đƣợc nghiên cứu [57] Protein Loài Mã số AtHKT1;1 Arabidopsis thaliana Q84TI7.1 BdHKT1 Brachypodium distachyon XP_003560515.1 BdHKT4 Brachypodium distachyon XP_003581628.1 BdHKT6 Brachypodium distachyon XP_003570995.1 BdHKT8 Brachypodium distachyon XP_003564102.1 BdHKT9 Brachypodium distachyon XP_003563514.1 CaHKT1 Cochlearia anglica AFH37929.1 DfHKT Diplachne fusca AEM55592.1 EcHKT1;1 Eucalyptus camaldulensis AF176035_1 EcHKT1;2 Eucalyptus camaldulensis AF176036_1 EsHKT1 Eutrema salsugineum AFJ23835.1 GmHKT1 Glycine max XP_003540998.1 HbHKT Hordeum brevisubulatum AER42622.1 HvHKT1;5 Hordeum vulgare ABK58096.1 HvHKT4 Hordeum vulgare AEM44690.1 HvHKT2;1 Hordeum vulgare AEM55590.1 McHKT1;1 Mesembryanthemum crystallinum AF367366_1 McHKT1;2 Mesembryanthemum crystallinum AAO73474.1 MtHKT1;5 Medicago truncatula AES77170.1 OgHKT1 Oryza glumipatula ABD15858.1 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 7 OrHKT1 Oryza rufipogon AAY33540.1 OsHKT1;1 Oryza sativa Q7XPF8.2 OsHKT1;3 Oryza sativa Q6H501.1 OsHKT1;5 Oryza sativa A2WNZ9.2 OsHKT2;1 Oryza sativa A2YGP9.2 OsHKT2;2 Oryza sativa Q93XI5.1 OsHKT2;3 Oryza sativa Q8L481.1 OsHKT2;4 Oryza sativa Q8L4K5.1 PaHKT1 Phragmites australis BAE44384.1 PtHKT1 Populus trichocarpa EEF03794.1 PutHKT2;1 Puccinellia tenuiflora ACT21087.1 SbiHKT1;5 Sorghum bicolor EES02856.1 SbiHKT1;3 Sorghum bicolor EES04614.1 SbiHKT2;3 Sorghum bicolor EER90327.1 SbHKT1 Salicornia bigelovii ADG45565.1 SmHKT1 Selaginella moellendorffii EFJ18587.1 SsHKT1 Suaeda salsa AAS20529.2 TaHKT1;5-D Triticum aestivum ABG33949.1 TaHKT2;1 Triticum aestivum AAA52749 TaHKT1;5-B1 Triticum aestivum ABG33947.1 TaHKT1;5-B2 Triticum aestivum ABG33948.1 TmHKT1;5-A Triticum monococcum ABG33946.1 ThHKT1 Thellungiella halophila BAJ34563.1 VvHKT1 Vitis vinifera XP_002270986.1 VvHKT1;3 Vitis vinifera XP_002267717.1 ZmHKT1 Zea mays AEK27028.1 ScTRK1 Saccharomyces cerevisiae AAA34728 ScTRK2 Saccharomyces cerevisiae AAA35172 VpTrkH Vibrio parahaemolyticus Q87TN7.1 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 8 Dựa vào khả năng vận chuyển đặc hiệu ion, họ protein HKT đƣợc chia thành hai nhóm: nhóm vận chuyển chọn lọc với Na+ (nhóm I) và nhóm đồng vận chuyển Na + và K+ (nhóm II) [16;18;57]. 1.2.2. Họ protein HKT ở cây lúa Ở lúa (Oryza sativa), họprotein HKT cũng đƣợc chia ra hai nhóm và đƣợc mã hóa bởi 7 – 9 gen tùy theo các giống. Trong đó, họ protein HKT nhóm I đƣợc mã hóa bởi các genOsHKT1;1, OsHKT1;2, OsHKT1;3, OsHKT1;4, OsHKT1;5 và nhóm II đƣợc mã hóa bởi các genOsHKT2;1, OsHKT2;2, OsHKT 2;3, OsHKT2;4 [57]. OsHKT1;5 đƣợc xác định nằm trên locus định lƣợng SKC1 mã hóa cho một protein tham gia vào vận chuyển Na+, có chức năng quan trọng trong mô xylem, nhằm giúp thu hồi Na+ từ mạch gỗ, do đó làm giảm tích lũy Na+ trong thân bẹ của cây. OsHKT1;1 có thể đƣợc biểu hiện ở chồi và rễ. OsHKT1;3 chủ yếu biểu hiện ở thân lá, ít biểu hiện ở rễ [8;24;45;57]. OsHKT2;1 có mặt ở vỏ rễ, và có khả năng thu thập Na+ trong điều kiện thiếu K+, cung cấp ion nội mô [25;35;43;57]. Dƣới điều kiện mặn sự biểu hiện của gen này sẽ đƣợc điều hòa giảm hoạt động [35;61]. Protein OsHKT2;1 vận chuyển Na+ vào trong rễ, nhƣng hoạt động của nó bị giảm xuống ở những cây xử lý mặn 30mM NaCl, do đó làm giảm tích lũy Na+ gây độc cho cây [31]. Ngoài ra, OsHKT2;1 cũng đƣợc biểu hiện trong lá [23;35;44]. OsHKT2;2 có thể hoạt động đồng vận chuyển Na+ và K+ [64]. Cây lúa xử lý mặn ở 150 mM NaCl làm tăng cƣờng biểu hiện của gen này ở lá, đặc biệt là ở các tế bào diệp lục. Các gen OsHKT2;3 và OsHKT2;4 biểu hiện mạnh trong mô thân bẹ, ít biểu hiện ở rễ [25;29;33]. Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 9 Bảng 1.2. Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) [8;57] Gen Mã số Nucleotide Nhóm Mã số protein OsHKT1;1 AJ491816 Nhóm I CAD37183 OsHKT1;2 AJ506745 Nhóm I - OsHKT1;3 AJ491818 Nhóm I CAD37185 OsHKT1;4 AJ491853 Nhóm I CAD37197 OsHKT1;5 AK108663 Nhóm I BAB93392 OsHKT2;1 AB061311 Nhóm II BAB61789 OsHKT2;2 AB061313 Nhóm II BAB61791 OsHKT2;3 AJ491820 Nhóm II CAD37187 OsHKT2;4 AJ491855 Nhóm II CAD37199 1.2.3. GenOsHKT2;4 GenOsHKT2;4 nằm trên nhiễm sắc thế số 6, dài 1749 bp, trình tự mã hóa CDS dài 1530 bp mã hóa cho chuỗi 509 amino acid [1;2;74].Gen OsHKT2;4 ít biểu hiện ở rễ và bông con, chủ yếu đƣợc biểu hiện ở các mô lá, bẹ lá, các chồi phân sinh. Gen OsHKT2;4 thuộc nhóm II họ gen HKT, quy định các protein đồng vận chuyển Na+ và K+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na+ khi ion này ở nồng độ cao [31;32]. Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 10 Hình 1.3. GenOsHKT2;4 trên cơ sở dữ liệu Phytozome [74] 1.2.4. Tình hình nghiên cứu họ genOsHKT Hiện nay, một số thành viên trong họ gen OsHKT đã đƣợc nghiên cứu ở các giống lúa Việt Nam: Đa hình của gen OsHKT1 (OsHKT2;1) trong công bố năm 2016 của Hoa và cộng sự (Pham Quynh Hoa, Rice Science 23:334-338); đa hình của gen OsHKT1;2 công bố năm 2016 của Phúc và cộng sự (Đỗ Thị Phúc, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 32: 189-193); đa hình của gen OsHKT1;4 công bố năm 2015 của Hoa (Đặng Ngọc Hoa, Tạp chí Khoa học, ĐHQGHN, số 31, 129-135); nghiên cứu mức độ biểu hiện của OsHKT2;1 công bố năm 2016 của Phúc và cộng sự (Đỗ Thị Phúc, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 2, 54-58) [66-69]. Trên thế giới có một số nghiên cứu về gen OsHKT2;4 nhằm đánh giá về mối liên hệ của gen này và các quá trình đáp ứng stress mặn ở lúa. Nổi bật là các nghiên cứu của T. Horie và các cộng sự tại Đại học Shinshu, Nhật Bản. Trong nghiên cứu công bố năm 2011[32], tác giả đã phân tích khả năng vận chuyển chọn lọc cation của OsHKT2;4, OsHKT2;4 thể hiện cách thức chọn lọc và vận chuyển ion K+ và Na + tƣơng đối khác biệt so với các protein vận chuyển HKT khác. Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 11 Tác giả đã mô tả sự chọn lọc ion của nhóm II họ gen HKT thông qua protein vận chuyển của lúa OsHKT2;4 biểu hiện trên nấm men và trên trứng ếch châu Phi (Xenopus laevis). Ở nấm men đột biến làm giảm khả năng hấp thụ K+, OsHKT2;4 đã khắc phục đƣợc khiếm khuyết trong phát triển của nấm men. Ở tế bào trứng ếch,OsHKT2;4 biểu hiện khiến các tế bào trứng có khả năng thẩm thấu K+ mạnh mẽ. Tuy nhiên các tế bào trứng biểu hiện OsHKT2;4 thẩm thấu K+ không yêu cầu sự kích thích ngoại bào bởi Na+, điều này không giống với các protein vận chuyển HKT lớp II khác. Hơn nữa, OsHKT2;4 thể hiện khả năng thẩm thấu cả Mg2+ và Ca 2+ khi không có sự cạnh tranh của ion K+, nhƣng khả năng thẩm thấu các cation hóa trị 2 là không đáng kể khi có mặt K+. Điều này chứng tỏ OsHKT2;4 giống với một kênh vận chuyển K+ chuyên biệt, không phụ thuộc vào ion Na+, khác với các kênh vận chuyển HKT nhóm II khác, vốn là kênh đồng vận chuyển ion K+/Na+ [32]. Hiện nay chƣa có nghiên cứu về gen OsHKT2;4 thực hiện trên các giống lúa Việt Nam. Do đó những thông tin về đa hình hay mức độ biểu hiện của gen OsHKT2;4để phục vụ cho nghiên cứu chọn giống lúa ở Việt Nam còn rất hạn chế. 1.3. MộT Số PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CứU ĐA HÌNH NUCLEOTIDE 1.3.1. Phƣơng pháp RFLP-PCR Phƣơng pháp RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism- Polymerase Chain Reaction) sử dụng kỹ thuật phát triển trên cơ sở phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA. 1.3.1.1. Phản ứng PCR PCR là phƣơng pháp đƣợc xây dựng bởi Kary Mullis vào những năm 1980. Phản ứng đƣợc thực hiện dựa trên khả năng tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với trình tự khuôn DNA ban đầu của DNA polymerase. Enzyme này chỉ có khả năng kéo dài mạch nhờ gắn thêm một nucleotide vào nhóm chức3’-OH tự do của Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 12 nucleotide trƣớc đó, do đó nó cần có trình tự mồi chứa đầu 3’- OH tự do để thực hiện kéo dài chuỗi. Điều này dẫn đến sự đặc hiệu của phản ứng PCR trong việc khuếch đại một vùng DNA mong muốn bằng cách thiết kế mồi đặc hiệu. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bằng máy gia nhiệt, giúp tăng giảm chính xác nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng một cách nhanh chóng tại các khoảng thời gian xác định ở mỗi chu kỳ. Đầu tiên, hai sợi của phân tử DNA kép phải đƣợc tách ra để cho phép các cặp mồi bám vào khuôn, đƣợc gọi là giai đoạn biến tính DNA (94OC – 98 OC). Sau khi tách sợi, nhiệt độ đƣợc làm giảm đến nhiệt độ gắn mồi, cho phép mồi xuôi và mồi ngƣợc liên kết với các sợi DNA đơn. Tùy vào mục đích nghiên cứu, cặp mồi có thể đƣợc thiết kế gắn ngẫu nhiên hay gắn đặc hiệu dựa trên trình tự của vùng DNA quan tâm. Tiếp theo enzyme DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA mới từ mỗi sợi đơn theo chiều 5’ - 3’ ở nhiệt độ kéo dài chuỗi (72 OC).Quá trình này đƣợc lặp lại sau khoảng 25 - 40 chu kỳ. Phản ứng có thể tổng hợp đƣợc rất nhiều bản sao của trình tự gen mong muốn chỉ trong thời gian vài giờ [72]. Ở nhiệt độ biến tính DNA (khoảng 95OC), các polymerase của đa số sinh vật đều bị phân giải và mất hoạt tính; vì vậy enzyme sử dụng cho phản ứng PCR cần là enzyme chịu nhiệt. Ngƣời ta đã phân lập đƣợc một số vi khuẩn phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao, có thể lên tới 100OC, nhƣ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aqaticus và tách đƣợc polymerase của vi khuẩn này (Taq polymerase). Việc tìm ra enzyme chịu nhiệt đã mở ra bƣớc tiến quan trọng cho phản ứng PCR và các kỹ thuật ứng dụng phản ứng PCR trong xét nghiệm chẩn đoán và nghiên cứu phân tử. Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 13 1.3.1.2. RFLP-PCR RPLP-PCR là phƣơng pháp phát triển trên cơ sở phản ứng PCR thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền. Phƣơng pháp sử dụng phản ứng PCR nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA, sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA bằng enzyme cắt giới hạn. Đa hình di truyền của các mẫu DNA đƣợc phân tích dựa trên sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sản phẩm cắt bằng enzyme cắt giới hạn [72].Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sẽ cho biết sự đa hình đoạn DNA phân tích. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là ít tốn kém, thao tác đơn giản, dễ thực hiện, có thể ứng dụng trong phân tích đa hình đơn nucleotide. Tuy nhiên, nhƣợc điểm là không xác định đƣợc chính xác trình tự gen, trình tự và vị trí đa hình. Mỗi enzyme Hình 1.4.Phƣơng pháp RFLP-PCR sử dụng trong nghiên cứu di truyền phân tử [79] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 14 giới hạn thƣờng chỉ nhận biết và cắt tại một trình tự đặc hiệu nên sẽ khó có thể phân tích đƣợc các gencó tính đa hình cao, do đó phƣơng pháp không thích hợp cho phân tích các gen có mức độ đa hình cao, đòi hỏi sử dụng nhiều enzyme cắt. 1.3.2. Phƣơng pháp giải trình tự Kỹ thuật giải trình tự là một trong những công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu di truyền phân tử. Từ phƣơng pháp giải trình tự đầu tiên của Sanger, đến nay các phƣơng pháp giải trình tự ngày càng đƣợc phát triển để đáp ứng với yêu cầu về độ chính xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao [73]. Phƣơng pháp giải trình tự DNA đầu tiên đƣợc mô tả bởi Sanger và Coulson đƣợc gọi là phƣơng pháp “cộng và trừ” [54]. Phƣơng pháp này sử dụng DNA polymerase từ vi khuẩn Escherichia coli và bacteriophage T4 với các nucleoside triphosphate khác nhau [19;20]. Sản phẩm tạo ra bởi các polymerase đƣợc điện di trên gel acrylamide. Do sự không hiệu quả của phƣơng pháp này, nên 2 năm sau đó ông và cộng sự đã mô tả một phƣơng pháp mới mang tính đột phá, giải trình tự các oligonucleotide thông qua chuỗi trùng hợp bằng enzyme [55]. Hình 1.5. Kỹ thuật giải trình tự bằng phƣơng pháp Sanger cải biến[76] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 15 Phƣơng pháp này đã mở ra cuộc cách mạng trong lĩnh vực gen và đƣợc biết đến nhƣ phƣơng pháp Sanger hay phƣơng pháp dideoxynucleotide. Bao gồm một enzyme xúc tác phản ứng trùng hợp các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) bổ sung với các mẫu DNA quan tâm. Phản ứng sẽ đƣợc kéo dài cho đến khi các enzyme kết hợp một dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) đƣợc đánh dấu vào chuỗi đang tổng hợp. Do các ddNTP không chứa nhóm 3’ - OH nên enzym sẽ không thể xúc tác gắn thêm nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết thúc. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 4 ống khác nhau, mỗi ống ngoài thành phần của phản ứng PCR thông thƣờng sẽ chứa một loại ddNTP đƣợc đánh dấu. Sau quá trình tổng hợp, sản phẩm gồm hỗn hợp các DNA kích thƣớc khác nhau đƣợc điện di trên gel polyacrylamide biến tính theo 4 đƣờng chạy song song và đƣợc đọc bằng phóng xạ tự ghi. Các phƣơng pháp giải trình tự bằng enzyme khác cũng đƣợc sử dụng để xác định trình tự các đoạn nucleotide trong nghiên cứu di truyền [27]. Vào năm 1977, hai nhà khoa học ngƣời Mỹ Allan Maxam và Walter Gilbert đã phát minh ra một phƣơng pháp hóa học có thể xác định đƣợc trình tự các nucleotide trongchuỗi DNA. Theo phƣơng pháp này, trƣớc hết phân tử DNA đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’, tạo ra những đoạn có thể đƣợc phát hiện bằng hình ảnh phóng xạ. Sau đó các nucleotide trong phân tử DNA đƣợc đánh dấu sẽ đƣợc xử lý với các hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt phân tử DNA tại những vị trí nucleotide khác nhau. Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C, và C. Kết quả sẽ tạo thành những đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1 base [41]. Các đoạn này đƣợc điện di trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy phóng xạ tự ghi, huỳnh quang hay các phản ứng màu nhờ enzyme [4;53]. Tổng hợp các kết quả, ta thu đƣợc trình tự các nucleotide trên mạch đơn DNA, từ đó ta biết đƣợc trình tự sắp xếp các nucleotide của gen. Ngày nay, việc giải trình tự đƣợc thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của máy giải trình tự tự động. Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP không đƣợc đánh dấu phóng Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 16 xạ mà đƣợc đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính nhƣ: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ đƣợc phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G [73]. 1.4. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MứC Độ BIểU HIệN CủA GEN 1.4.1. Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ Phƣơng pháp lai Northern blot đƣợc ra đời vào năm 1977, là một kĩ thuật đƣợc sử dụng để phát hiện và định lƣợng các phân tử RNA cụ thể trong một hỗn hợp các RNA. Northern blot đƣợc ứng dụng để phân tích các mẫu RNA từ một mô hay tế bào cụ thể để định lƣợng mức độ biểu hiện của những gen quan tâm. Phƣơng pháp Northern blot sử dụng mẫu RNA đã đƣợc biến tính thành các sợi đơn. Các phân tử RNA này sau đó đƣợc phân tách theo kích thƣớc nhờ điện di. Sau khi điện di, RNA trên các băng đƣợc chuyển lên màng thấm. Các màng thấm này sẽ đƣợc lai với các mẫu đầu dò đƣợc thiết kế sẵn, có trình tự bổ sung với chuỗi RNA quan tâm trong mẫu. Các đầu dò đƣợc phát hiện và định lƣợng nhờ đƣợc gắn các nhãn phóng xạ nhờ đó xác định đƣợc kích thƣớc và nồng độ của phân tử RNA quan tâm [34]. Cùng với sự phát triển của khoa học, các cải tiến trong lai Northern blot cũng đƣợc ra đời. Tiêu biểu là việc sử dụng huỳnh quang thay thế cho các nhãn phóng xạ. Ƣu điểm của huỳnh quang là an toàn, ít đòi hỏi các thiết bị máy móc phức tạp nhƣ sử dụng nhãn phóng xạ [78]. Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 17 Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ là phƣơng pháp mạnh mẽ nhằm định tính và bán định lƣợng mức độ biểu hiện gen; phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền phân tử. Tuy nhiên lai Northern blot đòi hỏi một lƣợng mẫu tƣơng đối lớn, do đó phƣơng pháp khó áp dụng cho các trƣờng hợp gen có mức độ biểu hiện thấp hay mức chênh lệch biểu hiện giữa các giống là tƣơng đối nhỏ. 1.4.2. RT-PCR và Real-time PCR Phƣơng pháp RT-PCR và Real-time PCR phát triển từ phản ứng PCR cơ bản nhằm phân tích và định lƣợng chuỗi RNA quan tâm một cách đặc hiệu. Với ƣu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, thời gian thực hiện ngắn, đặc hiệu và độ nhạy cao, có thể phân tích với lƣợng mẫu rất nhỏ, phƣơng pháp RT-PCR và Real-time PCR đang ngày càng phổ biến và phát triển trong nghiên cứu di truyền phân tử [3]. Hình 1.6. Các bƣớc cơ bản trong phƣơng pháp Northern blot [78] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 18 Phản ứng RT-PCR đƣợc sử dụng để phát hiện sự biểu hiện của gen thông qua quá trình tổng hợp cDNA từ RNA bằng enzyme phiên mã ngƣợc. cDNA sau đó đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Sản phẩm của RT-PCR có thể đƣợc định lƣợng nhờ điện di trên gel agarose sau khi chạy phản ứng PCR hoặc sử dụng phản ứng Real-time PCR. Real-time PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sản phẩm khuếch đại ngay khi phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đánh dấu huỳnh quang, nồng độ sản phẩm đƣợc phân tích dựa trên cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang, từ đó tính toán đƣợc nồng độ khuôn ban đầu [3;70]. Real-time PCR cho phép định lƣợng nồng độ sản phẩm và nồng độ khuôn với độ chính xác và độ nhạy cao. Phƣơng pháp Real-time PCR có thời gian thực hiện ngắn với ít thao tác thí nghiệm, nhờ đó tránh đƣợc hiện tƣợng nhiễm hay suy thoái mẫu so với sử dụng phản ứng RT-PCR. Nhờ những đặc điểm ƣu việt, Real- time PCR đƣợc xem là một công cụ mạnh mẽ trong định tính và định lƣợng các mẫu sinh học phân học phân tử [10;22]. Hình 1.7. Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR [77] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 19 1.4.3. Các phƣơng pháp sử dụng chip Phƣơng pháp sử dụng chip Microarray là những phƣơng pháp dựa trên nguyên tắc lai phân tử, trong đó các đoạn đầu dò mang chỉ thị đƣợc gắn lên bề mặt rắn bằng các liên kết hóa học. Các dạng phân tử quan tâm sẽ đƣợc chạy qua giá thể gắn đầu dò. Quá trình lai phân tử diễn ra một cách đặc hiệu giữa đầu dò và phân tử cần quan tâm, nhờ các chỉ thị nhƣ phóng xạ hay huỳnh quang gắn trên đầu dò, ngƣời ta xác định đƣợc chính xác vị trí và trình tự của phân tử. Phƣơng pháp này có thể thực hiện để định tính và định lƣợng cùng lúc nhiều gen trong một thời gian ngắn, với hiệu quả và độ nhạy rất cao. Tuy nhiên phƣơng pháp này đòi hỏi hệ thống máy móc phức tạp cùng chi phí vận hành cao [71]. Hình 1.8. Sử dụng chip Microarray trong phân tích biểu hiện [71] Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh 1. Ali S., Delphine M., Imran K., Bertrand M., Isabelle G., (2012), “The Rice Monovalent Cation Transporter OsHKT2;4: Revisited Inonic Selectivity”, Plant Physiology, 160, pp. 498-510. 2. Albright R. A., Joh K., Morais-Cabral J. H. (2007) “Probing the structure of thedimeric KtrB membrane protein”,J Biol Chem 282, pp. 35046–35055. 3. Alwine J. C., Kemp D. J., Stark G. R., (1977), “Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 74 (12),pp. 5350-5354. 4. Ansorge W., Rosenthal, A., Sproat B., Schwager C., Stegemann J., Voss H. (1988),“Nonradioactive automated sequencing of oligonucleotides by chemical degradation”, Nucleic Acids Res., 16, pp. 2203-2206. 5. Apse M. P., Aharon G. S., Snedden W. A., Blumwald E. (1999), “Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na + /H + antiport in Arabidopsis”. Science 285, pp. 1256–1258. 6. Barish M. E. (1983) “A transient calcium-dependent chloride current in the immature Xenopus oocyte”, J Physiol 342, pp. 309–325. 7. Bassil E., (2011), “The Arabidopsis intracellular Na+/H+ antiporters NHX5 and NHX6 are endosome associated and necessary for plant growth and development”, Plant Cell, 23, pp. 224-239. 8. Ben A. S., Brini F., Sentenac H., Masmoudi K., Véry A. A. (2014), “Functional characterization in Xenopus oocytes of Na+ transport systems from durum wheat reveals diversity among two HKT1;4 transporters”. J Exp Bot. 65(1), pp. 213–222. 9. Boyer J. S., (1982)“Plant productivity and environment”, Science, 218, pp. 443-451. 10. Bustin S. A., Benes V., Nolan T., Pfaffl M. W. (2005), “Quantitative real-time RT-PCR a perspective”. J. Mol. Endocrinol. 34 (3),pp. 597-601. Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Tiến Đạt QH.2014.T.CH - 60420121 52 11. Byrt C. S., Platten J. D., Spielmeyer W., James R. A., Lagudah E. S., Dennis E. S.,Tester M., Munns R. (2007),“HKT1;5-like cation transporters linkedto Na + exclusion loci in wheat, Nax2 and Kna1”. Plant Physiol 143, pp. 1918–1928. 12. Børresen A. L. (2002), “Mismatch detection using heteroduplex analysis”, Curr Protoc Hum Genet, 7(3). 13. Chauhan S., Forsthoefel N.